Summary
Данный протокол представляет собой оптимизированную систему биотестирования с отрывными листьями для оценки эффективности энтомопатогенных грибов (EPF) против партеногенетического насекомого горчичной тли (Lipaphis erysimi (Kalt.)). Метод описывает процесс сбора данных во время экспериментов с чашкой Петри, что позволяет исследователям последовательно измерять вирулентность EPF против горчичной тли и других партеногенетических насекомых.
Abstract
Горчичная тля (L. erysimi) – вредитель, поражающий различные крестоцветные культуры и передающий вирусы растений. Для достижения экологически чистой борьбы с вредителями энтомопатогенные грибы (EPF) являются потенциальными микробными агентами для борьбы с этим вредителем. Поэтому перед полевым применением необходимо провести скрининг вирулентности изолятов EPF в условиях чашки Петри. Однако горчичная тля является партеногенетическим насекомым, что затрудняет запись данных во время экспериментов с чашкой Петри. Для решения этой проблемы была разработана модифицированная система для биопроб с отделившимися листьями, использующая микроопрыскиватель для инокуляции конидий на тлю и предотвращения утопления, облегчая сушку на воздухе после суспензии спор. Система поддерживала высокую относительную влажность на протяжении всего периода наблюдений, а листовой диск оставался свежим более десяти дней, что позволяло партеногенетического размножения тли. Для предотвращения наращивания потомства был реализован процесс ежедневного удаления с помощью малярной кисти. Этот протокол демонстрирует стабильную систему оценки вирулентности изолятов EPF против горчичной тли или других видов тли, что позволяет выбирать потенциальные изоляты для борьбы с тлей.
Introduction
Горчичная тля (L. erysimi) является печально известным вредителем, который поражает различные крестоцветные культуры, нанося значительный экономический ущерб1. Несмотря на то, что для борьбы с нашествием тлей было рекомендовано несколько систематических инсектицидов, частое использование этих инсектицидов вызывает опасения по поводу устойчивости к пестицидам 2,3. Таким образом, с точки зрения экологически чистой борьбы с вредителями, энтомопатогенные грибы (EPF) могут служить подходящей альтернативной стратегией борьбы. EPF является насекомым-патогеном, способным заражать хозяев, проникая в их кутикулу, что делает его мощным средством для борьбы с тлей и другими насекомыми, сосущими растения4. Кроме того, EPF зарекомендовал себя как осуществимый и устойчивый метод борьбы с вредителями, обеспечивающий такие преимущества, как антагонизм патогенов растений и стимулирование роста растений5.
EPF может быть получен путем травли насекомых или выделен из трупов насекомых в полевых условиях 6,7. Однако перед дальнейшим применением грибковых изолятов необходим скрининг патогенности. Было проведено несколько исследований эффективности EPF против тли, которая является значительным вредителем сельскохозяйственных культур, способным нанести серьезный ущерб 8,9. Горчичная тля, среди различных видов тли, была проверена на восприимчивость к нескольким штаммам Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. и даже Alternaria, который в первую очередь известен как сапрофитный и патогенный гриб для растений, но показал некоторые летальные эффекты против горчичной тли10,11,12.
Для оценки эффективности EPF против тли в лабораторных условиях биопробы можно разделить на две основные части: инокуляционная камера и грибковая инокуляция. В настоящем протоколе описывается строительство инокуляционной камеры, в которой тля может поддерживаться с помощью различных методов, таких как вырезанный лист с черешком, обернутым влажным хлопком, вырезанный листовой диск с чашкой Петри, выстланный влажной фильтровальной бумагой, непосредственное обслуживание горшечных растений или вырезанный листовой диск, погруженный в водный агар в чашке Петри или контейнере10. 11,13. Распространенные методы инокуляции грибов включают опрыскивание конидий, погружение тли в суспензию конидий, погружение листьев в суспензию конидий и инокуляцию эндофитов растений11,14,15,16. Несмотря на то, что существуют различные методы инокуляции, биотесты должны имитировать условия применения в полевых условиях. Например, в случае с методом окунания листьев12,17 можно оценить эффективность EPF, но поскольку тля поражает пораженные грибком листья, спинная сторона тли, которая является предпочтительным местом проникновения, обычно не подвергается воздействию грибка.
Для оценки афидицидного действия EPF в лабораторных условиях в данном протоколе предлагается использовать метод отрывных листьев, описанный Yokomi и Gottwald18, с некоторыми модификациями с последующей инокуляцией конидий с помощью микрораспылителя. Этот метод поддерживает примерно 100% влажность в биопробирной камере не менее семи дней, не требуя дополнительного пополнения водой18,19. Кроме того, ограничение тлей одной поверхностью обеспечивает их подверженность опрыскиванию конидиями и облегчает наблюдения20. Однако тля может застрять на открытой поверхности агара при перемещении внутри инокуляционной камеры. Кроме того, регистрация данных в эксперименте в чашке Петри с горчичными тлями, которые являются партеногенетическими насекомыми, может быть сложной задачей из-за их быстрого развития и размножения. Трудно отличить привитых взрослых особей от их потомства без изъятия. Детали того, как действовать на этом этапе, редко упоминаются, и некоторые противоречивые факторы, такие как площадь потребления листьев, должны быть оптимизированы.
Этот протокол демонстрирует стабильную систему скрининга вирулентности изолятов EPF против горчичной тли, что позволяет выбирать потенциальные изоляты против различных видов тлей из обширной библиотеки EPF. Можно идентифицировать тлю, собранную в полевых условиях, и создать достаточную лабораторную популяцию горчичной тли для оценки афидицидного действия различных грибковых изолятов с использованием простой и осуществимой методологии с последовательными результатами. Тля развила многочисленные эволюционные механизмы в ответ на интенсивное и повторяющееся антропогенное давление на агроэкосистемы, что создает проблемы для продовольственной безопасности9. Таким образом, описанный метод может быть расширен для оценки потенциальных изолятов EPF против различных видов тлей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная блок-схема показана на рисунке 1.
1. Сбор и уход за горчичной тлей
- Сбор горчичной тли
- Переверните листья и визуально проверьте наличие горчичной тли на крестоцветных культурах в поле.
- Запишите информацию о месте отбора проб (например, GPS) и растениях-хозяевах, а также подтвердите историю применения инсектицидов у фермеров.
- С помощью аспиратора насекомых или тонкой малярной кисти (см. Таблицу материалов) соберите около 50 горчичных тлей в центрифужную пробирку объемом 50 мл из крестоцветных культур в поле и доставьте образец в лабораторию в течение 3 часов.
- Подготовьте временную чашку Петри для поддержания с вырезанными листьями крестоцветных и фильтровальной бумагой, пропитанной водой, на дне.
- Поместите пять тлей на чашку Петри для временного содержания при комнатной температуре (25 ± 2 °C) с относительной влажностью 70% и фотопериодом 12:12 ч (свет:темнота) в течение 14 дней, чтобы убедиться, что тля избавлена от естественных врагов перед дальнейшим выращиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что тля, собранная в поле, свободна от естественных врагов, таких как паразитоидные осы или энтомопатогенные грибы, крайне важно убедиться в отсутствии этих организмов, прежде чем приступать к дальнейшему выращиванию.
- Содержание горчичной тли
ПРИМЕЧАНИЕ: Для борьбы с горчичной тлей используйте листья крестоцветных, не содержащие пестицидов (в том числе биопестицидов).- Обеспечьте стабильный и достаточный запас листьев крестоцветных (около 25 см2 ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретайте листья крестоцветных либо на рынке, либо выращивайте растения. Перед длительным массовым выращиванием горчичной тли можно было протестировать несколько различных видов крестоцветных, чтобы найти подходящего крестоцветного. После того, как вид крестоцветного листа закреплен, не меняйте его. В данном исследовании использовали комацуну (Brassica rapa var. perviridis) в фазе 6-7 листьев (см. таблицу материалов). Дополнительно утилизируйте 2-3 самых старых листа. - Добавьте воду до того, как фильтровальная бумага на дне полностью высохнет.
- Ежедневно наблюдайте за плотностью популяции горчичной тли. Популяция должна вырасти в 2-3 раза через 7 дней.
- Когда численность тли увеличится, разрежьте первоначально вырезанные листья с горчичной тлей на 4-6 более мелких частей и поместите каждый небольшой кусочек листа с горчичной тлей в одну чашку Петри со свежим вырезанным листом и фильтровальной бумагой, пропитанной водой.
- Поместите чашку Петри в инкубатор при температуре 25 °C с фотопериодом 12:12 ч (свет:темнота) и ежедневно наблюдайте за плотностью популяции горчичной тли.
- Удаляйте первоначальные вырезанные листья после того, как большая часть тли мигрирует на свежие вырезанные листья до того, как первоначальные листья сгниют.
- Обеспечьте стабильный и достаточный запас листьев крестоцветных (около 25 см2 ).
2. Молекулярная идентификация горчичной тли
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения вида горчичной тли, собранной в полевых условиях, была проведена молекулярная идентификация с использованием двух молекулярных маркеров: последовательности, охарактеризованной амплифицированной областью (SCAR) на основе A05Le, разработанной Lu et al.21, и участка 1-й субъединицы цитохромоксидазы горчичной тли (COI) горчичной тли.
- Выделение геномной ДНК горчичной тли
- Соберите примерно 50 тлей в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тля, используемая для молекулярной идентификации, должна быть потомками одной единственной тли, и различные стадии также могут быть объединены в одну и ту же пробирку для извлечения ДНК. - Гомогенизируйте тлю с помощью гранулированного пестика и извлеките ДНК с помощью набора для выделения геномной ДНК Gene-Spin в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
- Элюируют геномную ДНК с помощью 50 мкл предварительно нагретой воды, не содержащей нуклеаз.
- Соберите примерно 50 тлей в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- ПЦР-амплификация и секвенирование ДНК
- Амплифицировать целевые последовательности ДНК из геномной ДНК тли с помощью ПЦР Master Mix (2x) с парами праймеров A05LeF/A05LeR и LeCO1F/LeCO1R (таблица 1) с различными программами ПЦР21.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция ПЦР общим объемом 20 мкл состоит из матрицы геномной ДНК тли объемом 2 мкл, 1 мкл прямого и 1 мкл обратного праймеров, 10 мкл ПЦР Master Mix (см. таблицу материалов) и 6 мкл ddH2O. - Проводят ПЦР в амплификаторе (см. Таблицу материалов) по следующей программе: 94 °C в течение 5 мин, 25 циклов по 94 °C в течение 45 с, 61 °C (для A05LeF/A05LeR) и 58 °C (для LeCO1F/LeCO1R) в течение 45 с, 72 °C в течение 1 мин с последующим окончательным расширением 72 °C в течение 5 мин.
- Проанализируйте продукт ПЦР с помощью электрофореза в 1% агарозном геле для подтверждения идентичности горчичной тли (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пара праймеров A05LeF/A05LeR успешно амплифицирует правильный размер фрагмента ДНК, она убедительно идентифицирует собранную в поле тлю как горчичную тлю21. Пары праймеров приведены в таблице 2. - Очистите продукт ПЦР от ампликона COI горчичной тли с помощью коммерчески доступного набора для геля/ПЦР в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов) и секвенируйте продукт ПЦР с помощью коммерческой службы секвенирования.
- Амплифицировать целевые последовательности ДНК из геномной ДНК тли с помощью ПЦР Master Mix (2x) с парами праймеров A05LeF/A05LeR и LeCO1F/LeCO1R (таблица 1) с различными программами ПЦР21.
- Анализ последовательностей
ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно Lu et al.21, изгиб ДНК A05Le представляет собой специфичный для горчичной тли фрагмент ДНК; Таким образом, продукт A05Le PCR не нуждается в дополнительном секвенировании.- Проверьте качество считывания с помощью программного обеспечения Chromas (см. Таблицу материалов) после получения последовательности LeCO1.
- Обрежьте чтение низкого качества в восходящем и нисходящем потоках, открыв файл fasta (или txt) и удалив чтение низкого качества.
- Отправьте обрезанную последовательность в NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с параметрами по умолчанию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если размеры ампликонов наборов праймеров A05Le и LeCO1 верны, теоретически поиск последовательности по стандартным базам данных NCBI должен совпадать с выбором горчичной тли.
3. Приготовление энтомопатогенных грибов
ПРИМЕЧАНИЕ: EPF, использованный в данном исследовании, приведен в таблице 1.
- Извлечение EPF из библиотеки грибов
- Разморозьте консервированные грибы (конидии, взвешенные в 30% глицерине) из морозильной камеры при температуре -80 °C.
- Переложите небольшое количество (примерно 10 мкл) суспензии конидий на планшет 6 см 1/4 декстрозного агара Сабуро (SDA) (0,75 г бульона декстрозы Сабуро с 1,5 г агара на 100 мл ddH2O) и равномерно распределите ее с помощью клеточного разбрасывателя в ламинарном проточном колпаке.
- Чашку Петри запечатайте парафиновой пленкой и выдержите в темноте при температуре 25 °C в течение 10-14 дней.
- Повторное культивирование грибных изолятов путем разбрызгивания грибковой массы на планшете 1/4 SDA и инкубации грибов в темноте при 25 °C в течение 10-14 дней перед сбором22 конидий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Грибковую культуру следует использовать примерно за 10 дней до инокуляции тли. Культуру EPF, возраст которой превышает 14 дней, не рекомендуется использовать в тесте на вирулентность.
- Приготовление суспензии конидий
- Соскоблить конидии с 10-14-дневной культуры грибов на 1/4 планшета SDA путем инокуляции петлей после добавления 2-3 мл 0,03% Tween 80 (см. Таблицу материалов).
- Соберите грибковую суспензию в центрифужную пробирку.
- Встряхните раствор с наибольшей скоростью, подсчитайте количество конидий с помощью гемоцитометра под световым микроскопом и доведите концентрацию суспензии конидий до10-8 конидий/мл.
- Перелейте суспензию конидий в микрораспылитель, стерилизованный ультрафиолетовым излучением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переносом снова взболтайте суспензию конидий, так как конидии склонны к выпадению осадка. Перед использованием микроопрыскиватель должен подвергаться воздействию ультрафиолетового излучения в ламинарном колпаке в течение 30 минут.
4. Скрининг вирулентности против горчичной тли
- Подготовка вновь появившихся взрослых особей
- Переместите акрылых (без крыльев) и алатных (крылатых) взрослых особей из чашки Петри на свежесрезанные листья, чтобы воспроизвести новое потомство того же возраста. Удаляют взрослых особей через 24 ч, чтобы избежать скученности и свести к минимуму производство алированного потомства23,24. В дальнейших экспериментах будут использоваться только взрослые особи.
- Выращивают потомство до взрослой стадии и удаляют потомство, которое не развивается во взрослую стадию через 48 ч (рис. 3), чтобы предотвратить возрастные различия между тлями для эксперимента. Дополнительно удаляют взрослых особей.
- Подготовка камеры для инокуляции
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала подготовить крестоцветные листья диаметром 9 см, чтобы листовой диск можно было погрузить в водный агар до затвердевания.- Очистите листья крестоцветных водопроводной водой, удалите грязь и остатки, а также любых других членистоногих, если таковые имеются.
- Вытрите излишки воды бумажным полотенцем и проверьте, нет ли других членистоногих на поверхности листьев крестоцветных с помощью стереомикроскопа. Удалите всех членистоногих, если таковые имеются.
- Вырежьте листовой диск диаметром 9 см, либо непосредственно надавливая нижней чашкой Петри на лист в качестве формы, либо с помощью ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если листья меньше 9 см в диаметре, соедините пару вырезанных листьев. - Приготовьте 1,5% водный агар для каждой чашки Петри, нагревая и растворяя 450 мг агара (см. таблицу материалов) в 30 мл ddH2O с помощью микроволновой печи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество 1,5% водного агара может быть скорректировано в зависимости от масштаба эксперимента. - Залейте 30 мл 1,5% водного агара в чашку Петри диаметром 9 см до застывания в ламинарном колпаке, а затем подождите, пока агар остынет до ~40 °C, пока поверхность агара не затвердеет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, не затвердела ли поверхность, осторожно горизонтально встряхнув чашку Петри. - Поместите листовой диск абаксиальной поверхностью вверх поверх водного агара, заглубляя листовой диск в агар.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сведите к минимуму воздействие на поверхность агара. - После того, как водный агар полностью застынет, закройте крышку чашки Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте крышку для испарения воды, если на крышке сразу же конденсируется много капель. - Поместите 20 взрослых особей на диск листа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать под стереомикроскопом, чтобы предотвратить повреждение ротового аппарата.
- Инокуляция EPF и наблюдение
- Откройте крышку инокуляционной камеры и распылите 0,3 мл суспензии конидий (с шага 3.2) непосредственно на тлю и листовой диск с высоты около 15 см над листовым диском.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед распылением снова взбейте суспензию конидий. Перед экспериментом следует проверить зоны опрыскивания, так как они могут различаться у разных опрыскивателей. В этом случае рекомендуется 0,3 мл на расстоянии 15 см. Зона опрыскивания должна покрывать весь листовой диск, а листовой диск должен покрываться тонким слоем суспензии конидий. Если капли сходятся в стоячей воде на листе, объем прививки следует уменьшить. Очистите стол 70% этанолом перед инокуляцией и между использованием различных изолятов. - Подождите, пока суспензия конидий высохнет, а затем закройте крышку, чтобы не утонула горчичная тля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тля редко бродит во время эксперимента; Тем не менее, следить за тем, чтобы тля не сбежала, все же необходимо. - Загерметизируйте инокуляционную камеру парафиновой пленкой для поддержания высокой относительной влажности и поместите инокуляционную камеру в инкубатор при температуре 25 °C с фотопериодом 12:12 ч (свет:темнота).
- Откройте крышку инокуляционной камеры для подсчета смертности под стереомикроскопом каждые 12 ч в течение 5 дней.
- Вытрите прилипшую к покрытию медвяную росу бумажным полотенцем и удалите вновь появившуюся тлю тонкой малярной кистью. Промывайте крышку водопроводной водой каждые 24 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Период наблюдения может варьироваться для разных видов тли в зависимости от продолжительности жизни взрослых особей. - Держите труп на листовом диске на микоз, чтобы подтвердить успешную инокуляцию.
- Откройте крышку инокуляционной камеры и распылите 0,3 мл суспензии конидий (с шага 3.2) непосредственно на тлю и листовой диск с высоты около 15 см над листовым диском.
- Подтверждение всхожести конидий
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным. Подтвердить скорость прорастания конидий попарно при проведении скрининга вирулентности для обеспечения активности конидий.- Капните одну каплю суспензии конидий объемом 5 мкл на 1/4 SDA для трех репликаций.
- Через 18 ч рассчитайте всхожесть с помощью светового микроскопа. Подсчитайте случайным образом не менее 100 спор в одной капле, чтобы подтвердить скорость прорастания грибка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, всхожесть изолятов, используемых в эксперименте, должна быть выше 90%.
5. Биотестирование отобранных изолятов EPF
ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляты EPF, показавшие высокую вирулентность, которые были отобраны на этапе 4, были подвергнуты биотесту против горчичной тли с использованием четырех концентраций суспензий конидий (в диапазоне от 104 до 107 конидий/мл).
- Приготовление суспензии конидий
- Повторите шаг 3.1 для восстановления выбранных изолятов EPF.
- Повторите шаг 3.2 для приготовления суспензии конидий в четырех концентрациях, включая 104, 105,10 6 и 107 конидий/мл.
- Подготовка вновь появившихся взрослых особей
- Повторите шаг 4.1, чтобы подготовить только что появившихся взрослых.
- Подготовка камеры для инокуляции
- Повторите шаг 4.1. подготовить инокуляционную камеру.
- Инокуляция EPF и наблюдение
- Повторите шаг 4.3. провести посев EPF и наблюдение с четырьмя концентрациями суспензии конидий соответственно.
6. Статистический анализ
- Расчет скорректированной смертности
- Рассчитайте скорректированную смертность, используя формулу25 Эбботта, как показано ниже:
Скорректированная смертность (%) = [(MT− MC) × 100%] / (100− MC)
MT представляет смертность в группе лечения, а MC представляет смертность в контрольной группе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смертность контрольной группы не должна быть выше 20%. - Откройте программную платформу SPSS (см. таблицу материалов), создайте переменные, включающие "treatment" и "cor_mor" (представляющие скорректированную смертность), и введите расчетные результаты для инокуляции разных изолятов в один и тот же момент времени с одинаковой концентрацией инокуляции.
- Выберите Analyze, Compare Mean and Proportions, Independent-Samples T Test в SPSS для независимого t-критерия.
- В SPSS введите обработку в поле "Grouping Variable" и cor_mor в поле "Test Variable(s)". Определите группы по различным грибным изолятам. Нажмите OK для анализа.
- Рассчитайте скорректированную смертность, используя формулу25 Эбботта, как показано ниже:
- Расчет медианы летального времени (LT 50) и медианной летальной концентрации (LC50)
- Откройте SPSS, создайте переменные "total", "response" и "duration"/"concentration" и введите записанный результат в электронную таблицу.
- Выберите Analyze, Regression, Probit в SPSS, чтобы вычислить LT 50 и/или LC50.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если кумулятивная смертность в конечном итоге не превышает 50%, LT 50 и/или LC50 не могут быть оценены. - Введите итог в поле "Total Observed", отклик в поле "Response Frequency", длительность/концентрация в поле "Covariate(s)". Нажмите OK для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, нажмите « Параметры » и установите «Уровень значимости для использования коэффициента гетерогенности» на 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленная блок-схема иллюстрирует стабильное состояние горчичной тли от полевого сбора до скрининга вирулентности. Содержание тли от полевого сбора обеспечило стабильный рост колоний тлей при достаточной кормовой базе. Тля, собранная в полевых условиях, была подтверждена как горчичная тля с помощью молекулярных маркеров, включая размер ампликона ПЦР и секвенирование LeCO1. Скрининг вирулентности, проведенный с использованием метода отрывных листьев, показал стабильную выживаемость горчичной тли, при этом контрольная группа показала 85% выживаемости (рис. 4).
Во время скрининга вирулентности Cc-NCHU-213 продемонстрировал самую быструю способность убивать тлю, что привело к 50% и 90% смертей через 3 и 4,5 дня после инокуляции (d.p.i.) соответственно (рис. 4). Тем не менее, различные способности к уничтожению тли наблюдались среди пяти изолятов B. bassiana. Bb-NCHU-141, -143 и -153 демонстрировали медленную способность к уничтожению тли, со смертностью только 5% при 3 d.p.i., даже если исключить эффекты 0,03%-ного распыления Tween 80 или других летальных факторов (рис. 4). Таким образом, скорректированная формула смертности была использована для нормализации контрольной смертности. Большинство изолятов EPF против горчичной тли показали скорректированные показатели смертности выше 70% в течение 5 d.p.i., за исключением Pl-NCHU-152 (табл. 3). Среди этих изолятов EPF Bb-NCHU-286 продемонстрировал самый высокий уровень смертности – 100% (табл. 3). Кроме того, микоз EPF наблюдался на трупах горчичной тли, инфицированных Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum и Cordyceps cateniannulata во время скрининга вирулентности, что свидетельствует об эффективности этой системы (рис. 5).
По результатам скрининга вирулентности для биотестирования против горчичной тли были отобраны два изолята EPF, а именно Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213, обладающие быстрой активностью по уничтожению насекомых (40% и 50% смертности при 3 d.p.i. соответственно). Результаты показали достоверно различающиеся скорректированные показатели смертности для Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 при 3 и 4 d.p.i. при посеве 107 конидий/мл (рис. 6). В анализе LT50 лечение 107 конидиями/мл Cc-NCHU-213 показало значительно меньшую продолжительность по сравнению с другими методами лечения (табл. 4). Кроме того, значение LC50 Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) было ниже, чем у Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), что указывает на то, что Cc-NCHU-213 обладает большей вирулентностью против горчичной тли (табл. 5).
Рисунок 1: Экспериментальная блок-схема скрининга вирулентности EPF против горчичной тли. (А) Создание системы разведения горчичной тли. (B) Подготовка EPF. (C) Грибковая инокуляция. (D) Статистический анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Электрофорез геномной ДНК горчичной тли, амплифицированной наборами праймеров A05Le и Le CO1. Электрофорез проводили на 1% агарозном геле. M = 100.н. ДНК-лестница; bp = пары оснований. Красной звездочкой обозначен изгиб цели амплификации ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Различия между нимфой четвертого возраста и взрослой горчичной тлей . (А) Нимфа четвертого возраста. (Б) Взрослый. Голени задних ног нимфы четвертого возраста беловатые (отмечены красной стрелкой). Вновь появившаяся тля удалялась мелким верблюжьим кустарником во время тестов на вирулентность. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Тепловая карта смертности 13 изолятов EPF против горчичной тли методом отрывных листьев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Наблюдение грибкового микоза 13 изолятов EPF. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemphigi; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Скорректированная смертность грибковых изолятов Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 против горчичной тли. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение (SD). Смертность от Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 в один и тот же момент времени с одинаковой концентрацией прививки сравнивали с помощью независимого t-критерия, и смертность, отмеченная звездочкой, достоверно отличалась (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Изолировать | Вид | Хост или источник* | Местоположение |
| МП-НЧУ-2 | Метаризиум пемфиги (Metarhizium pemphigi) | почва | Илань |
| МЛ-НЧУ-9 | Metarhizium lepidiotae (Метаризиум лепидиота) | почва | Илань |
| МП-НЧУ-11 | Metarhizium pinghaense (Метаризиум пингаенсе) | почва | Илань |
| Ба-НЧУ-113 | Боверия австралийская (Beauveria australis) | почва | Тайчжун |
| ББ-НЧУ-141 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | Hypothenemus hampei (Гипотенемус хампей) | Цзяи |
| ББ-НЧУ-143 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | Hypothenemus hampei (Гипотенемус хампей) | Цзяи |
| ПЛ-НЧУ-152 | Пурпуроциллиум сиреневой (Purpureocillium lilacinum) | Тессаратома папиллоза | Цзяи |
| ББ-НЧУ-153 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | Rhynchophorus ferrugineus (Ринхофорус железистый) | Чунхуа |
| ББ-НЧУ-157 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | Rhynchophorus ferrugineus (Ринхофорус железистый) | Чунхуа |
| МБ-НЧУ-196 | Метаризиум баошаненсе (Metarhizium baoshanense) | почва | Тайчжун |
| МБ-НЧУ-197 | Метаризиум баошаненсе (Metarhizium baoshanense) | почва | Тайчжун |
| КК-НЧУ-213 | Кордицепс cateniannulata | почва | Тайчжун |
| ББ-НЧУ-286 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | Церамбициды (Cerambycidae) | Тайчжун |
Таблица 1: Изоляты EPF, использованные в данном исследовании.
| Название праймера | Последовательность (5' - 3') | Размер продукта (д..) | Ссылка | |
| А05Ле | F-GGGTCTTGGATGGTGTGTGTGTG | 953 | Lu et al. [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| ЛеСО1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Данное исследование | |
| Р-АЦГТАГТАААТГАГКААК | ||||
Таблица 2: Пары праймеров, используемые для молекулярной идентификации горчичной тли.
| Изолировать | Вид | Скорректированная смертность (%) |
| МП-НЧУ-2 | Метаризиум пемфиги (Metarhizium pemphigi) | 76.47 |
| МЛ-НЧУ-9 | Metarhizium lepidiotae (Метаризиум лепидиота) | 82.35 |
| МП-НЧУ-11 | Metarhizium pinghaense (Метаризиум пингаенсе) | 76.47 |
| Ба-НЧУ-113 | Боверия австралийская (Beauveria australis) | 82.35 |
| ББ-НЧУ-141 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | 88.24 |
| ББ-НЧУ-143 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | 88.24 |
| ПЛ-НЧУ-152 | Пурпуроциллиум сиреневой (Purpureocillium lilacinum) | 35.29 |
| ББ-НЧУ-153 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | 82.35 |
| ББ-НЧУ-157 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | 88.24 |
| МБ-НЧУ-196 | Метаризиум баошаненсе (Metarhizium baoshanense) | 76.47 |
| МБ-НЧУ-197 | Метаризиум баошаненсе (Metarhizium baoshanense) | 88.24 |
| КК-НЧУ-213 | Кордицепс cateniannulata | 94.12 |
| ББ-НЧУ-286 | Боверия Бассиана (Beauveria bassiana) | 100.00 |
Таблица 3: Скорректированные показатели смертности 13 изолятов EPF против горчичной тли через 5 дней после инокуляции.
| Изолировать | Вид | Конк.(конидии/мл) | N* | LT50 (дней)† | Доверительные ограничения 95% | Уклон (SE) | X2 (df)‡ |
| МБ-НЧУ-197 | Метаризиум баошаненсе (Metarhizium baoshanense) | 104 | 60 | 3,816 А | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 | 60 | 3.112 сд | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.908 млрд | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 С | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| КК-НЧУ-213 | Кордицепс cateniannulata | 104 | 60 | 3,948 А | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 | 60 | 3.237 д. | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 С | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 в | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Количество наблюдаемых насекомых. | |||||||
| Значения †LT50, отмеченные разными буквами, считались существенно отличающимися, так как их 95%-ные доверительные границы не перекрывались. | |||||||
| ‡X2 — значение хи-квадрат в критерии пригодности Пирсона; df, степени свободы | |||||||
Таблица 4: Значения LT50 грибных изолятов Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 против горчичной тли при различных концентрациях конидий. *Количество наблюдаемых насекомых. Значения †LT50 , отмеченные разными буквами, считались существенно отличающимися, поскольку их 95% доверительные границы не перекрывались. ‡X2 — значение хи-квадрат в критерии пригодности Пирсона; df, степеней свободы.
| Изолировать | Вид | N* | LC50 (конидии/мл)† | Доверительные ограничения 95% | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| МБ-НЧУ-197 | Метаризиум баошаненсе (Metarhizium baoshanense) | 240 | 2.30 × 105 А | 8.63 × 104–5.70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| КК-НЧУ-213 | Кордицепс cateniannulata | 240 | 9,32 × 104 А | 4,97 × 104–1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Количество наблюдаемых насекомых. | ||||||
| Значения †LC50, отмеченные разными буквами, считались существенно отличающимися, так как их 95% доверительные границы не перекрывались. | ||||||
| ‡X2 — значение хи-квадрат в критерии пригодности Пирсона; df, степени свободы | ||||||
Таблица 5: Значения LC50 грибных изолятов Mb-NCHU-197 и Cc-NCHU-213 против горчичной тли. *Количество наблюдаемых насекомых. Значения †LC50 , отмеченные разными буквами, считались достоверно отличающимися, так как их 95% доверительные границы не перекрывались. ‡X2 — значение хи-квадрат в критерии пригодности Пирсона; df, степеней свободы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Крестоцветные, группа овощей, часто поражаются несколькими видами тлей, включая горчичную тлю (L. erysimi) и капустную тлю (Brevicoryne brassicae)26. Оба вида были зарегистрированы на Тайване27, и вполне возможно, что они могут сосуществовать в месте сбора. Для различения близкородственных видов тлей в этом исследовании использовался метод молекулярной идентификации с использованием мультиплексного набора праймеров21. Сконструировав молекулярный маркер из фрагмента гена COI горчичной тли, мы успешно идентифицировали горчичную тлю, подтвердив тем самым надежность молекулярного маркера A05Le для этой цели21.
Наблюдения показали, что различение нимф четвертого возраста и взрослых горчичных тлей, основываясь исключительно на их размере или морфологии, является сложной задачей без опыта. Однако важнейшей отличительной чертой является большеберцовая кость задних ног, которая у нимф четвертого возраста выглядит белой, но не у взрослых (рис. 3). Предыдущие исследования L. attenuatum, B. bassiana против хлопковой тли и M. brunneum против зеленой персиковой тли продемонстрировали, что линька может быть стратегией, позволяющей избежать заражения28,29,30. Поэтому неправильное определение стадий тли может привести к ошибкам в оценке вирулентности, так как линька может повлиять на эффективность EPF28,29,31. Чтобы решить эту проблему и обеспечить большую точность и достоверность в оценке вирулентности, исключите тлю с беловатыми участками на голенях задних лапок, которые не достигли взрослой стадии, если только они намеренно не используют нимф тли. Эти тли не полностью созревают и могут подвергаться линьке, что может позволить им избежать процесса заражения EPF. Кроме того, рекомендуется проводить наблюдение и запись данных каждые 12 часов. Интервал в 12 ч предпочтителен для демонстрации различий между несколькими перспективными изолятами со схожей способностью убивать тлю и облегчает точный расчет LT50. Тем не менее, временной интервал может быть скорректирован на основе различных жизненных циклов других видов насекомых или определен с помощью мелкомасштабного предварительного теста.
Несмотря на то, что при использовании метода с отделенными листьями на листовом диске может остаться минимальное количество медвяной росы, большая часть медвяной росы прилипает к крышке чашки Петри, поскольку листовой диск находится в непосредственной близости. В период наблюдения она может быть вытерта или смыта. Тем не менее, медвяная роса, несомненно, присутствует в практической среде возделывания сельскохозяйственных культур при нашествиитли32. Медвяная роса, присутствующая в инокуляционной камере, может несколько имитировать ситуацию, когда EPF инокулируется тлей в поле. Кутикула тли в основном содержит медвяную росу, которая служит источником питательных веществ для грибка и может стимулировать прорастание EPF16. Таким образом, сочетание применения EPF и производства медвяной росы тлей может быть выгодным.
Чтобы подтвердить, что гибель тли вызвана инфекцией, трупы обычно переносят из инокуляционной камеры EPF во влажную фильтровальную бумагу или питательную среду для наблюдения за вырастанием грибков 11,14,33,34. Однако в этом исследовании водный агар использовался в инокуляционной камере для поддержания высокой влажности, что позволяло трупам тли оставаться на листьях без необходимости перемещения для наблюдения за грибковыми выростами. Несмотря на то, что метод с отрывными листьями дает информацию об афидицидном эффекте изолятов EPF, он все еще имеет ограничения. Водный агар, используемый для поддержания состояния листового диска, может привести к застреванию тли при движении в инокуляционной камере. Чтобы решить эту проблему, процент водного агара был увеличен до 3%, что обеспечило достаточно твердую поверхность для того, чтобы русская пшеничная тля (Diuraphis noxia) могла ходить по20. В этом эксперименте горчичная тля смогла комфортно передвигаться по поверхности водного агара с концентрациями от 1,5% до 3%. Однако по мере того, как период наблюдения прогрессировал, несколько тлей застряли вниз головой ногами вверх, и их пришлось спасать обратно к листовому диску. Это может быть связано с различиями в размерах или подвижности тли, что указывает на то, что увеличение концентрации агара само по себе не может решить проблему. Поэтому убедитесь, что листовой диск полностью покрывает поверхность агара, используя лист, который более плотно прилегает к размеру чашки Петри, что может помочь решить эту проблему. По сравнению с методом с отрывными листьями, описанным Йокоми и Готвальдом18, в этом исследовании был улучшен один аспект за счет использования размера листа, который примерно хорошо подходит для чашки Петри. Это позволяет проводить относительную количественную оценку потребления пищевых продуктов и сводит к минимуму поверхность агара с открытой поверхностью. Кроме того, лист должен быть «встроен» в полузатвердевший водный агар, тогда как в первоначальном справочнике он был описан как «помещенный» на водный агар18. Заделка листового диска в водный агар снижает вероятность прилипания тли к поверхности агара и облегчает наблюдение, так как тля ограничена одной стороной.
В этом протоколе содержатся подробные инструкции о том, как действовать с помощью метода с отрывным листом и инокуляции EPF, а также некоторые модификации, которые облегчили операции, наблюдения и согласованные результаты. Он также устанавливает стандартизированный метод отбора изолятов EPF против вредителей, сосущих растения, в лабораторных условиях. Кроме того, для будущей коммерциализации изолятов EPF может быть проведена стандартная проверка известных эффективных или коммерчески доступных продуктов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что в данной работе отсутствует конфликт интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано 109-2313-B-005 -048 -MY3 Министерством науки и технологий (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
