Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung des Inokulums, die Quantifizierung des Biofilms auf Mikrotiterplatten mit kristallviolettem Farbstoff, die Lebensfähigkeit in Biofilmen und die Visualisierung von Biofilmen von Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter verursacht nosokomiale Infektionen und seine Biofilmbildung kann zum Überleben auf trockenen Oberflächen wie z.B. Krankenhausumgebungen beitragen. Daher sind Biofilmquantifizierung und -visualisierung wichtige Methoden, um das Potenzial von Acinetobacter-Stämmen zur Verursachung nosokomialer Infektionen zu bewerten. Die Biofilme, die sich auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte bilden, können in Bezug auf Volumen und Zellzahl quantifiziert werden. Biofilmvolumina können durch Färben mit Kristallviolett, Waschen, Entfärben mit Ethanol und anschließendes Messen des gelösten Farbstoffs mit einem Mikroplatten-Reader quantifiziert werden. Um die Anzahl der in die Biofilme eingebetteten Zellen zu quantifizieren, werden die Biofilme mit Hilfe von Zellschabern abgekratzt, in der Kochsalzlösung geerntet, in Gegenwart von Glasperlen kräftig gerührt und auf Acinetobacter-Agar verteilt. Anschließend werden die Platten bei 30 °C für 24-42 h inkubiert. Nach der Inkubation werden die roten Kolonien gezählt, um die Anzahl der Zellen in Biofilmen abzuschätzen. Diese brauchbare Zählmethode kann auch für die Zählung von Acinetobacter-Zellen in Biofilmen mit gemischten Spezies nützlich sein. Acinetobacter-Biofilme können mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar gemacht werden. Eine kommerziell erhältliche Mikrotiterplatte, die für die mikroskopische Analyse entwickelt wurde, wird zur Bildung von Biofilmen verwendet. Anschließend werden die an der Unterseite befestigten Biofilme mit SYTO9- und Propidiumiodid-Farbstoffen gefärbt, gewaschen und dann mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert.
Introduction
Es ist bekannt, dass Acinetobacter nosokomiale Infektionen verursacht, und über seine Infektion beim Menschen, insbesondere in Gesundheitseinrichtungen, wird zunehmend berichtet1. Es ist in Krankenhäusern, Gesundheitseinrichtungen und lebensmittelnahen Umgebungen weit verbreitet 2,3,4. Es kann über einen langen Zeitraum in Umgebungen wie Krankenhausoberflächen wie Bettgittern, Nachttischen, der Oberfläche von Beatmungsgeräten und Waschbecken überleben4. Eine solche Persistenz auf Umweltoberflächen könnte einer der signifikanten Faktoren sein, die zu den nosokomialen Infektionen von Acinetobacter4 beitragen.
Biofilm ist eine Form des mikrobiellen Lebens und ist eine mikrobielle Matrix, die aus lebenden mikrobiellen Zellen und extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) aus den Zellen besteht5. Die mikrobiellen Zellen sind in die Matrix eingebettet und oft sehr widerstandsfähig gegen Umweltbelastungen wie Hitze, Salze, Trockenheit, Antibiotika, Desinfektionsmittel und Scherkräfte 6,7.
Acinetobacter kann Biofilme auf Oberflächen bilden, was darauf hindeutet, dass es zu einem verlängerten Überleben auf Umweltoberflächen, einschließlich Krankenhausoberflächen, und zu einer erhöhten Resistenz gegen Antibiotikabehandlung beitragen kann 8,9. Darüber hinaus könnte die Biofilmbildung von Acinetobacter in hohem Maße mit den klinischen Ergebnissen beim Menschen assoziiert sein8. Daher könnte die Biofilmformbarkeit von Acinetobacter-Stämmen einer der Indikatoren für die Vorhersage des Überlebens in der Umwelt und menschlicher Infektionen sein 8,10.
Die oberflächengebundenen Biofilme können quantifiziert und visualisiert werden, um die Formbarkeit von Biofilmen zu beurteilen. Um oberflächengebundene Biofilme zu quantifizieren, werden die Biofilme normalerweise mit Biofilm-Färbefarbstoffen wie Kristallviolett gefärbt, und die Farbstoffe werden in Lösung eluiert und auf optische Dichtegemessen 11. Die Visualisierung von Biofilmen ist ein weiterer guter Ansatz, um die Formbarkeit von Biofilmen zu beurteilen11. Die Visualisierungsmethode der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM), die Spezifität unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen verwendet, könnte zur Charakterisierung der Biofilmmorphologie nützlicher sein als andere Techniken wie REM12,13.
Die lebensfähigen Zellen in Biofilmen können gezählt werden, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen in Biofilmen abzuschätzen11. Die lebensfähigen Zellen, die in Biofilme eingebettet sind, werden abgelöst, verdünnt, auf Agarplatten verteilt, inkubiert und gezählt. Da die höhere Anzahl von Zellen wahrscheinlich die infektiöse Dosis erfüllt, kann sie detailliertere Informationen über Biofilme liefern, wie z. B. Infektionspotenziale, die mit der Anzahl der Zellen assoziiert sind13,14.
In diesem Artikel werden Schritt-für-Schritt-Protokolle vorgestellt, um (1) oberflächengebundene Biofilme zu quantifizieren, (2) lebensfähige Zellen in den Biofilmen zu zählen und (3) die Biofilme mit CLSM von Acinetobacter zu visualisieren. Die vorgestellten Protokolle beschreiben die Methoden zur Beurteilung der Biofilmformbarkeit von Acinetobacter-Isolaten und zur Charakterisierung ihrer Biofilme.
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Protocol
1. Herstellung des bakteriellen Inokulums
- Nehmen Sie die bei -80 °C gelagerte Durchstechflasche mit Glycerinvorrat heraus.
- Entfernen Sie den Bakterienstamm (2-10 μl) mit einer sterilen Pipettenspitze aus der Durchstechflasche.
HINWEIS: In diesem Protokoll werden die Acinetobacter-Stämme A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) und A. ursingii (24-1) verwendet. - Eine handelsübliche Blutagarplatte (tryptischer Soja-Agar, ergänzt mit 5 % Schafsblut, siehe Materialtabelle) mit den Bakterien beimpfen.
HINWEIS: Andere Medien, wie z. B. Nähragar oder MacConkey-Agar, können ebenfalls verwendet werden. - Streichen Sie die Agaroberfläche mit einer sterilen Schlaufe mit intermittierendem Flammen ab, um sie zu verdünnen.
- Die Agarplatte kopfüber in einen Inkubator legen und bei 30 °C über Nacht 20-24 h inkubieren.
- Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie der Bakterienkultur mit einer sterilen Nadel und beimpfen Sie 5 ml sterile Gehirnherz-Infusionsbrühe (BHI, siehe Materialtabelle) mit der Kultur.
- Die inokulierte Brühe in einem Schüttelinkubator bei 30 °C über Nacht für 20-24 h bei ca. 150 U/min inkubieren.
- 1 ml der Übernachtkultur in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen überführen und die Übernachtkultur bei 6.000 × g 10 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit einem Wirbel in 1 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Bei 6.000 × g für 10 min bei RT zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in sterilem, zehnfach verdünntem BHI unter Verwendung von Vortex auf eine optische Dichte von etwa 0,1 bei 600 nm.
HINWEIS: Die optische Dichte von ca. 0,1 entspricht ca. 107 KBE/ml.
2. Biofilm-Quantifizierung mit Kristallviolett
- Geben Sie 200 μl Inokulum in jede Vertiefung einer sterilen Polystyrol-96-Well-Platte (siehe Materialtabelle) und fügen Sie 200 μl deionisiertes Wasser in jede der äußersten Vertiefungen hinzu, um ein Austrocknen der inneren Vertiefungen zu verhindern15.
- Als Negativkontrolle werden 200 μl zehnfach verdünntes BHI in jede Vertiefung derselben Platte gegeben.
- Die Platte 24 h bei 25 °C inkubieren.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
HINWEIS: Die Mehrkanalpipette ist oft bequemer für mehrere Proben. - Geben Sie vorsichtig 300 μl PBS in jede Vertiefung und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
HINWEIS: Die Mehrkanalpipette ist oft bequemer für mehrere Proben. - Wiederholen Sie Schritt 2.5 noch zwei weitere Male.
- In jede Vertiefung werden 200 μl kristallviolette Lösung (1 %) (siehe Materialtabelle) gegeben und 30 Minuten lang bei RT inkubiert.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4 bis 2.6.
- Geben Sie 200 μl absolutes Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei RT. Mischen Sie gründlich, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
- Übertragen Sie 100 μl Elution aus jeder Vertiefung auf eine neue 96-Well-Platte.
- Messen Sie die Extinktion bei 595 nm mit einem Mikroplatten-Reader (siehe Materialtabelle).
- Wenn die Extinktion 2,0 überschreitet, wird die Probe auf eine Absorption unter 2,0 in absolutem Ethanol verdünnt und wie in Schritt 2.11 gemessen. Berechnen Sie dann die Absorption der Probe (Endwert), indem Sie den beobachteten Wert mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren.
- Berechnen Sie die tatsächliche Absorption der Proben, indem Sie den Durchschnittswert der Negativkontrolle vom Wert der einzelnen Vertiefungen der Testproben auf derselben Vertiefungsplatte subtrahieren.
3. Anzahl der Biofilm-Lebensfähigkeit
- 1 ml Inokulum (Schritt 1) in jede Vertiefung einer sterilen 12-Well-Platte15 aus Polystyrol geben. Die Platte 24 h bei 25 °C inkubieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Geben Sie vorsichtig 1,5 ml steriles PBS in jede Vertiefung und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Geben Sie 1 ml steriles PBS in jede Vertiefung.
- Kratzen Sie die Boden- und Wandflächen des Brunnens mit montierten Zellschabern ab.
- Die geerntete Zellsuspension wird in ein steriles Kunststoffröhrchen (10-1) überführt, das 9 ml Kochsalzlösung (0,85 % NaCl) und 10-20 Glasperlen enthält (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Um auf der Unterseite des Bohrlochs verbleibende Biofilmrückstände aufzufangen, können sie resuspendiert und durch Pipette mit Kochsalzlösung aus dem 10-1-Röhrchen übertragen werden. - Die 10-1-Röhre 60 s lang mit maximaler Geschwindigkeit vortexen.
- Nehmen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung vor, indem Sie 1 ml in das nächste sterile Röhrchen (10-2) überführen, das 9 ml Kochsalzlösung (0,85 % NaCl) bis zu 10-7 enthält.
- 100 μl aus jeder Verdünnung auf Acinetobacter-Agar verteilen (siehe Materialtabelle) und die Agarplatten bei 30 °C für 24-42 h inkubieren.
- Zählen Sie die Anzahl der typischen roten Kolonien auf jeder Platte manuell im Bereich zwischen 10 und 250.
- Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen im Biofilm jedes Wells, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
Lebensfähige Zellen = Anzahl der Kolonien × Verdünnungsfaktoren × 10
4. Biofilm-Visualisierung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)
- Geben Sie 200 μl Inokulum in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-Platte, die für die mikroskopische Analyse bestimmt ist.
- Die Platte 24 h bei 25 °C inkubieren.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Geben Sie vorsichtig 300 μl filtersterilisiertes deionisiertes Wasser in jede Vertiefung und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 4.4.
- Das Gemisch aus SYTO 9 und Propidiumiodid (siehe Materialtabelle) wird in filtersterilisiertem deionisiertem Wasser auf eine Endkonzentration von 10 μM bzw. 60 μM verdünnt.
- Geben Sie die Mischung in jede Vertiefung bei 200 μl und inkubieren Sie die Platte 20-30 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3-4.4
- Visualisieren Sie die an der Unterseite befestigten Biofilme mit CLSM mit der Anregungswellenlänge von 488 nm und 561 nm und dem Emissionswellenlängenbereich von 499-535 nm bzw. 568-712 nm.
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Representative Results
Gemäß dem Protokoll wurden die Biofilme von Acinetobacter-Isolaten , die ursprünglich aus Küchenoberflächen isoliert wurden, auf einer 96-Well-Polystyrolplatte gebildet, mit Kristallviolett gefärbt, und die Farbstoffe wurden in Ethanol gelöst und auf Biofilmmasse gemessen (Abbildung 1). Die Anzahl der Biofilme variierte je nach Stämmen stark und reichte von OD 0,04 bis 1,69 (Abbildung 1). Basierend auf den von Stepanović et al.16 aufgestellten Kriterien bildeten alle Isolate mit Ausnahme von A. bouvetii Biofilme. A. radioresistens bildete einen schwachen Biofilm. A. junii und A. baumannii bildeten moderate Biofilme, während A. pittii und A . ursingii starke Biofilme bildeten.
Um lebensfähige Zellen in Biofilmen zu zählen, wurden die Biofilme mit Hilfe von Zellschabern abgeschabt, mit hoher Geschwindigkeit aufgewirbelt, verdünnt und auf den Acinetobacter-selektiven Platten verteilt. Nach der Inkubation wurde die Anzahl der Kolonien gezählt, um die Anzahl der Biofilmzellen abzuschätzen (Abbildung 2). Alle Isolate mit Ausnahme von A. bouvetii wiesen Zellen auf, die 7-8 Log KBE in ihren Biofilmen entsprachen. In Übereinstimmung mit der nicht bildenden Eigenschaft des Biofilms, die durch den Kristallviolett-Assay gezeigt wurde, wies A. bouvetii eine viel niedrigere Zellzahl bei 4,4 Log KBE auf.
Die an der Unterseite befestigten Biofilme wurden mittels CLSM visualisiert (Abbildung 3). Eine beträchtliche Menge an Biofilm wurde in A. junii, A. baumannii und A. ursingii mit unterschiedlichen Biofilm-Morphologien gefunden. Während A. pittii im Kristallviolett-Assay ein starker Biofilmbildner war, bildete er auf der Unterseite nicht viel Biofilm.
Abbildung 1: Messung der Biofilmmasse von Acinetobacter , die auf einer 96-Well-Polystyrolplatte gebildet wurde, unter Verwendung eines Kristallviolett-Assays. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Dreifachen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Lebensfähige Anzahl von Acinetobacter-Biofilmen , die auf einer 12-Well-Platte aus Polystyrol gebildet wurden. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Duplikat dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: An der Unterseite befestigte Acinetobacter-Biofilme , die auf einer 96-Well-Platte gebildet wurden, die durch CLSM unter Verwendung von SYTO 9- und Propidiumiodid-Farbstoffen visualisiert wurden. Maßstabsleisten: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Mit Hilfe des beschriebenen Protokolls wurde die Biofilmbildung von Acinetobacter-Isolaten in unterschiedlichem Ausmaß gemessen, visualisiert und die lebensfähigen Zellen in den Biofilmen geschätzt (Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 3).
In diesem Protokoll wurden zwei verschiedene Temperaturen verwendet, 30 °C für das Wachstum und 25 °C für die Biofilmbildung von Acinetobacter. 30 °C wurde verwendet, da in vielen Studien mehr als 30 °C für das optimale Wachstum von Acinetobacter verwendet wurden, was angemessen wäre, um ein ausreichendes Inokulum zu erhalten12,13,14,17. Diese Temperatur ist jedoch im Allgemeinen höher als die Temperaturen der Umgebung, in der Biofilmbildung auftreten würde, wie z. B. Krankenhausoberflächen oder lebensmittelverarbeitende Umgebungen. Daher wurden 25 °C für die Biofilmbildung verwendet, was diese Umgebungsbedingungen besser simulieren würde.
In diesem Protokoll wurde 10-fach verdünntes BHI anstelle des ursprünglichen BHI verwendet, um Biofilme zu bilden (Schritt 1.12). Viele Oberflächen, wie z. B. Krankenhausoberflächen oder lebensmittelverarbeitende Umgebungen, sind wahrscheinlich nährstoffarm18,19. Darüber hinaus verbleiben Mikroorganismen auf den kontaminierten Oberflächen nach der Reinigung auf den Oberflächen und verbleiben unter den nährstoffarmen Bedingungen20. Daher sind nährstoffarme Bedingungen wie 10-fach verdünntes BHI wünschenswerter als nährstoffreiche Bedingungen wie ursprüngliches BHI.
Der Kristallviolett-Assay ist eine allgemein anerkannte und etablierte Methode zur Messung der Biofilmmasse, und diese Studie zeigte, dass die Biofilm-Formbarkeit von Acinetobacter mit dieser Methode auf unterschiedlichen Ebenen erkennbar ist.
Die Anzahl der lebensfähigen Zellen im Biofilm ist auch deshalb wichtig, weil die lebensfähigen Zellen in Biofilmen für menschliche Infektionen verantwortlich sind, die mit größerer Wahrscheinlichkeit bei einer höheren Anzahl von Zellen auftreten21. Darüber hinaus kann die Lebenszahl ein gutes Instrument sein, um schlechte Biofilmproduzenten zu unterscheiden, wie bei A. bouvetii und A. radioresistens gezeigt wird (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die lebensfähige Anzahl von A. radioresistens war viel höher als die von A. bouvetii, während nur geringe Unterschiede in der Biofilmmasse gefunden wurden, was auf ein höheres Infektionspotenzial durch A. radioresistens hindeutet (Abbildung 1 und Abbildung 2). Mit dieser Methode kann auch der Anteil von Acinetobacter in Multispezies-Biofilmen abgeschätzt werden, der in der Umwelt häufiger vorkommt.
Acinetobacter bildet Biofilm nicht nur auf der Unterseite, sondern auch auf der Seitenwand, insbesondere an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche in Rohren17,22. Die CLSM-Analyse mit einer Mikrotiterplatte ist auf die an der Unterseite befestigten Biofilme beschränkt, was es manchmal schwierig macht, sie mit den Ergebnissen des Kristallviolett-Assays zu vergleichen, der alle untergetauchten Oberflächen, einschließlich der Wandoberflächen, misst. Eine beträchtliche Menge an Biofilm an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche wurde auch in diesen Isolaten gefunden, insbesondere in dem starken Biofilmproduzenten A. pittii. Es bildete im Vergleich zu anderen Isolaten einen relativ schlechten Biofilm auf der Unterseite (Abbildung 3). Daher muss eine mikroskopische Analysetechnik weiterentwickelt werden, um die an der Seitenwand gebildeten Biofilme sichtbar zu machen.
In dieser Studie wurden drei verschiedene Assays, Crystal Violet, Viable Count und CLSM, verwendet, um die Biofilme von Acinetobacter zu charakterisieren. Der Kristallviolett-Assay ist die etablierte Methode zur Quantifizierung von Biofilmen, und die Kriterien zur Bestimmung der Formbarkeit von Biofilmen sind vorhanden16. Er misst jedoch nicht nur lebende Zellen und EPS, sondern auch tote Zellen, die in Bezug auf die Infektion und Virulenz des Menschen weniger aussagekräftig sind. Die lebenden Zellen in Biofilmen können mit der Viviable Count-Methode gemessen werden. Die Formbarkeit von Biofilmen kann jedoch nicht mit der Viable Count-Methode bestimmt werden, da diese Methode EPS, eine kritische Komponente in der Biofilmstruktur, nicht misst. Daher hat diese Methode nicht die Kriterien oder den Cut-off-Wert, um die Biofilm-Umformbarkeit zu bestimmen. Darüber hinaus misst die Methode der Lebensfähigkeitszählung nur die Kultivierbarkeit der Zellen und nicht die Zellen im "lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren Zustand"11. Das Vorhandensein von Biofilmen kann durch die CLSM-Methode bestätigt werden, die Biofilme effektiv sichtbar macht. Er misst jedoch nur Biofilme, die an der Bodenoberfläche haften, obwohl sich häufig auch Biofilme an den Seitenwänden bilden. Daher wird empfohlen, den Kristallviolett-Assay zur Bestimmung der Biofilm-Formbarkeit zu verwenden. Dann können die lebenden und kultivierbaren Zellen in Biofilmen mit der Methode der lebensfähigen Zählung quantifiziert werden, und die an der Bodenoberfläche befestigten Biofilme können mit der CLSM-Methode bestätigt oder charakterisiert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch das Hauptforschungsprogramm (E0210702-03) des Korea Food Research Institute (KFRI) unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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