Kvantificering, levedygtighedsvurdering og visualiseringsstrategier for Acinetobacter biofilm

Summary

Denne protokol beskriver fremstillingen af podningen, biofilmkvantificeringen på mikrotiterplader ved hjælp af krystalviolet farvestof, det levedygtige antal i biofilm og visualiseringen af biofilm af Acinetobacter.

Abstract

Acinetobacter forårsager nosokomielle infektioner, og dets biofilmdannelse kan bidrage til overlevelse på tørre overflader såsom hospitalsmiljøer. Biofilmkvantificering og visualisering er således vigtige metoder til at vurdere potentialet for Acinetobacter-stammer til at forårsage nosokomielle infektioner. De biofilm, der dannes på overfladen af mikropladen, kan kvantificeres med hensyn til volumen og celleantal. Biofilmvolumener kan kvantificeres ved farvning ved hjælp af krystalviolet, vask, farvning ved hjælp af ethanol og derefter måling af det opløselige farvestof ved hjælp af en mikropladelæser. For at kvantificere antallet af celler, der er indlejret i biofilmene, skrottes biofilmene ved hjælp af celleskrabere, høstes i saltvand, omrøres kraftigt i nærværelse af glasperler og spredes på Acinetobacter agar. Derefter inkuberes pladerne ved 30 °C i 24-42 timer. Efter inkubation opregnes de røde kolonier for at estimere antallet af celler i biofilm. Denne levedygtige tællemetode kan også være nyttig til tælling af Acinetobacter-celler i biofilm med blandede arter. Acinetobacter biofilm kan visualiseres ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. En kommercielt tilgængelig mikroplade designet til mikroskopisk analyse anvendes til dannelse af biofilm. Derefter farves de bundoverflademonterede biofilm med SYTO9- og propidiumiodidfarvestoffer, vaskes og visualiseres derefter med konfokal laserscanningsmikroskopi.

Introduction

Acinetobacter er kendt for at forårsage nosokomielle infektioner, og dets humane infektion, især i sundhedsfaciliteter, rapporteres i stigende grad¹. Det er udbredt på hospitaler, sundhedsfaciliteter og fødevarerelaterede miljøer ^2,3,4. Det kan overleve i lang tid i miljøer, herunder hospitalsoverflader såsom sengeskinner, natborde, overfladen af ventilatorer og dræn⁴. En sådan persistens på miljøoverflader kan være en af de væsentlige faktorer, der bidrager til de nosokomielle infektioner af Acinetobacter⁴.

Biofilm er en form for mikrobielt liv og er en mikrobiel matrix sammensat af levende mikrobielle celler og ekstracellulære polymere stoffer (EPS) fra cellerne⁵. De mikrobielle celler er indlejret i matrixen og er ofte meget modstandsdygtige over for miljøbelastninger som varme, salte, tørhed, antibiotika, desinfektionsmidler og forskydningskræfter ^6,7.

Acinetobacter kan danne biofilm på overflader, hvilket tyder på, at det kan bidrage til forlænget overlevelse på miljøoverflader, herunder hospitalsoverflader, og øget resistens over for antibiotikabehandling ^8,9. Derudover kan biofilmdannelsen af Acinetobacter være stærkt forbundet med humane kliniske resultater⁸. Derfor kan biofilmformbarheden af Acinetobacter-stammer være en af indikatorerne til forudsigelse af miljømæssig overlevelse og humane infektioner ^8,10.

De overfladebundne biofilm kan kvantificeres og visualiseres for at vurdere biofilms formbarhed. For at kvantificere overfladebundne biofilm farves biofilmene normalt af biofilmfarvningsfarvestoffer såsom krystalviolet, og farvestofferne elueres i opløsning og måles for optisk densitet¹¹. Visualisering af biofilm er en anden god tilgang til vurdering af biofilms formbarhed¹¹. Konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) visualiseringsmetode, der anvender specificitet ved hjælp af fluorescerende farvestoffer, kan være mere nyttig til at karakterisere biofilmmorfologi sammenlignet med andre teknikker såsom SEM^12,13.

De levedygtige celler i biofilm kan tælles med for at estimere antallet af levedygtige celler i biofilm¹¹. De levedygtige celler indlejret i biofilm løsnes, fortyndes, spredes på agarplader, inkuberes og opregnes. Fordi det højere antal celler sandsynligvis opfylder den infektiøse dosis, kan det give mere detaljerede oplysninger om biofilm, såsom infektionspotentialer forbundet med antallet af celler^13,14.

Denne artikel præsenterer trinvise protokoller til (1) kvantificering af overfladebundne biofilm, (2) tælling af levedygtige celler i biofilmene og (3) visualisering af biofilmene ved hjælp af CLSM af Acinetobacter. De præsenterede protokoller beskriver metoderne til vurdering af Acinetobacter-isolaters biofilmformbarhed og karakteriserer deres biofilm.

Protocol

1. Fremstilling af bakteriel inokulum

1. Fjern hætteglasset med glycerolbouillon, der opbevares ved -80 °C.
2. Fjern bakteriestammen (2-10 μL) fra hætteglasset med en steril pipettespids.
   BEMÆRK: Acinetobacterstammer, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) og A. ursingii (24-1) anvendes i denne protokol.
3. Pod en kommercielt tilgængelig blodagarplade (tryptisk sojaagar suppleret med 5% fåreblod, se materialetabel) med bakterierne.
   BEMÆRK: Andre medier, såsom næringsagar eller MacConkey-agar, kan også bruges.
4. Stribe agaroverfladen ved hjælp af en steril løkke med intermitterende flammende for at tynde den ud.
5. Agarpladen anbringes på hovedet i en inkubator og inkuberes ved 30 °C natten over i 20-24 timer.
6. Vælg en enkelt koloni af bakteriekulturen med en steril nål og pod 5 ml steril hjernehjerteinfusionsbouillon (BHI, se materialetabel) med kulturen.
7. Den podede bouillon inkuberes i en rysteinkubator ved 30 °C natten over i 20-24 timer ved ca. 150 omdr./min.
8. 1 ml af natkulturen overføres til et sterilt mikrocentrifugerør, og natkulturen centrifugeres ved 6.000 × g i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
9. Supernatanten fjernes med en pipette.
10. Brug en hvirvel til at resuspendere pelleten i 1 ml sterilt fosfatbufret saltvand (PBS).
11. Der centrifugeres ved 6.000 × g i 10 minutter ved RT, og supernatanten fjernes.
12. Resuspender pellet i steril ti gange fortyndet BHI ved hjælp af hvirvel til en optisk densitet på ca. 0,1 ved 600 nm.
    BEMÆRK: Den optiske tæthed på ca. 0,1 svarer til ca. 10⁷ CFU/ml.

2. Biofilmkvantificering ved hjælp af krystalviolet

1. Der tilsættes 200 μL podning til hver brønd i en steril 96-brøndsplade af polystyren (se materialetabellen), og der tilsættes 200 μL deioniseret vand til hver af de yderste brønde for at forhindre, at de indre brønde tørrer ud¹⁵.
2. Der tilsættes 200 μL ti gange fortyndet BHI til hvert hul på samme plade som en negativ kontrol.
3. Pladen inkuberes ved 25 °C i 24 timer.
4. Supernatanten fjernes med en pipette.
   BEMÆRK: Multikanalpipette er ofte mere praktisk til flere prøver.
5. Der tilsættes forsigtigt 300 μL PBS til hvert hul, og supernatanten fjernes med en pipette.
   BEMÆRK: Multikanalpipette er ofte mere praktisk til flere prøver.
6. Gentag trin 2.5 to gange mere.
7. Der tilsættes 200 μL krystalviolet opløsning (1%) (se materialetabel) til hvert hul og inkuberes ved RT i 30 minutter.
8. Gentag trin 2.4-2.6.
9. Der tilsættes 200 μL absolut ethanol til hvert hul og inkuberes i 15 minutter ved RT. Bland grundigt ved pipettering op og ned flere gange.
10. Overfør 100 μL eluering fra hvert hul til en ny plade med 96 brønde.
11. Absorbansen måles ved 595 nm ved hjælp af en mikropladelæser (se materialetabellen).
12. Når absorbansen overstiger 2,0, foretages en korrekt fortynding af prøven til absorbansen under 2,0 i absolut ethanol, og den måles som i trin 2.11. Derefter beregnes prøvens absorbans (slutværdien) ved at gange den observerede værdi med fortyndingsfaktoren.
13. Prøvernes sande absorbans beregnes ved at trække gennemsnitsværdien af den negative kontrol fra værdien af hvert hul i analyseprøverne på samme brøndplade.

3. Antal biofilms levedygtighed

1. Tilsæt 1 ml inokulum (trin 1) til hvert hul i en steril polystyrenplade med 12 brønde¹⁵. Pladen inkuberes ved 25 °C i 24 timer. Supernatanten fjernes med en pipette.
2. Der tilsættes forsigtigt 1,5 ml sterilt PBS til hvert hul, og supernatanten fjernes med en pipette. Der tilsættes 1 ml steril PBS til hvert hul.
3. Skrab brøndens bund- og vægoverflader af ved hjælp af monterede celleskrabere.
4. Overfør den høstede cellesuspension til et sterilt plastrør (10-1) indeholdende 9 ml saltvand (0,85% NaCl) og ^10-20 glasperler (se materialetabel).
   BEMÆRK: For at opsamle eventuelle resterende biofilmrester, der er tilbage på brøndens bundoverflade, kan den resuspenderes og overføres med pipette ved hjælp af saltvand fra ^10-1-røret .
5. Vortex ^10-1 røret i 60 s ved maksimal hastighed.
6. Lav en 10 gange seriel fortynding ved at overføre 1 ml til det næste sterile glas (10-2) indeholdende 9 ml saltvand (0,85 % NaCl) op til ^10-7.
7. Fra hver fortynding spredes 100 μL på Acinetobacter agar (se materialetabel), og agarpladerne inkuberes ved 30 °C i 24-42 timer.
8. Tæl antallet af de typiske røde kolonier på hver plade manuelt i området mellem 10 og 250.
9. Beregn antallet af levedygtige celler i biofilmen i hver brønd ved hjælp af nedenstående ligning:
   Levedygtige celler = Antal kolonier × Fortyndingsfaktorer × 10

4. Biofilm visualisering ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM)

1. Der tilsættes 200 μL podemateriale til hvert hul i en steril 96-brønds plade beregnet til mikroskopisk analyse.
2. Pladen inkuberes ved 25 °C i 24 timer.
3. Supernatanten fjernes med en pipette.
4. Der tilsættes forsigtigt 300 μL filtreret deioniseret vand til hvert hul, og supernatanten fjernes med en pipette.
5. Gentag trin 4.4.
6. Blandingen af SYTO 9 og propidiumiodid (se materialetabel) fremstilles fortyndet i filtreret deioniseret vand til en slutkoncentration på henholdsvis 10 μM og 60 μM.
7. Tilsæt blandingen til hvert hul ved 200 μL og inkuber pladen i 20-30 minutter ved RT i mørke.
8. Gentag trin 4.3-4.4
9. Visualiser de bundoverfladeforbundne biofilm ved hjælp af CLSM med excitationsbølgelængden på 488 nm og 561 nm og emissionsbølgelængdeområdet på henholdsvis 499-535 nm og 568-712 nm.

Representative Results

Efter protokollen blev biofilmene af Acinetobacter-isolater, oprindeligt isoleret fra køkkenoverflader, dannet på en polystyrenplade med 96 brønde, farvet med krystalviolet, og farvestofferne blev opløseligt i ethanol og målt for biofilmmasse (figur 1). Antallet af biofilm varierede meget afhængigt af stammerne fra OD 0,04 til 1,69 (figur 1). Baseret på kriterierne fastlagt af Stepanović et ^al.16 dannede alle isolaterne undtagen A. bouvetii biofilm. A. radioresistens dannede en svag biofilm. A. junii og A. baumannii dannede moderate biofilm, mens A. pittii og A. ursingii dannede stærke biofilm.

For at tælle levedygtige celler i biofilm blev biofilmene skrabet af ved hjælp af celleskrabere, hvirvelformet med høj hastighed, fortyndet og spredt på Acinetobacter selektive plader. Efter inkubation blev antallet af kolonier talt for at estimere antallet af biofilmceller (figur 2). Alle isolaterne undtagen A. bouvetii havde celler svarende til 7-8 Log CFU i deres biofilm. I overensstemmelse med den biofilm-ikke-dannende egenskab, der blev vist ved krystalviolet assay, havde A. bouvetii et meget lavere niveau af cellenummer ved 4,4 Log CFU.

De bundoverfladebundne biofilm blev visualiseret ved hjælp af CLSM (figur 3). En betydelig mængde biofilm blev fundet i A. junii, A. baumannii og A. ursingii med forskellige biofilmmorfologier. Mens A. pittii var en stærk biofilmformer i krystalviolet analyse, dannede den ikke meget biofilm på bundoverfladen.

Figur 1: Måling af biofilmmasse af Acinetobacter dannet på en polystyrenplade med 96 brønde ved hjælp af krystalviolet analyse. Fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelsen fra det tredobbelte. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Levedygtige tællinger af Acinetobacter biofilm dannet på en polystyren 12-brønd plade. Fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelsen fra dubletterne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Acinetobacter-biofilm dannet på en 96-brønds plade visualiseret af CLSM ved hjælp af SYTO 9 og propidiumiodidfarvestoffer. Skalabjælker: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Ved hjælp af den beskrevne protokol blev biofilmdannelsen af Acinetobacter-isolater i varierende grad målt, visualiseret, og de levedygtige celler i biofilmene blev estimeret (figur 1, figur 2 og figur 3).

I denne protokol blev der anvendt to forskellige temperaturer, 30 °C til vækst og 25 °C til biofilmdannelse af Acinetobacter. 30 °C blev anvendt, fordi der i mange undersøgelser blev anvendt mere end 30 °C til optimal vækst af Acinetobacter, hvilket ville være hensigtsmæssigt for at opnå tilstrækkeligt podemateriale^12,13,14,17. Imidlertid er denne temperatur generelt højere end temperaturerne i miljøet, hvor biofilmdannelse ville forekomme, såsom hospitalsoverflader eller fødevareforarbejdningsmiljøer. Derfor blev 25 °C brugt til biofilmdannelse, hvilket ville simulere disse miljøforhold mere.

Denne protokol brugte 10 gange fortyndet BHI i stedet for den oprindelige BHI til dannelse af biofilm (trin 1.12). Mange overflader, såsom hospitalsoverflader eller fødevareforarbejdningsmiljøer, vil sandsynligvis være næringsfattige^18,19. Derudover forbliver mikroorganismer på de forurenede overflader på overfladerne efter rengøring og vedvarer under næringsfattige forhold²⁰. Derfor er næringsfattige forhold såsom 10 gange fortyndet BHI mere ønskelige end forhold med højt næringsindhold såsom original BHI.

Krystalviolet assay er en generelt accepteret og veletableret metode til måling af biofilmmasse, og denne undersøgelse viste, at Acinetobacters biofilmformbarhed kan ses på forskellige niveauer ved hjælp af denne metode.

Levedygtigt antal i biofilm er også vigtigt, fordi de levedygtige celler i biofilm er ansvarlige for humane infektioner, der er mere tilbøjelige til at forekomme af et højere antal celler²¹. Desuden kan den levedygtige optælling være et godt redskab til at skelne mellem dårlige biofilmproducenter, som påvist i A. bouvetii og A. radioresistens (figur 1 og figur 2). Det levedygtige antal af A. radioresistens var meget højere end for A. bouvetii, mens der kun blev fundet lille forskel i biofilmmasse, hvilket tyder på et højere potentiale for infektion med A. radioresistens (figur 1 og figur 2). Denne metode kan også bruges til at estimere andelen af Acinetobacter i biofilm med flere arter, hvilket er mere almindeligt i miljøet.

Acinetobacter danner biofilm ikke kun på bundoverfladen, men også på sidevæggen, især ved luft-væske-grænsefladen i rør^17,22. CLSM-analyse ved hjælp af en mikrotiterplade er begrænset til de bundoverflademonterede biofilm, hvilket undertiden gør det svært at sammenligne med resultaterne ved krystalviolet assay, som måler alle de nedsænkede overflader, inklusive vægoverfladerne. En betydelig mængde biofilm ved luft-væske-grænsefladen blev også fundet i disse isolater, især den stærke biofilmproducent, A. pittii. Det dannede relativt dårlig biofilm på bundoverfladen sammenlignet med andre isolater (figur 3). Derfor skal en mikroskopisk analyseteknik videreudvikles for at visualisere de biofilm, der dannes ved sidevæggen.

I denne undersøgelse blev tre forskellige assays, krystalviolet, viable count og CLSM, brugt til at karakterisere biofilmene af Acinetobacter. Krystalviolet assay er den veletablerede metode til kvantificering af biofilm, og kriterierne for bestemmelse af biofilms formbarhed findes¹⁶. Det måler dog ikke kun levende celler og EPS, men også døde celler, som er mindre meningsfulde med hensyn til menneskelig infektion og virulens. De levende celler i biofilm kan måles ved hjælp af den levedygtige tællemetode. Biofilms formbarhed kan imidlertid ikke bestemmes ved hjælp af den levedygtige tællemetode, fordi denne metode ikke måler EPS, en kritisk komponent i biofilmstrukturen. Derfor har denne metode ikke kriterierne eller afskæringsværdien til at bestemme biofilms formbarhed. Desuden måler den levedygtige tællingsmetode kun cellernes dyrkningsevne og måler ikke cellerne i "levedygtig, men ikke dyrkelig tilstand"¹¹. Tilstedeværelsen af biofilm kan bekræftes ved CLSM-metoden, som effektivt visualiserer biofilm. Det måler dog kun bundoverfladebundspåsatte biofilm, selvom biofilm ofte også dannes på sidevæggene. Derfor anbefales det at anvende krystalviolet assay til bestemmelse af biofilmformbarheden. Derefter kan de levende og dyrkbare celler i biofilm kvantificeres ved hjælp af den levedygtige tællemetode, og de bundoverfladebundbundne biofilm kan bekræftes eller karakteriseres ved CLSM-metoden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM