Summary
Este protocolo apresenta um sistema otimizado de bioensaio foliar destacado para avaliar a eficácia de fungos entomopatogênicos (FPE) contra o pulgão mostarda (Lipaphis erysimi (Kalt.)), um inseto partenogenético. O método descreve o processo de coleta de dados durante os experimentos com placas de Petri, permitindo que os pesquisadores meçam consistentemente a virulência do PFE contra pulgões da mostarda e outros insetos partenogenéticos.
Abstract
O pulgão da mostarda (L. erysimi) é uma praga que infesta várias culturas crucíferas e transmite vírus de plantas. Para alcançar o manejo ecológico de pragas, fungos entomopatogênicos (FPE) são potenciais agentes de controle microbiano para o controle dessa praga. Portanto, a triagem de virulência de isolados de PFE em condições de placa de Petri é necessária antes da aplicação em campo. No entanto, o pulgão da mostarda é um inseto partenogenético, dificultando o registro de dados durante experimentos com placas de Petri. Um sistema modificado para bioensaios de folhas destacadas foi desenvolvido para resolver essa questão, usando um micropulverizador para inocular conídios em pulgões e prevenir o afogamento, facilitando a secagem ao ar após a suspensão dos esporos. O sistema manteve alta umidade relativa durante todo o período de observação, e o disco foliar permaneceu fresco por mais de dez dias, permitindo a reprodução partenogenética dos pulgões. Para evitar o acúmulo de filhotes, foi implementado um processo de remoção diária com pincel de pintura. Este protocolo demonstra um sistema estável para avaliar a virulência de isolados de PFE contra pulgões mostarda ou outros afídeos, possibilitando a seleção de potenciais isolados para o controle de afídeos.
Introduction
O pulgão-mostarda (L. erysimi) é uma notória praga que infesta uma variedade de culturas crucíferas, causando perdas econômicas significativas1. Embora vários inseticidas sistemáticos tenham sido recomendados para combater infestações por afídeos, o uso frequente desses inseticidas levanta preocupações sobre a resistência a pesticidas 2,3. Portanto, em termos de manejo ecológico de pragas, os fungos entomopatogênicos (PFE) podem servir como uma estratégia alternativa de controle adequada. O PFE é um inseto patógeno com capacidade de infectar hospedeiros penetrando em suas cutículas, tornando-se um potente agente no controle de pulgões e outros insetos sugadores deplantas4. Além disso, o PFE tem se mostrado uma técnica viável e sustentável de manejo de pragas, oferecendo benefícios como antagonismo de fitopatógenos e promoção do crescimento vegetal5.
O PFE pode ser obtido através de iscas de inseto-solo ou isolado de cadáveres de insetos no campo 6,7. No entanto, antes do uso adicional de isolados fúngicos, a triagem de patogenicidade é necessária. Vários estudos têm sido realizados sobre a eficácia do PFE contra pulgões, que são importantes pragas das culturas e podem causar danos severos 8,9. Os pulgões da mostarda, dentre várias espécies de afídeos, têm sido testados quanto à suscetibilidade a várias cepas de Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., e até mesmo Alternaria, que é primariamente conhecida como fungo saprofítico e fitopatogênico, mas tem mostrado alguns efeitos letais contra pulgões mostarda10,11,12.
Para avaliar a eficácia do PFE contra pulgões em condições de laboratório, os bioensaios podem ser divididos em duas partes principais: a câmara de inoculação e a inoculação fúngica. O protocolo actual descreve a construção de uma câmara de inoculação, onde os pulgões podem ser mantidos utilizando vários métodos, tais como uma folha excisada com um pecíolo envolto em algodão húmido, um disco de folha excisado com uma placa de Petri forrada com papel de filtro humedecido, manutenção directa em plantas de vaso ou um disco de folha excisado embutido em ágar água dentro de uma placa de Petri ou recipiente10, 11,13. Métodos comuns para inoculação fúngica incluem pulverização de conídios, imersão de afídeos em suspensão de conídios, imersão foliar em suspensão de conídios e inoculação de endófitos vegetais11,14,15,16. Embora existam vários métodos de inoculação, os bioensaios devem simular as condições de aplicação em campo. Por exemplo, no caso do método de imersão foliar12,17, a eficiência do PFE pode ser avaliada, mas como os pulgões infestam as folhas carregadas de fungo, a face dorsal do pulgão, que é um local preferencial de penetração, geralmente não fica exposta ao fungo.
Para avaliar o efeito afidicida do PFE em condições de laboratório, este protocolo sugere a utilização do método de folhas destacadas descrito por Yokomi e Gottwald18 com algumas modificações, seguido da inoculação de conídios com micropulverizador. Esse método mantém aproximadamente 100% de umidade na câmara de bioensaio por pelo menos sete dias, sem a necessidade de reposição adicional de água18,19. Além disso, o confinamento dos pulgões em uma superfície garante sua exposição à pulverização de conídios e facilita as observações20. No entanto, os pulgões podem ficar presos na superfície exposta do ágar enquanto se movem dentro da câmara de inoculação. Além disso, o registro de dados no experimento da placa de Petri com pulgões da mostarda, que são insetos partenogenéticos, pode ser um desafio devido ao seu rápido desenvolvimento e reprodução. É difícil distinguir entre adultos inoculados e sua progênie sem remoção. Os detalhes de como proceder nessa etapa raramente são mencionados, e alguns fatores inconsistentes, como a área de consumo de folhas, precisam ser otimizados.
Este protocolo demonstra um sistema estável para triagem da virulência de isolados de PFE contra pulgões mostarda, possibilitando a seleção de potenciais isolados contra várias espécies de afídeos a partir de uma extensa biblioteca de PFE. Pulgões coletados em campo podem ser identificados, e uma população laboratorial suficiente de pulgões mostarda pode ser estabelecida para avaliar o efeito afidicida de vários isolados fúngicos usando uma metodologia fácil e viável com resultados consistentes. Os pulgões têm desenvolvido múltiplos mecanismos evolutivos em resposta a intensas e repetidas pressões antrópicas em agroecossistemas, colocando desafios à segurança alimentar9. Portanto, este método descrito pode ser estendido para avaliar potenciais isolados de PFE contra várias espécies de afídeos.
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Protocol
NOTA: O fluxograma completo é mostrado na Figura 1.
1. Coleta e manutenção de pulgões de mostarda
- Coleção de pulgões de mostarda
- Vire as folhas e verifique visualmente se há infestação de pulgões de mostarda em culturas crucíferas no campo.
- Registre as informações do local de amostragem (ou seja, GPS) e a(s) planta(s) hospedeira(s) e confirme o histórico de aplicações de inseticidas com os agricultores.
- Use um aspirador de insetos ou um pincel de pintura fina (ver Tabela de Materiais) para coletar cerca de 50 pulgões de mostarda em um tubo de centrífuga de 50 mL de culturas crucíferas no campo e levar a amostra para o laboratório dentro de 3 h.
- Prepare uma placa de Petri de manutenção temporária com folhas crucíferas excisadas e papel de filtro infiltrado em água na parte inferior.
- Colocar os cinco pulgões na placa de Petri de manutenção temporária à temperatura ambiente (25 ± 2 °C) com uma humidade relativa de 70% e fotoperíodo de 12:12 h (claro:escuro) durante 14 dias para confirmar que o pulgão poupou inimigos naturais antes de continuar a criar.
NOTA: Para garantir que os pulgões coletados em campo estejam livres de inimigos naturais, como vespas parasitoides ou fungos entomopatogênicos, é crucial confirmar a ausência desses organismos antes de prosseguir com a criação.
- Manutenção de pulgões de mostarda
NOTA: Para manter os pulgões da mostarda, use folhas crucíferas livres de pesticidas (incluindo biopesticidas).- Fornecer um suprimento estável e suficiente de folhas crucíferas (cerca de 25 cm2).
NOTA: Obter as folhas crucíferas do mercado ou cultivar as plantas. Antes da criação maciça a longo prazo de pulgões de mostarda, vários tipos diferentes de crucífera poderiam ser testados para encontrar uma crucífera adequada. Uma vez fixada a espécie da folha crucífera, não a altere. Neste estudo, utilizou-se Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) no estádio de 6-7 folhas (ver Tabela de Materiais). Além disso, descarte as 2-3 folhas mais velhas. - Adicione água antes que o papel de filtro na parte inferior esteja completamente seco.
- Observe a densidade populacional dos pulgões da mostarda diariamente. A população deve crescer para 2-3 vezes após 7 dias.
- Quando o número de pulgões aumentar, corte as folhas originalmente excisadas com pulgões de mostarda em 4-6 pedaços menores e coloque cada pedaço de folha pequena com pulgões de mostarda em uma placa de Petri com folha excisada fresca e papel de filtro infiltrado em água.
- Coloque a placa de Petri numa incubadora a 25 °C com fotoperíodo de 12:12 h (claro:escuro) e observe diariamente a densidade populacional dos pulgões da mostarda.
- Remova as folhas excisadas originais depois que a maioria dos pulgões migram para folhas excisadas frescas antes que as folhas originais apodreçam.
- Fornecer um suprimento estável e suficiente de folhas crucíferas (cerca de 25 cm2).
2. Identificação molecular do pulgão da mostarda
NOTA: Para confirmar a espécie de pulgão da mostarda coletada em campo, a identificação molecular foi realizada usando dois marcadores moleculares: a região amplificada caracterizada por sequência (SCAR) baseada em A05Le desenhada por Lu et al.21, e a região da subunidade 1 (COI) da citocromo oxidase do pulgão da mostarda.
- Extração de DNA genômico de pulgão mostarda
- Coletar aproximadamente 50 pulgões em um tubo centrífugo de 1,5 mL.
NOTA: Os pulgões usados para identificação molecular devem ser descendentes de um único pulgão, e vários estágios também podem ser agrupados no mesmo tubo para extração de DNA. - Homogeneizar os pulgões com um pilão pellet e extrair o DNA usando o Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Eluir o DNA genômico com 50 μL de água pré-aquecida livre de nucleases.
- Coletar aproximadamente 50 pulgões em um tubo centrífugo de 1,5 mL.
- Amplificação por PCR e sequenciamento de DNA
- Amplificar as sequências de DNA alvo do DNA genômico de afídeos usando PCR Master Mix (2x) com pares de primers A05LeF/A05LeR e LeCO1F/LeCO1R (Tabela 1) com diferentes programas de PCR21.
NOTA: A reação de PCR com um volume total de 20 μL é composta por 2 μL de molde de DNA genômico de afídeo, 1 μL de primers para frente e 1 μL invertido, 10 μL de PCR Master Mix (ver Tabela de Materiais) e 6 μL ddH2O. - Realizar a PCR em um termociclador (ver Tabela de Materiais) com o seguinte programa: 94 °C por 5 min, 25 ciclos de 94 °C por 45 s, 61 °C (para A05LeF/A05LeR) e 58 °C (para LeCO1F/LeCO1R) por 45 s, 72 °C por 1 min, seguido por uma extensão final de 72 °C por 5 min.
- Analisar o produto da PCR por eletroforese em gel de agarose a 1% para confirmar a identidade do pulgão mostarda (Figura 2).
NOTA: Se o par de primers A05LeF/A05LeR amplificar com sucesso o tamanho correto do fragmento de DNA, ele identificou de forma convincente o pulgão coletado em campo como pulgão de mostarda21. Os pares de primers estão listados na Tabela 2. - Purificar o produto de PCR do amplicon COI do pulgão da mostarda usando um kit de gel/PCR disponível comercialmente seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) e sequenciar o produto de PCR usando um serviço de sequenciamento comercial.
- Amplificar as sequências de DNA alvo do DNA genômico de afídeos usando PCR Master Mix (2x) com pares de primers A05LeF/A05LeR e LeCO1F/LeCO1R (Tabela 1) com diferentes programas de PCR21.
- Análise de sequência
NOTA: Segundo Lu et al.21, a flexão do DNA de A05Le é um fragmento de DNA específico para pulgões de mostarda; portanto, o produto A05Le PCR não precisa ser sequenciado posteriormente.- Verifique a qualidade de leitura pelo software Chromas (ver Tabela de Materiais) após a obtenção da sequência LeCO1.
- Corte leituras de baixa qualidade a montante e a jusante abrindo um arquivo fasta (ou txt) e removendo diretamente as leituras de baixa qualidade.
- Envie a sequência cortada para NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) usando parâmetros padrão.
NOTA: Se os tamanhos de amplicon dos conjuntos de primers A05Le e LeCO1 estiverem corretos, teoricamente, a pesquisa de explosão de sequência em bancos de dados padrão NCBI deve corresponder ao pulgão mostarda.
3. Preparação de fungos entomopatogênicos
NOTA: O PFE utilizado neste estudo está listado na Tabela 1.
- Recuperação de FPE de biblioteca fúngica
- Descongelar o estoque de fungos conservados (conídios suspensos em glicerina a 30%) do freezer a -80 °C.
- Transferir uma pequena quantidade (aproximadamente 10 μL) da suspensão de conídios para uma placa de ágar Sabouraud dextrose (SDA) de 6 cm (0,75 g de caldo Sabouraud dextrose com 1,5 g de ágar por 100 mL ddH2O) e espalhe-a uniformemente usando um espalhador celular em uma capela de fluxo laminar.
- Selar a placa de Petri com filme de parafina e incubá-la na escuridão a 25 °C por 10-14 dias.
- Recultivar os isolados fúngicos por meio de espaçamento da massa fúngica em placa de 1/4 de SDA e incubação dos fungos no escuro a 25 °C por 10-14 dias antes da colheita dos conídios22.
NOTA: A cultura fúngica deve ser utilizada aproximadamente 10 dias antes da inoculação dos pulgões. A cultura de PFE com mais de 14 dias de vida não é recomendada para uso no teste de virulência.
- Preparação da suspensão de conídios
- Raspar os conídios da cultura fúngica de 10-14 dias de idade em placa de 1/4 de SDA inoculando alça após adicionar 2-3 mL de Tween 80 a 0,03% (ver Tabela de Materiais).
- Recolher a suspensão fúngica num tubo de centrifugação.
- Vórtice a solução na maior velocidade, conte o número de conídios usando um hemocitômetro sob um microscópio de luz e ajuste a concentração da suspensão de conídios para 10a 8 conídios/mL.
- Transfira a suspensão de conídios para um micropulverizador esterilizado por UV.
NOTA: Vórtice a suspensão de conídios novamente antes de transferi-la, pois os conídios são propensos a precipitar. O micropulverizador deve ser exposto à radiação ultravioleta em uma capela de fluxo laminar por 30 minutos antes do uso.
4. Triagem de virulência contra pulgão mostarda
- Preparação de adultos recém-emergidos
- Mova adultos ápteros (sem asa) e alados (alados) da placa de Petri de criação para folhas recém-excisadas para reproduzir novas progênies da mesma idade. Retirar os adultos após 24 h para evitar superlotação e minimizar a produção de progênies aladas23,24. Somente adultos ápteros serão utilizados em experimentos posteriores.
- Levantar progênies para a fase adulta e remover as progênies que não evoluem para a fase adulta após 48 h (Figura 3) para evitar variação de idade entre os pulgões para o experimento. Além disso, remova adultos alados.
- Preparo da câmara de inoculação
NOTA: Recomenda-se preparar primeiro folhas crucíferas de 9 cm de diâmetro, para que o disco foliar possa ser embutido no ágar água antes da solidificação.- Limpe as folhas crucíferas com água da torneira, remova a sujeira e os resíduos, e qualquer outro artrópode, se presente.
- Limpe o excesso de água com um papel toalha e verifique se há outros artrópodes na superfície das folhas crucíferas usando um estereomicroscópio. Remova todos os artrópodes, se houver.
- Corte um disco foliar de 9 cm de diâmetro pressionando diretamente a placa de Petri inferior na folha como um molde ou usando uma tesoura.
NOTA: Se as folhas forem menores que 9 cm de diâmetro, misture algumas folhas excisadas. - Preparar 1,5% de ágar água para cada placa de Petri aquecendo e dissolvendo 450 mg de ágar (ver Tabela de Materiais) em 30 mL ddH2O usando micro-ondas.
NOTA: A quantidade de 1,5% de ágar água pode ser ajustada dependendo da escala do experimento. - Despeje 30 mL de ágar água a 1,5% na placa de Petri de 9 cm antes da solidificação na capela de fluxo laminar e, em seguida, aguarde o ágar esfriar até ~40 °C até que a superfície do ágar esteja semissolidificada.
NOTA: Verifique se a superfície está semi-solidificada agitando suavemente horizontalmente a placa de Petri. - Coloque o disco foliar, superfície abaxial para cima, em cima do ágar água, incorporando o disco foliar no ágar.
NOTA: Minimizar a exposição da superfície do ágar. - Depois que o ágar de água se solidificar completamente, feche a tampa da placa de Petri.
NOTA: Abra a tampa para vaporização de água se muitas gotículas estiverem se condensando na tampa imediatamente. - Coloque 20 adultos ápteros no disco foliar.
NOTA: Recomenda-se operar sob um estereomicroscópio para evitar danos às suas peças bucais.
- Inoculação e observação de PFE
- Abra a tampa da câmara de inoculação e pulverize 0,3 mL de suspensão de conídios (a partir do passo 3.2) diretamente sobre os pulgões e o disco foliar a partir de cerca de 15 cm acima do disco foliar.
NOTA: Vórtice a suspensão de conídios novamente antes da pulverização. As áreas de pulverização devem ser testadas antes do experimento, pois podem variar entre diferentes pulverizadores. Neste caso, recomenda-se 0,3 mL com 15 cm de distância. A área de pulverização deve cobrir todo o disco foliar, e uma fina camada de suspensão de conídios deve cobrir o disco foliar. Se as gotículas convergirem para água parada na folha, o volume de inoculação deve ser diminuído. Limpar a mesa com etanol 70% antes da inoculação e entre os diferentes isolados. - Espere a suspensão de conídios secar e, em seguida, feche a tampa para evitar que os pulgões da mostarda se afoguem.
NOTA: Os pulgões raramente vagam durante o experimento; No entanto, garantir que os pulgões não escapem ainda é necessário. - Selar a câmara de inoculação com filme de parafina para manter alta umidade relativa do ar e colocar a câmara de inoculação em estufa a 25 °C com fotoperíodo de 12:12 h (claro:escuro).
- Abra a tampa da câmara de inoculação para contar a mortalidade sob um estereomicroscópio a cada 12 h por 5 dias.
- Limpe a melada aderida à capa com um papel toalha e remova os pulgões recém-surgidos com um pincel de pintura fina. Limpe a tampa com água da torneira a cada 24 h.
NOTA: O período de observação pode variar para diferentes espécies de afídeos com base na longevidade adulta. - Manter o cadáver no disco foliar para micose para confirmar o sucesso da inoculação.
- Abra a tampa da câmara de inoculação e pulverize 0,3 mL de suspensão de conídios (a partir do passo 3.2) diretamente sobre os pulgões e o disco foliar a partir de cerca de 15 cm acima do disco foliar.
- Confirmação da taxa de germinação de conídios
Observação : esta etapa é opcional. Confirmar a taxa de germinação de conídios par a par ao realizar a triagem de virulência para garantir a atividade dos conídios.- Soltar uma gota de 5 μL de suspensão de conídios em 1/4 de SDA por três repetições.
- Após 18 h, calcular a taxa de germinação com o microscópio de luz. Contar pelo menos 100 esporos aleatoriamente em uma única gota para confirmar a taxa de germinação do fungo.
OBS: Normalmente, a taxa de germinação dos isolados utilizados no experimento deve ser superior a 90%.
5. Bioensaio de isolados selecionados de PFE
NOTA: Isolados de PFE que apresentaram alta virulência, selecionados a partir da etapa 4, foram submetidos a um bioensaio contra pulgões mostarda usando quatro concentrações de suspensões de conídios (variando de 104 a 107 conídios/mL).
- Preparação da suspensão de conídios
- Repita a etapa 3.1 para recuperar os isolados de FPE selecionados.
- Repetir o passo 3.2 para preparar quatro concentrações de suspensão de conídios, incluindo 104, 105,10 6 e 107 conídios/ml.
- Preparação de adultos recém-emergidos
- Repita a etapa 4.1 para preparar adultos recém-emergidos.
- Preparo da câmara de inoculação
- Repita a etapa 4.1. preparar a câmara de inoculação.
- Inoculação e observação de PFE
- Repita a etapa 4.3. realizar a inoculação e observação do PFE com as quatro concentrações de suspensão de conídios, respectivamente.
6. Análise estatística
- Cálculo da mortalidade corrigida
- Calcule a mortalidade corrigida usando a fórmula25 de Abbott, conforme mostrado abaixo:
Mortalidade corrigida (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
MT representa a mortalidade do grupo de tratamento e MC representa a mortalidade do grupo controle.
NOTA: A mortalidade do grupo controle não deve ser superior a 20%. - Abra a plataforma de software SPSS (consulte Tabela de Materiais), crie variáveis incluindo "tratamento" e "cor_mor" (representando mortalidade corrigida) e insira os resultados calculados para a inoculação de diferentes isolados no mesmo ponto de tempo com a mesma concentração inoculada.
- Selecione Analisar, Comparar Médias e Proporções, Teste T para Amostras Independentes no SPSS para análise independente do teste t .
- No SPSS, insira o tratamento na caixa "Variável de Agrupamento" e cor_mor na(s) "Variável(is) de teste". Definir grupos por diferentes isolados fúngicos. Pressione OK para analisar.
- Calcule a mortalidade corrigida usando a fórmula25 de Abbott, conforme mostrado abaixo:
- Cálculo do tempo letal mediano (LT 50) e da concentração letal mediana (CL50)
- Abra o SPSS, crie as variáveis "total", "resposta" e "duração"/"concentração" e insira o resultado registrado na planilha.
- Selecione Analisar, Regressão, Probit no SPSS para calcular LT 50 e/ou LC50.
NOTA: Se a mortalidade cumulativa não exceder 50% eventualmente, LT 50 e/ou LC50 não podem ser estimados. - Total de entrada na caixa "Total observado", resposta na caixa "Frequência de resposta", duração/concentração na caixa "Covariável(is)". Pressione OK para analisar.
Observação : geralmente, pressione Opções e defina o "Nível de significância para uso do fator de heterogeneidade" como 0,05.
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Representative Results
O fluxograma apresentado ilustra a condição estável dos pulgões da mostarda desde a coleta de campo até a triagem de virulência. A manutenção dos pulgões a partir da coleta no campo garantiu um aumento estável de colônias de afídeos com um suprimento alimentar adequado. Os pulgões coletados em campo foram confirmados como pulgões mostarda através do uso de marcadores moleculares, incluindo tamanho do amplicon por PCR e sequenciamento de LeCO1. A triagem de virulência, realizada pelo método das folhas destacadas, revelou uma taxa de sobrevivência consistente para pulgões mostarda, com o grupo controle exibindo uma taxa de sobrevivência de 85% (Figura 4).
Durante a triagem de virulência, o Cc-NCHU-213 demonstrou a capacidade de matar pulgões mais rápidos, resultando em mortalidades de 50% e 90% aos 3 dias e 4,5 dias pós-inoculação (d.p.i.), respectivamente (Figura 4). No entanto, diferentes habilidades de matar afídeos foram observadas entre os cinco isolados de B. bassiana. Bb-NCHU-141, -143 e -153 exibiram lenta capacidade de matar afídeos, com apenas 5% de mortalidade em 3 d.p.i., mesmo quando excluídos os efeitos da pulverização de 0,03% de Tween 80 ou outros fatores letais (Figura 4). Assim, a fórmula da mortalidade corrigida foi empregada para normalizar a mortalidade controle. A maioria dos isolados de PFE contra pulgões mostarda exibiu mortalidade corrigida superior a 70% em 5 d.p.i., exceto para Pl-NCHU-152 (Tabela 3). Dentre esses isolados de PFE, o Bb-NCHU-286 demonstrou a maior taxa de mortalidade de 100% (Tabela 3). Adicionalmente, micose por PFE foi observada em cadáveres de pulgões mostarda infectados com Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum e Cordyceps cateniannulata durante a triagem de virulência, indicando a eficácia desse sistema (Figura 5).
Com base nos resultados da triagem de virulência, dois isolados de PFE, Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213, exibindo rápida atividade de matança de insetos (40% e 50% de mortalidade a 3 d.p.i., respectivamente), foram selecionados para bioensaio contra pulgões da mostarda. Os resultados demonstraram mortalidades corrigidas significativamente diferentes para Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 em 3 e 4 d.p.i. com inoculação de 107 conídios/mL (Figura 6). No ensaio de LT50, o tratamento com 10a 7 conídios/mL de Cc-NCHU-213 apresentou duração significativamente menor em relação aos demais tratamentos (Tabela 4). Além disso, o valor da CL50 de Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) foi menor que o de Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), indicando que o Cc-NCHU-213 possui maior virulência contra pulgões mostarda (Tabela 5).
Figura 1: Fluxograma experimental para triagem da virulência do PFE contra pulgões da mostarda. (A) Estabelecimento de um sistema de criação de pulgões de mostarda. (B) Elaboração do FPE. (C) Inoculação fúngica. (D) Análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Eletroforese do DNA genômico do pulgão mostarda amplificado com os primers A05Le e Le CO1. A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1%. M = 100 pb de escada de DNA; bp = pares de bases. O asterisco vermelho indica a curvatura alvo da amplificação da PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diferenças entre ninfas ápteras de quarto ínstar e pulgões adultos de mostarda. (A) Ninfa de quarto ínstar. (B) Adulto. As tíbias das patas traseiras da ninfa de quarto ínstar são esbranquiçadas (marcadas com seta vermelha). Pulgões recém-emergidos foram removidos por escova de camelo fino durante testes de virulência. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mapa térmico de mortalidade de 13 isolados de PFE contra pulgões da mostarda pelo método das folhas destacadas. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 5: Observação de micose fúngica de 13 isolados de PFE. Mepe-NCHU-2 = Mênfigo de Metarhízio; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Mortalidade corrigida dos isolados fúngicos Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 contra pulgão mostarda. As barras de erro representam o desvio padrão (DP). As mortalidades de Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 no mesmo momento com a mesma concentração inoculada foram comparadas usando o teste t independente, e as mortalidades marcadas com um asterisco foram significativamente diferentes (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Isolar | Espécie | Host ou origem* | Localização |
| Mp-NCHU-2 | Márhizio pênfigo | solo | Yilan |
| Ml-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | solo | Yilan |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | solo | Yilan |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | solo | Taichung |
| BB-NCHU-141 | Beauveria bassiana | Hipotenemus hampei | Chiayi |
| BB-NCHU-143 | Beauveria bassiana | Hipotenemus hampei | Chiayi |
| Pl-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | Tessaratoma papilosa | Chiayi |
| BB-NCHU-153 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua |
| BB-NCHU-157 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua |
| MB-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | solo | Taichung |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | solo | Taichung |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | | solo | Taichung |
| BB-NCHU-286 | Beauveria bassiana | Cerambycidae | Taichung |
Tabela 1: Isolados de PFE utilizados neste estudo.
| Nome da cartilha | Sequência (5' - 3') | Tamanho do produto (bp) | Referência | |
| A05Le | F-GGGTCTTGGATGGTGTGGTG | 953 | [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Este estudo | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
Tabela 2: Pares de primers utilizados para identificação molecular de pulgões da mostarda.
| Isolar | Espécie | Mortalidade corrigida (%) |
| Mp-NCHU-2 | Márhizio pênfigo | 76.47 |
| Ml-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | 82.35 |
| Mp-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| BB-NCHU-141 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| BB-NCHU-143 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Pl-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | 35.29 |
| BB-NCHU-153 | Beauveria bassiana | 82.35 |
| BB-NCHU-157 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| MB-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | 76.47 |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 88.24 |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | | 94.12 |
| BB-NCHU-286 | Beauveria bassiana | 100.00 |
Tabela 3: Taxas de mortalidade corrigida de 13 isolados de PFE contra pulgões mostarda aos 5 dias após a inoculação (d.p.i.).
| Isolar | Espécie | Conc.(conídios/mL) | N* | LT50 (dias)† | Limites de confiança de 95% | Inclinação (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 104 | 60 | 3.816 a | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 | 60 | 3.112 bd | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2,908 b | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 °C | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | | 104 | 60 | 3.948 a | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 | 60 | 3.237 d | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 C | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 e | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Número de insetos observados. | |||||||
| Os valores de †LT50 marcados com letras diferentes foram considerados significativamente diferentes, pois seus limites de confiança de 95% não se sobrepuseram. | |||||||
| ‡X2, valor do qui-quadrado no teste de bondade de ajuste de Pearson; df, graus de liberdade | |||||||
Tabela 4: Valores de LT50 dos isolados fúngicos Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 contra pulgões mostarda sob diferentes concentrações de conídios. *Número de insetos observados. †LL50 valores marcados com letras diferentes foram considerados significativamente diferentes, pois seus limites de confiança de 95% não se sobrepuseram. ‡X2, valor do qui-quadrado no teste de bondade de ajuste de Pearson; df, graus de liberdade.
| Isolar | Espécie | N* | CL50 (conídios/mL)† | Limites de confiança de 95% | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 240 | 2.30 × 105 A | 8,63 × 104–5,70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | | 240 | 9,32 × 104 a | 4,97 × 104–1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Número de insetos observados. | ||||||
| †Os valores de CL50 marcados com letras diferentes foram considerados significativamente diferentes, pois seus limites de confiança de 95% não se sobrepuseram. | ||||||
| ‡X2, valor do qui-quadrado no teste de bondade de ajuste de Pearson; df, graus de liberdade | ||||||
Tabela 5: Valores de CL50 dos isolados fúngicos Mb-NCHU-197 e Cc-NCHU-213 contra pulgões mostarda. *Número de insetos observados. †LC50 valores marcados com letras diferentes foram considerados significativamente diferentes, pois seus limites de confiança de 95% não se sobrepuseram. ‡X2, valor do qui-quadrado no teste de bondade de ajuste de Pearson; df, graus de liberdade.
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Discussion
As crucíferas, um grupo de vegetais, são frequentemente infestadas por várias espécies de afídeos, incluindo o pulgão da mostarda (L. erysimi) e o pulgão do repolho (Brevicoryne brassicae)26. Ambas as espécies foram relatadas em Taiwan27, e é possível que coexistam no local de coleta. Para distinguir espécies de afídeos estreitamente relacionadas, este estudo empregou uma técnica de identificação molecular usando um conjunto de primers multiplex21. Através do desenho de um marcador molecular a partir do fragmento do gene COI do pulgão da mostarda, identificamos com sucesso o pulgão da mostarda, confirmando assim a confiabilidade do marcador molecular A05Le para este fim21.
As observações revelaram que distinguir entre ninfas ápteras de quarto ínstar e pulgões adultos de mostarda com base apenas em seu tamanho ou morfologia é desafiador sem experiência. No entanto, uma característica distintiva crucial é a tíbia das patas traseiras, que aparece branca nas ninfas de quarto ínstar, mas não nos adultos (Figura 3). Estudos prévios sobre L. attenuatum, B. bassiana contra pulgões do algodoeiro e M. brunneum contra pulgões verdes do pessegueiro demonstraram que a muda pode ser uma estratégia para evitar a infecção28,29,30. Portanto, a identificação errônea dos estágios do afídeo pode levar a erros na avaliação da virulência, uma vez que a muda pode afetar a eficácia do PFE28,29,31. Para resolver essa questão e garantir maior precisão e precisão na avaliação da virulência, exclua pulgões com porções esbranquiçadas na tíbia da pata traseira que não tenham atingido a fase adulta, a menos que intencionalmente usem ninfas de afídeos. Esses pulgões não amadurecem completamente e podem sofrer muda, o que poderia permitir que eles escapassem do processo de infecção do PFE. Além disso, recomenda-se um curso de tempo de observação e registro de dados a cada 12 h. O intervalo de 12 h é preferível para demonstrar diferenças entre múltiplos isolados promissores com habilidades semelhantes de matar afídeos e facilita o cálculo preciso do LT50. No entanto, o intervalo de tempo pode ser ajustado com base nos diferentes ciclos de vida de outras espécies de insetos ou determinado através de um pré-teste em pequena escala.
Embora o método das folhas destacadas possa deixar mínima melada no disco foliar, a maior parte da melada adere à cobertura da placa de Petri, uma vez que o disco foliar está muito próximo. Pode ser limpo ou lavado durante o período de observação. No entanto, a melada está, sem dúvida, presente no ambiente prático de cultivo quando os pulgões invadem32. A melada presente na câmara de inoculação pode, de certa forma, simular a situação quando o PFE é inoculado em pulgões no campo. As cutículas dos pulgões contêm principalmente melada, que serve como fonte de nutrientes para o fungo e pode estimular a germinação do PFE16. Assim, a combinação da aplicação de FPE e produção de melada pelos pulgões pode ser vantajosa.
Para confirmar que a morte do afídeo é devida à infecção, os cadáveres são tipicamente transferidos da câmara de inoculação do PFE para papel de filtro úmido ou meio de cultura para observação do crescimento fúngico 11,14,33,34. No entanto, neste estudo, ágar-d'água foi utilizado na câmara de inoculação para manter alta umidade, permitindo que os cadáveres de afídeos permanecessem nas folhas sem a necessidade de serem movidos para observação do crescimento fúngico. Embora o método das folhas destacadas forneça informações sobre o efeito afidicida dos isolados de FPE, ele ainda apresenta limitações. O ágar-d'água usado para manter a condição do disco foliar pode fazer com que os pulgões fiquem presos enquanto se movem na câmara de inoculação. Para resolver essa questão, a porcentagem de ágar água foi aumentada para 3%, fornecendo uma superfície firme o suficiente para os pulgões de trigo russos (Diuraphis noxia) andarem em20. Neste experimento, os pulgões da mostarda foram capazes de mover-se confortavelmente em superfícies de ágar-água com concentrações variando de 1,5% a 3%. No entanto, à medida que o período de observação progrediu, alguns pulgões ficaram presos de cabeça para baixo com as pernas para cima e tiveram que ser resgatados de volta ao disco foliar. Isso pode ser devido às diferenças no tamanho ou mobilidade do pulgão, indicando que aumentar a concentração de ágar sozinho pode não resolver o problema. Portanto, certifique-se de que o disco foliar cubra totalmente a superfície do ágar usando uma folha que se ajuste mais confortavelmente ao tamanho da placa de Petri, o que pode ajudar a aliviar esse problema. Em comparação com o método das folhas destacadas descrito por Yokomi e Gottwald18, este estudo melhorou um aspecto ao utilizar um tamanho de folha que é aproximadamente adequado para a placa de Petri. Isso permite a quantificação relativa do consumo alimentar e minimiza a superfície exposta do ágar. Além disso, a folha precisa ser "embutida" no ágar-d'água semi-solidificado, enquanto na referência original foi descrita como "colocada" no ágar-d'água18. A incorporação do disco foliar no ágar-d'água reduz a probabilidade de os pulgões ficarem presos à superfície do ágar e facilita a observação, já que os pulgões estão confinados a um dos lados.
Este protocolo fornece instruções detalhadas sobre como proceder com o método de folhas destacadas e inoculação de PFE, juntamente com algumas modificações que facilitaram as operações, observações e resultados consistentes. Também estabelece um método padronizado para a seleção de isolados de FPE contra pragas sugadoras de plantas em condições de laboratório. Além disso, a realização de uma verificação padrão com produtos conhecidos eficazes ou comercialmente disponíveis pode ser realizada para a futura comercialização de isolados de FPE.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses envolvidos neste trabalho.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo 109-2313-B-005 -048 -MY3 do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
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