Summary
Denne protokollen presenterer et optimalisert frittliggende bladbioassay-system for å evaluere effektiviteten av entomopatogene sopp (EPF) mot sennepsbladlusen (Lipaphis erysimi (Kalt.)), et parthenogenetisk insekt. Metoden skisserer datainnsamlingsprosessen under petriskåleksperimenter, slik at forskere konsekvent kan måle virulensen av EPF mot sennepsbladlus og andre parthenogenetiske insekter.
Abstract
Sennepsbladlusen (L. erysimi) er et som infiserer ulike cruciferous avlinger og overfører plantevirus. For å oppnå miljøvennlig skadedyrsbekjempelse er entomopatogene sopp (EPF) potensielle mikrobielle kontrollmidler for å kontrollere dette. Derfor er virulensscreening av EPF-isolater under petriskålforhold nødvendig før feltpåføring. Imidlertid er sennepsbladlusen et parthenogenetisk insekt, noe som gjør det vanskelig å registrere data under petriskåleksperimenter. Et modifisert system for frittliggende bladbioassays ble utviklet for å løse dette problemet, ved hjelp av en mikrosprøyte for å inokulere konidier på bladlus og forhindre drukning ved å lette lufttørking etter sporesuspensjon. Systemet opprettholdt høy relativ luftfuktighet gjennom hele observasjonsperioden, og bladskiven holdt seg frisk i over ti dager, noe som tillot partenogenetisk reproduksjon av bladlusene. For å forhindre avkomoppbygging ble det gjennomført en prosess med daglig fjerning ved hjelp av en pensel. Denne protokollen demonstrerer et stabilt system for evaluering av virulensen av EPF-isolater mot sennepsbladlus eller andre bladlus, noe som gjør det mulig å velge potensielle isolater for bladluskontroll.
Introduction
Sennepsbladlusen (L. erysimi) er et beryktet som infiserer en rekke cruciferous avlinger, noe som forårsaker betydelige økonomiske tap1. Mens flere systematiske insektmidler har blitt anbefalt for å bekjempe bladlusangrep, gir hyppig bruk av disse insektmidler bekymringer om plantevernmiddelresistens 2,3. Derfor, når det gjelder miljøvennlig skadedyrsbekjempelse, kan entomopatogene sopp (EPF) tjene som en egnet alternativ kontrollstrategi. EPF er et insektpatogen med evnen til å infisere verter ved å trenge inn i neglebåndene, noe som gjør det til et kraftig middel for å kontrollere bladlus og andre plantesugende insekter4. Videre har EPF vist seg å være en gjennomførbar og bærekraftig skadedyrsbekjempelsesteknikk, og tilbyr fordeler som plantepatogenantagonisme og plantevekstfremmende5.
EPF kan oppnås gjennom insekt-jord baiting eller isolert fra insektkadavre i feltet 6,7. Men før videre bruk av soppisolater, er patogenicitet screening nødvendig. Flere studier har blitt utført på effektiviteten av EPF mot bladlus, som er betydelige som kan forårsake alvorlig skade 8,9. Sennepsbladlus, blant forskjellige arter av bladlus, har blitt testet for følsomhet for flere stammer av Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., og til og med Alternaria, som primært er kjent som en saprofytisk og plantepatogen sopp, men har vist noen dødelige effekter mot sennepsbladlus10,11,12.
For å evaluere effektiviteten av EPF mot bladlus under laboratorieforhold, kan bioassays deles inn i to hoveddeler: inokulasjonskammeret og soppinokulering. Den nåværende protokollen beskriver konstruksjonen av et inokulasjonskammer, hvor bladlus kan opprettholdes ved hjelp av forskjellige metoder som et utskåret blad med en petiole innpakket i fuktig bomull, en utskåret bladskive med en petriskål foret med dempet filterpapir, direkte vedlikehold på potteplanter eller en utskåret bladskive innebygd i vannagar i en petriskål eller beholder10, 11,13. Vanlige metoder for soppinokulering inkluderer conidia-sprøyting, bladlusnedsenking i en conidia-suspensjon, bladdypping i en conidia-suspensjon og planteendofyttinokulering11,14,15,16. Mens ulike inokulasjonsmetoder eksisterer, bør bioassayene simulere feltapplikasjonsforhold. For eksempel, når det gjelder bladdyppet metode12,17, kan effektiviteten av EPF evalueres, men siden bladlusene angriper de soppbelastede bladene, blir den dorsale siden av bladlusen, som er et fortrinnsvis penetrasjonssted, vanligvis ikke utsatt for soppen.
For å evaluere den aphidicide effekten av EPF under laboratorieforhold, foreslår denne protokollen å bruke frittliggende bladmetode beskrevet av Yokomi og Gottwald18 med noen modifikasjoner, etterfulgt av konidia-inokulering ved bruk av en mikrosprøyter. Denne metoden opprettholder omtrent 100% fuktighet i bioassaykammeret i minst syv dager uten å kreve ytterligere etterfylling av vann18,19. I tillegg sikrer begrensning av bladlus til en overflate deres eksponering for conidia-sprøyting og letter observasjoner20. Imidlertid kan bladlus bli sittende fast i den eksponerte agaroverflaten mens de beveger seg i inokulasjonskammeret. Videre kan registrering av data i petriskåleksperimentet med sennepsbladlus, som er parthenogenetiske insekter, være utfordrende på grunn av deres raske utvikling og reproduksjon. Det er vanskelig å skille mellom inokulerte voksne og deres avkom uten fjerning. Detaljene om hvordan du går frem med dette trinnet blir sjelden nevnt, og noen inkonsekvente faktorer, for eksempel bladforbruksområdet, må optimaliseres.
Denne protokollen demonstrerer et stabilt system for screening av virulensen av EPF-isolater mot sennepsbladlus, noe som gjør det mulig å velge potensielle isolater mot forskjellige bladlusarter fra et omfattende EPF-bibliotek. Feltsamlet bladlus kan identifiseres, og en tilstrekkelig laboratoriepopulasjon av sennepsbladlus kan etableres for å evaluere den afhidicide effekten av forskjellige soppisolater ved hjelp av en enkel og gjennomførbar metodikk med konsistente resultater. Bladlus har utviklet flere evolusjonære mekanismer som svar på intenst og gjentatt menneskeskapt press i agroøkosystemer, noe som utgjør utfordringer for matsikkerhet9. Derfor kan denne beskrevne metoden utvides til å evaluere potensielle EPF-isolater mot forskjellige bladlusarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Det komplette flytskjemaet er vist i figur 1.
1. Sennep bladlus samling og vedlikehold
- Samling av sennepsbladlus
- Vend bladene og se visuelt etter angrep av sennepsbladlus på cruciferous avlinger i feltet.
- Registrer prøvetakingsstedinformasjonen (dvs. GPS) og vertsplante (er), og bekreft historien om insektmiddelapplikasjoner med bøndene.
- Bruk en insektskonspirator eller en fin pensel (se materialfortegnelse) for å samle ca. 50 sennepsbladlus i et 50 ml sentrifugerør fra cruciferous avlinger i feltet og ta prøven til laboratoriet innen 3 timer.
- Forbered en midlertidig vedlikeholdspetriskål med utskårne cruciferous blader og vanninfiltrert filterpapir nederst.
- Plasser de fem bladlusene på petriskålen for midlertidig vedlikehold under romtemperatur (25 ± 2 °C) med en relativ luftfuktighet på 70 % og fotoperiode på 12:12 timer (lys:mørk) i 14 dager for å bekrefte at bladlusen sparer naturlig fiendefri før videre oppdrett.
MERK: For å sikre at feltinnsamlet bladlus er fri for naturlige fiender som parasitoidveps eller entomopatogene sopp, er det viktig å bekrefte fraværet av disse organismene før du fortsetter med videre oppdrett.
- Vedlikehold av sennepsbladlus
MERK: For å opprettholde sennepsbladlus, bruk plantevernmiddelfrie (inkludert biopesticid) cruciferous blader.- Gi en stabil og tilstrekkelig tilførsel av cruciferous blader (ca. 25 cm2).
MERK: Få cruciferous bladene enten fra markedet eller vokse plantene. Før langvarig, massiv oppdrett av sennepsbladlus, kunne flere forskjellige typer crucifer testes for å finne en passende crucifer. Når arten av cruciferous bladet er løst, må du ikke endre den. I denne studien ble Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) på 6-7-bladstadiet brukt (se materialtabell). I tillegg kaster du de 2-3 eldste bladene. - Tilsett vann før filterpapiret i bunnen er helt tørt.
- Vær oppmerksom på befolkningstettheten av sennepsbladlusene daglig. Befolkningen skal vokse til 2-3 ganger etter 7 dager.
- Når antall bladlus øker, kutt de opprinnelig utskårne bladene med sennepsbladlus i 4-6 mindre biter og legg hvert lite bladstykke med sennepsbladlus i en petriskål med ferskt utskåret blad og vanninfiltrert filterpapir.
- Legg petriskålen i en rugemaskin ved 25 °C med 12:12 h (lys:mørk) fotoperiode og observer populasjonstettheten av sennepsbladlus daglig.
- Fjern de opprinnelige utskårne bladene etter at de fleste bladlusene migrerer til friske utskårne blader før de opprinnelige bladene råtner.
- Gi en stabil og tilstrekkelig tilførsel av cruciferous blader (ca. 25 cm2).
2. Molekylær identifikasjon av sennepsbladlus
MERK: For å bekrefte arten av feltoppsamlet sennepsbladlus ble molekylær identifikasjon utført ved hjelp av to molekylære markører: sekvenskarakterisert amplifisert region (SCAR) basert A05Le designet av Lu et al.21, og sennepsbladlus cytokrom oksidase subenhet 1 (COI) -regionen av sennepsbladlusen.
- Ekstraksjon av sennepsbladlusgenomisk DNA
- Samle ca. 50 bladlus i et 1,5 ml sentrifugerør.
MERK: Bladlus som brukes til molekylær identifikasjon bør være etterkommere av en enkelt bladlus, og ulike stadier kan også samles i samme rør for DNA-ekstraksjon. - Homogeniser bladlusene med en pelletspestel og trekk ut DNA ved hjelp av Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell).
- Elute det genomiske DNA med 50 μL forvarmet nukleasefritt vann.
- Samle ca. 50 bladlus i et 1,5 ml sentrifugerør.
- PCR-amplifisering og DNA-sekvensering
- Forsterke mål-DNA-sekvensene fra bladlusgenomisk DNA ved hjelp av PCR Master Mix (2x) med primerparene A05LeF/A05LeR og LeCO1F/LeCO1R (tabell 1) med ulike PCR-programmer21.
MERK: PCR-reaksjonen med et totalvolum på 20 μL består av 2 μL bladlusgenomisk DNA-mal, 1 μL fremover og 1 μL reverserte primere, 10 μL PCR Master Mix (se materialtabell) og 6 μL ddH2O. - Utfør PCR i en termisk syklist (se materialfortegnelse) med følgende program: 94 °C i 5 minutter, 25 sykluser på 94 °C i 45 s, 61 °C (for A05LeF/A05LeR) og 58 °C (for LeCO1F/LeCO1R) i 45 s, 72 °C i 1 min, etterfulgt av en endelig forlengelse på 72 °C i 5 minutter.
- Analyser PCR-produktet ved 1% agarosegelelektroforese for å bekrefte identiteten til sennepsbladlusen (figur 2).
MERK: Hvis primerparet A05LeF / A05LeR vellykket forsterker riktig størrelse på DNA-fragmentet, har det overbevisende identifisert den feltoppsamlede bladlusen som sennepsbladlus21. Primerparene er listet opp i tabell 2. - Rens PCR-produktet av sennepsbladlus COI-amplikon ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig gel / PCR-sett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse), og sekvenser PCR-produktet ved hjelp av en kommersiell sekvenseringstjeneste.
- Forsterke mål-DNA-sekvensene fra bladlusgenomisk DNA ved hjelp av PCR Master Mix (2x) med primerparene A05LeF/A05LeR og LeCO1F/LeCO1R (tabell 1) med ulike PCR-programmer21.
- Sekvens analyse
MERK: Ifølge Lu et al.21 er DNA-bøyningen av A05Le et sennepsbladlusspesifikt DNA-fragment; Derfor trenger ikke A05Le PCR-produktet å sekvenseres ytterligere.- Kontroller lesekvaliteten med Chromas programvare (se Materialfortegnelse) etter å ha oppnådd LeCO1-sekvensen.
- Trim oppstrøms og nedstrøms lavkvalitetslesinger ved å åpne en fasta- (eller txt)-fil og fjerne lesingene av lav kvalitet direkte.
- Send den trimmede sekvensen til NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ved hjelp av standardparametere.
MERK: Hvis amplikonstørrelsene på A05Le og LeCO1 primersett er riktige, må sekvenssprengningssøket mot NCBIs standarddatabaser stemme overens med sennepsbladlus.
3. Fremstilling av entomopatogene sopp
MERK: EPF brukt i denne studien er oppført i tabell 1.
- Gjenoppretting av EPF fra soppbibliotek
- Tine den konserverte soppstammen (conidia suspendert i 30% glyserin) fra fryseren på -80 °C.
- Overfør en liten mengde (ca. 10 μL) av conidia-suspensjonen til 6 cm 1/4 Sabouraud dextrose agar (SDA) plate (0,75 g Sabouraud druesukkerbuljong med 1,5 g agar per 100 ml ddH2O) og fordel den jevnt ved hjelp av en cellespreder i en laminær strømningshette.
- Forsegl petriskålen med parafinfilm, og rug den i mørke ved 25 °C i 10-14 dager.
- Re-kultur soppisolatene ved å stripe soppmasse på en 1/4 SDA-plate og inkubere sopp i mørke ved 25 ° C i 10-14 dager før høsting av conidia22.
MERK: Svampkulturen skal brukes ca. 10 dager før inokulering av bladlusene. EPF-kultur som er eldre enn 14 dager anbefales ikke til bruk i virulenstesten.
- Tilberedning av conidia-suspensjon
- Skrap konidiene fra den 10-14 dager gamle soppkulturen på 1/4 SDA-plate ved inokuleringssløyfe etter tilsetning av 2-3 ml 0,03% mellom 80 (se materialfortegnelse).
- Samle soppsuspensjonen i et sentrifugerør.
- Vortex løsningen med høyeste hastighet, telle antall konidier ved hjelp av et hemocytometer under et lysmikroskop, og juster konsentrasjonen av conidia-suspensjonen til 108 conidia / ml.
- Overfør conidia-suspensjonen til en UV-sterilisert mikrosprøyte.
MERK: Vortex conidia-suspensjonen igjen før du overfører den, da konidiene er tilbøyelige til å felle. Mikrosprøyten skal utsettes for ultrafiolett stråling i en avtrekkshette med laminær luftstrøm i 30 minutter før bruk.
4. Virulens screening mot sennepsbladlus
- Forberedelse av nylig oppståtte voksne
- Flytt apterous (uten vinge) og alate (winged) voksne fra oppdrett petriskål til nyskårne blader for å reprodusere nye forfedre av samme alder. Fjern de voksne etter 24 timer for å unngå overbefolkning og minimere produksjonen av alated progenies23,24. Bare apterøse voksne vil bli brukt i videre eksperimenter.
- Bakre forfedre til voksenstadiet og fjern forfedrene som ikke utvikler seg til voksenstadiet etter 48 timer (figur 3) for å forhindre aldersvariasjon mellom bladlusene for forsøket. I tillegg fjerner du alated voksne.
- Klargjøring av inokulasjonskammer
MERK: Det anbefales å tilberede 9 cm diameter cruciferous blader først, slik at bladskiven kan bygges inn i vannagaren før størkning.- Rengjør cruciferous bladene med vann fra springen, fjern smuss og rester, og eventuelle andre leddyr hvis de er til stede.
- Tørk bort overflødig vann med et papirhåndkle og se etter andre leddyr på overflaten av cruciferous bladene ved hjelp av et stereomikroskop. Fjern eventuelle leddyr hvis de finnes.
- Klipp en bladskive med en diameter på 9 cm enten ved å trykke direkte på den nederste petriskålen på bladet som en form eller ved å bruke en saks.
MERK: Hvis bladene er mindre enn 9 cm i diameter, kombiner et par utskårne blader. - Tilbered 1,5 % vannagar til hver petriskål ved å varme opp og løse opp 450 mg agar (se materialfortegnelse) i 30 ml ddH2O ved mikrobølgeovn.
MERK: Mengden 1,5% vannagar kan justeres avhengig av eksperimentskalaen. - Hell 30 ml 1,5 % vannagar i 9 cm petriskålen før størkning i avtrekksviften, og vent til agaren er avkjølt til ~40 °C til overflaten av agaren er halvstørknet.
MERK: Sjekk om overflaten er halvstørknet ved å riste petriskålen forsiktig horisontalt. - Plasser bladskiven, abaxial overflate opp, på toppen av vannagar, og legg bladskiven inn i agar.
MERK: Minimer eksponeringen av agaroverflaten. - Etter at vannagaren har størknet helt, lukk dekselet på petriskålen.
NOTAT: Åpne dekselet for vannfordampning hvis mange dråper kondenserer på dekselet umiddelbart. - Plasser 20 apterøse voksne på bladskiven.
MERK: Det anbefales å operere under et stereomikroskop for å forhindre skade på munndelene.
- EPF-inokulering og observasjon
- Åpne dekselet på inokulasjonskammeret og spray 0,3 ml konidier suspensjon (fra trinn 3.2) direkte på bladlus og bladskive fra ca. 15 cm over bladskiven.
MERK: Virv conidia-suspensjonen igjen før sprøyting. Sprøyteområdene bør testes før forsøket, da de kan variere mellom forskjellige sprøyter. I dette tilfellet anbefales 0,3 ml med 15 cm avstand. Sprøyteområdet skal dekke hele bladskiven, og et tynt lag med conidia-suspensjon skal dekke bladskiven. Hvis dråper konvergerer i stående vann på bladet, bør inokulasjonsvolumet reduseres. Rengjør bordet med 70% etanol før inokulering og mellom bruk av forskjellige isolater. - Vent til conidia-suspensjonen tørker, og lukk deretter dekselet for å forhindre at sennepsbladlus drukner.
MERK: Bladlus streifer sjelden rundt under forsøket; Det er imidlertid fortsatt nødvendig å sikre at bladlusene ikke unnslipper. - Forsegl inokulasjonskammeret med parafinfilm for å opprettholde høy relativ luftfuktighet og plasser inokulasjonskammeret i en inkubator ved 25 °C med 12:12 h (lys:mørk) fotoperiode.
- Åpne dekselet til inokulasjonskammeret for å telle dødelighet under et stereomikroskop hver 12. time i 5 dager.
- Tørk ut honningduggen som fester seg til dekselet med et papirhåndkle og fjern de nylig oppståtte bladlusene med en fin pensel. Rengjør dekselet med vann fra springen hver 24.
MERK: Observasjonsperioden kan variere for forskjellige arter av bladlus basert på voksen levetid. - Hold på bladskiven for mykose for å bekrefte vellykket inokulering.
- Åpne dekselet på inokulasjonskammeret og spray 0,3 ml konidier suspensjon (fra trinn 3.2) direkte på bladlus og bladskive fra ca. 15 cm over bladskiven.
- Bekreftelse av conidia spiringshastighet
MERK: Dette trinnet er valgfritt. For å bekrefte konidia-spiringshastigheten parvis når du utfører virulensscreeningen for å sikre aktiviteten til konidier.- Slipp en dråpe med 5 μL konidier suspensjon på 1/4 SDA for tre replikater.
- Etter 18 timer, beregne spiringshastigheten med lysmikroskopet. Telle minst 100 sporer tilfeldig i en enkelt dråpe for å bekrefte soppspiringshastigheten.
MERK: Normalt bør spiringshastigheten til isolatene som brukes i forsøket være høyere enn 90%.
5. Bioassay av utvalgte EPF-isolater
EPF-isolater som viste høy virulens, som ble valgt fra trinn 4, ble utsatt for et bioassay mot sennepsbladlus ved bruk av fire konsentrasjoner av conidia-suspensjoner (fra 104 til 107 conidia / ml).
- Tilberedning av conidia-suspensjon
- Gjenta trinn 3.1 for å gjenopprette de valgte EPF-isolatene.
- Gjenta trinn 3.2 for å forberede fire konsentrasjoner av konidier suspensjon, inkludert 104, 10 5,10 6 og 107 conidia / ml.
- Forberedelse av nylig oppståtte voksne
- Gjenta trinn 4.1 for å forberede nylig oppståtte voksne.
- Klargjøring av inokulasjonskammer
- Gjenta trinn 4.1. for å forberede inokulasjonskammeret.
- EPF-inokulering og observasjon
- Gjenta trinn 4.3. å utføre EPF-inokulasjon og observasjon med henholdsvis de fire konsentrasjonene av konidiasuspensjon.
6. Statistisk analyse
- Beregning av korrigert dødelighet
- Beregn korrigert dødelighet ved hjelp av Abbotts formel25, som vist nedenfor:
Korrigert dødelighet (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
MT representerer dødeligheten av behandlingsgruppen, og MC representerer dødeligheten til kontrollgruppen.
MERK: Dødeligheten i kontrollgruppen bør ikke være høyere enn 20%. - Åpne SPSS-programvareplattformen (se materialtabellen), opprett variabler inkludert "behandling" og "cor_mor" (som representerer korrigert dødelighet), og skriv inn de beregnede resultatene for inokulering av forskjellige isolater samtidig med samme inokulerte konsentrasjon.
- Velg Analyser, Sammenlign gjennomsnitt og proporsjoner, Uavhengige prøver T-test i SPSS for uavhengig t-testanalyse .
- I SPSS, skriv inn behandling i "Grupperingsvariabel" -boksen, og cor_mor inn i "Testvariabel (er)". Definer grupper etter forskjellige soppisolater. Trykk OK for å analysere.
- Beregn korrigert dødelighet ved hjelp av Abbotts formel25, som vist nedenfor:
- Beregning av median dødelig tid (LT 50) og median dødelig konsentrasjon (LC50)
- Åpne SPSS, opprett variabler "total", "respons" og "varighet" / "konsentrasjon", og skriv inn det registrerte resultatet i regnearket.
- Velg Analyser, Regresjon, Probit i SPSS for å beregne LT 50 og/eller LC50.
MERK: Hvis kumulativ dødelighet ikke overstiger 50% til slutt, kan LT 50 og / eller LC50 ikke estimeres. - Skriv inn totalt i "Totalt observert" -boksen, svar i "Responsfrekvens" -boksen, varighet / konsentrasjon i "Kovariat (er)" -boksen. Trykk OK for å analysere.
MERK: Trykk vanligvis på Valg og sett "Signifikansnivå for bruk av heterogenitetsfaktor" til 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det presenterte flytskjemaet illustrerer sennepsbladlusens stabile tilstand fra feltinnsamling til virulensscreening. Vedlikehold av bladlus fra feltinnsamling sørget for en stabil økning i bladluskolonier med tilstrekkelig matforsyning. De feltinnsamlede bladlusene ble bekreftet som sennepsbladlus ved bruk av molekylære markører, inkludert PCR-amplikonstørrelse og LeCO1-sekvensering. Virulensscreeningen, utført med frittliggende bladmetode, viste konsistent overlevelse for sennepsbladlus, der kontrollgruppen hadde 85 % overlevelse (figur 4).
Under virulensscreeningen viste Cc-NCHU-213 den raskeste bladlusdrepende evnen, noe som resulterte i 50 % og 90 % dødelighet ved henholdsvis 3 dager og 4,5 dager etter inokulasjon (d.p.i.) (figur 4). Imidlertid ble varierende bladlusdrepende evner observert blant de fem B. bassiana-isolatene. Bb-NCHU-141, -143 og -153 viste langsomme bladlusdrepende evner, med bare 5% dødelighet ved 3 d.p.i., selv når man utelukker effekten av 0,03% mellom 80 sprøyting eller andre dødelige faktorer (figur 4). Den korrigerte mortalitetsformelen ble derfor brukt for å normalisere kontrolldødeligheten. De fleste EPF-isolater mot sennepsbladlus viste korrigert dødelighet høyere enn 70 % innen 5 d.p.i., bortsett fra Pl-NCHU-152 (tabell 3). Blant disse EPF-isolatene viste Bb-NCHU-286 den høyeste dødeligheten på 100 % (tabell 3). I tillegg ble EPF-mykose observert på av sennepsbladlus infisert med Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum og Cordyceps cateniannulata under virulensscreeningen, noe som indikerer effektiviteten av dette systemet (figur 5).
Basert på resultatene av virulensscreeningen ble to EPF-isolater, nemlig Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213, som viste rask insektdrepende aktivitet (henholdsvis 40% og 50% dødelighet ved 3 d.p.i.), valgt for bioassay mot sennepsbladlus. Resultatene viste signifikant forskjellig korrigert dødelighet for Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 ved 3 og 4 d.p.i. med inokulasjon på 107 conidia / ml (figur 6). I LT50-analysen viste behandlingen med 107 conidia / ml Cc-NCHU-213 en signifikant kortere varighet sammenlignet med andre behandlinger (tabell 4). Videre var LC50-verdien av Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) lavere enn for Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), noe som indikerer at Cc-NCHU-213 har større virulens mot sennepsbladlus (tabell 5).
Figur 1 Eksperimentelt flytskjema for screening av EPF-virulens mot sennepsbladlus. (A) Etablering av et sennepsbladlusoppdrettssystem. (B) Tilberedning av EPF. (C) Soppinokulasjon. (D) Statistisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Elektroforese av sennepsbladlusgenomisk DNA amplifisert med A05Le og Le CO1 primersett. Elektroforese ble utført på en 1% agarosegel. M = 100 bp DNA stige; bp = basepar. Den røde stjernen indikerer målbøyningen av PCR-amplifikasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forskjeller mellom apterøs fjerdestjernenymfe og voksen sennepsbladlus. (A) Fjerdestjerne nymfe. (b) Voksen. Tibiae av bakbenene til den fjerde instar nymfen er hvitaktig (merket med rød pil). Nyoppståtte bladlus ble fjernet med fin kamelbørste under virulenstester. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Dødelighetsvarmekart over 13 EPF-isolater mot sennepsbladlus ved frittliggende bladmetode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Observasjon av soppmykose av 13 EPF-isolater. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemfigi; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 Korrigert dødelighet av soppisolatene Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 mot sennepsbladlus. Feilfeltene representerer standardavviket (SD). Dødeligheten av Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 samtidig med samme inokulerte konsentrasjon ble sammenliknet med uavhengig t-test, og moraliteter merket med stjerne ble funnet å være signifikant forskjellige (p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Isolere | Art | Vert eller kilde* | Plassering |
| Mp-NCHU-2 | Metarhizium pemphigi | jord | Yilan |
| ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | jord | Yilan |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | jord | Yilan |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | jord | Taichung |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | Tessaratoma papillosa | Chiayi |
| Bb-NCHU-153 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua |
| Mb-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | jord | Taichung |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | jord | Taichung |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | jord | Taichung |
| Bb-NCHU-286 | Beauveria bassiana | Cerambycidae | Taichung |
Tabell 1: EPF-isolater brukt i denne studien.
| Primer navn | Sekvens (5' - 3') | Produktstørrelse (bp) | Referanse | |
| A05Le | F-GGGTCTTGGATGGTGTGTG | 953 | Lu et al. [21] | |
| R-AGGGGTCTTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Denne studien | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
Tabell 2: Primerpar brukt til molekylær identifikasjon av sennepsbladlus.
| Isolere | Art | Korrigert mortalitet (%) |
| Mp-NCHU-2 | Metarhizium pemphigi | 76.47 |
| ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | 82.35 |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | 35.29 |
| Bb-NCHU-153 | Beauveria bassiana | 82.35 |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Mb-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | 76.47 |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 88.24 |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 94.12 |
| Bb-NCHU-286 | Beauveria bassiana | 100.00 |
Tabell 3: Korrigert dødelighet av 13 EPF-isolater mot sennepsbladlus 5 dager etter inokulasjon (d.p.i.).
| Isolere | Art | Kons.(conidia/ml) | N* | LT50 (dager)† | 95 % konfidensgrenser | Helling (SE) | X2 (df)‡ |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 104 | 60 | 3.816 a | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 | 60 | 3.112 bd | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.908 b | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 c | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 104 | 60 | 3.948 a | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 | 60 | 3.237 D | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 c | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 Ø | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Antall observerte insekter. | |||||||
| †LT50-verdier merket med forskjellige bokstaver ble ansett som signifikant forskjellige da deres 95 % konfidensgrenser ikke overlappet. | |||||||
| ‡X2, Chi-kvadratverdi i Pearsons goodness-of-fit-test; DF, frihetsgrader | |||||||
Tabell 4: LT50-verdier av soppisolater Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 mot sennepsbladlus under forskjellige konidiakonsentrasjoner. *Antall observerte insekter. †LT50-verdier merket med forskjellige bokstaver ble ansett som signifikant forskjellige da konfidensgrensene på 95 % ikke overlappet. ‡X2, Chi-kvadratverdi i Pearsons goodness-of-fit-test; df, frihetsgrader.
| Isolere | Art | N* | LC50 (conidia / ml)† | 95 % konfidensgrenser | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| Mb-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 240 | 2.30 × 105 a | 8,63 × 104–5,70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 240 | 9,32 × 104 a | 4,97 × 104–1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Antall observerte insekter. | ||||||
| †LC50-verdier merket med forskjellige bokstaver ble ansett som signifikant forskjellige da konfidensgrensene på 95 % ikke overlappet. | ||||||
| ‡X2, Chi-kvadratverdi i Pearsons goodness-of-fit-test; DF, frihetsgrader | ||||||
Tabell 5: LC50-verdier av soppisolater Mb-NCHU-197 og Cc-NCHU-213 mot sennepsbladlus. *Antall observerte insekter. †LC50-verdier merket med forskjellige bokstaver ble ansett som signifikant forskjellige da konfidensgrensene på 95 % ikke overlappet. ‡X2, Chi-kvadratverdi i Pearsons goodness-of-fit-test; df, frihetsgrader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Crucifers, en gruppe grønnsaker, er ofte infisert av flere bladlusarter, inkludert sennepsbladlus (L. erysimi) og kålbladlus (Brevicoryne brassicae)26. Begge artene er rapportert i Taiwan27, og det er mulig for dem å sameksistere på innsamlingsstedet. For å skille nært beslektede bladlusarter, benyttet denne studien en molekylær identifikasjonsteknikk ved hjelp av et multiplexprimersett21. Ved å designe en molekylær markør fra sennepsbladlusens COI-genfragment, identifiserte vi sennepsbladlusen, og bekreftet dermed påliteligheten til molekylmarkøren A05Le for dette formålet21.
Observasjonene viste at det er utfordrende uten erfaring å skille mellom apterøse fjerdestjernenymfer og voksne sennepsbladlus basert utelukkende på størrelse eller morfologi. Et avgjørende kjennetegn er imidlertid bakbeinas tibia, som virker hvit hos fjerdestjernenymfer, men ikke hos voksne (figur 3). Tidligere studier på L. attenuatum, B. bassiana mot bomullsbladlus og M. brunneum mot grønn ferskenbladlus har vist at smelting kan være en strategi for å unngå infeksjon28,29,30. Derfor kan feilidentifisering av bladlusstadier føre til feil i virulensvurderingen, da smelting kan påvirke effektiviteten av EPF28,29,31. For å løse dette problemet og sikre større nøyaktighet og presisjon i virulensevaluering, ekskluder bladlus med hvite deler på bakbentibiae som ikke har nådd voksenstadiet, med mindre de med vilje bruker bladlusnymfer. Disse bladlusene er ikke fullt modne og kan gjennomgå smelting, noe som kan tillate dem å unnslippe infeksjonsprosessen av EPF. I tillegg anbefales et tidsforløp med observasjon og dataregistrering hver 12. 12-timersintervallet er å foretrekke for å demonstrere forskjeller mellom flere lovende isolater med lignende bladlusdrepende evner og letter den nøyaktige beregningen av LT50. Tidsintervallet kan imidlertid justeres basert på de forskjellige livssyklusene til andre insektarter eller bestemmes gjennom en småskala pretest.
Selv om den frittliggende bladmetoden kan etterlate minimalt med honningdugg på bladskiven, fester det meste av honningduggen seg til petriskåldekselet siden bladskiven er i umiddelbar nærhet. Det kan tørkes eller vaskes bort i observasjonsperioden. Imidlertid er honningdugg utvilsomt tilstede i det praktiske miljøet for avlingsdyrking når bladlus invaderer32. Honningduggen som er tilstede i inokulasjonskammeret, kan noe simulere situasjonen når EPF inokuleres i bladlus i feltet. Bladlus neglebånd inneholder for det meste honningdugg, som tjener som en kilde til næringsstoffer for soppen og kan stimulere spiring av EPF16. Dermed kan kombinasjonen av EPF-applikasjon og honningduggproduksjon av bladlus være fordelaktig.
For å bekrefte at bladlusdød skyldes infeksjon, overføres vanligvis fra EPF-inokulasjonskammeret til fuktig filterpapir eller et kulturmedium for å observere soppvekst 11,14,33,34. I denne studien ble imidlertid vannagar brukt i inokulasjonskammeret for å opprettholde høy luftfuktighet, slik at bladluskadavrene kunne forbli på bladene uten å måtte flyttes for observasjon av soppvekst. Selv om frittliggende bladmetode gir informasjon om den aphidicide effekten av EPF-isolater, har den fortsatt begrensninger. Vannagaren som brukes til å opprettholde bladskivens tilstand, kan føre til at bladlusene setter seg fast mens de beveger seg i inokulasjonskammeret. For å løse dette problemet ble prosentandelen vannagar økt til 3%, noe som ga en fast nok overflate for russiske hvetebladlus (Diuraphis noxia) til å gå på20. I dette forsøket var sennepsbladlusene i stand til å bevege seg komfortabelt på vannagaroverflater med konsentrasjoner fra 1,5% til 3%. Men etter hvert som observasjonstiden skred frem, ble noen bladlus sittende fast opp ned med beina oppover og måtte reddes tilbake til bladskiven. Dette kan skyldes forskjellene i bladlusstørrelse eller mobilitet, noe som indikerer at økning av agarkonsentrasjonen alene kanskje ikke løser problemet. Sørg derfor for at bladskiven dekker agaroverflaten helt ved å bruke et blad som passer tettere til petriskålstørrelsen, noe som kan bidra til å lindre dette problemet. I forhold til frittliggende bladmetode beskrevet av Yokomi og Gottwald18, har denne studien forbedret seg på ett aspekt ved å bruke en bladstørrelse som passer omtrent godt til petriskålen. Dette muliggjør relativ kvantifisering av matforbruket og minimerer den eksponerte agaroverflaten. I tillegg må bladet "bygges inn" i den halvstørknede vannagaren, mens det i den opprinnelige referansen ble beskrevet som "plassert" på vannagar18. Å legge inn bladskiven i vannagaren reduserer sannsynligheten for at bladlusene sitter fast på agaroverflaten og letter observasjon, da bladlusene er begrenset til den ene siden.
Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner om hvordan du skal fortsette med frittliggende bladmetode og EPF-inokulering, sammen med noen modifikasjoner som har lettet operasjoner, observasjoner og konsistente resultater. Det etablerer også en standardisert metode for valg av EPF-isolater mot plantesugende under laboratorieforhold. Videre kan det utføres en standardkontroll med kjente effektive eller kommersielt tilgjengelige produkter for fremtidig kommersialisering av EPF-isolater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt involvert i dette arbeidet.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
