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Biology

Estrategias de cuantificación, evaluación de viabilidad y visualización de biopelículas de Acinetobacter

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65517
Automatic Translation
1,2, 3
1Korea Food Research Institute, 2Department of Food Biotechnology, Korea University of Science and Technology, 3Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute

Summary

Este protocolo describe la preparación del inóculo, la cuantificación de la biopelícula en placas de microtitulación utilizando colorante violeta cristalino, el recuento viable en biopelículas y la visualización de biopelículas de Acinetobacter.

Abstract

Acinetobacter causa infecciones nosocomiales y su formación de biopelículas puede contribuir a la supervivencia en superficies secas como entornos hospitalarios. Por lo tanto, la cuantificación y visualización de biopelículas son métodos importantes para evaluar el potencial de las cepas de Acinetobacter para causar infecciones nosocomiales. Las biopelículas que se forman en la superficie de la microplaca se pueden cuantificar en términos de volumen y número de células. Los volúmenes de biopelícula se pueden cuantificar mediante tinción con violeta cristalino, lavado, decoloración con etanol y luego midiendo el colorante solubilizado con un lector de microplacas. Para cuantificar el número de células incrustadas en las biopelículas, las biopelículas se desechan utilizando raspadores celulares, se cosechan en la solución salina, se agitan vigorosamente en presencia de perlas de vidrio y se esparcen en agar Acinetobacter. A continuación, las placas se incuban a 30 °C durante 24-42 h. Después de la incubación, las colonias rojas se enumeran para estimar el número de células en las biopelículas. Este método de recuento viable también puede ser útil para contar células de Acinetobacter en biopelículas de especies mixtas. Las biopelículas de Acinetobacter se pueden visualizar utilizando tintes fluorescentes. Se emplea una microplaca disponible en el mercado diseñada para el análisis microscópico para formar biopelículas. A continuación, las biopelículas adheridas a la superficie inferior se tiñen con colorantes de yoduro de propidio y SYTO9, se lavan y luego se visualizan con microscopía de barrido láser confocal.

Introduction

Se sabe que Acinetobacter causa infecciones nosocomiales, y su infección en humanos, especialmente en centros de salud, se reporta cada vez más1. Está muy extendido en hospitales, centros de salud y entornos asociados a los alimentos 2,3,4. Puede sobrevivir durante un largo período en entornos que incluyen superficies hospitalarias como barandillas de camas, mesitas de noche, la superficie de ventiladores y lavabos4. Tal persistencia en las superficies ambientales puede ser uno de los factores significativos que contribuyen a las infecciones nosocomiales de Acinetobacter4.

El biofilm es una forma de vida microbiana y es una matriz microbiana compuesta por células microbianas vivas y sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de las células5. Las células microbianas están incrustadas en la matriz y, a menudo, son altamente resistentes a las tensiones ambientales como el calor, las sales, la sequedad, los antibióticos, los desinfectantes y las fuerzas de cizallamiento 6,7.

Acinetobacter puede formar biopelículas en las superficies, lo que sugiere que puede contribuir a una mayor supervivencia en las superficies ambientales, incluidas las superficies hospitalarias, y a una mayor resistencia al tratamiento con antibióticos 8,9. Además, la formación de biopelículas de Acinetobacter podría estar altamente asociada con los resultados clínicos humanos8. Por lo tanto, la formabilidad de la biopelícula de las cepas de Acinetobacter podría ser uno de los indicadores en la predicción de la supervivencia ambiental y de las infecciones humanas 8,10.

Las biopelículas adheridas a la superficie se pueden cuantificar y visualizar para evaluar la formabilidad de la biopelícula. Para cuantificar las biopelículas adheridas a la superficie, las biopelículas normalmente se tiñen con colorantes que tiñen la biopelícula, como el violeta cristalino, y los colorantes se eluyen en solución y se mide la densidad óptica11. La visualización de biopelículas es otro buen enfoque para evaluar la conformabilidad de las biopelículas11. El método de visualización de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) que emplea especificidad utilizando colorantes fluorescentes podría ser más útil para caracterizar la morfología de la biopelícula en comparación con otras técnicas como SEM12,13.

Las células viables en las biopelículas se pueden contar para estimar el número de células viables en las biopelículas11. Las células viables incrustadas en las biopelículas se desprenden, se diluyen, se esparcen en placas de agar, se incuban y se enumeran. Debido a que es probable que el mayor número de células cumpla con la dosis infecciosa, puede proporcionar información más detallada sobre las biopelículas, como los potenciales de infección asociados con el número de células13,14.

Este artículo presenta protocolos paso a paso para (1) cuantificar las biopelículas adheridas a la superficie, (2) contar las células viables en las biopelículas y (3) visualizar las biopelículas utilizando CLSM de Acinetobacter. Los protocolos presentados describen los métodos para evaluar la conformabilidad de las biopelículas de los aislados de Acinetobacter y caracterizar sus biopelículas.

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Protocol

1. Preparación del inóculo bacteriano

  1. Retire el vial de caldo de glicerol almacenado a -80 °C.
  2. Retire la cepa bacteriana (2-10 μL) del vial con una punta de pipeta estéril.
    NOTA: En este protocolo se utilizan cepas de Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) y A. ursingii (24-1).
  3. Inocular una placa de agar sangre disponible comercialmente (agar de soja tríptico suplementado con un 5% de sangre de oveja, ver Tabla de Materiales) con la bacteria.
    NOTA: También se pueden utilizar otros medios, como agar nutriente o agar MacConkey.
  4. Raye la superficie del agar usando un asa estéril con flameado intermitente para diluirla.
  5. Coloque la placa de agar boca abajo en una incubadora e incube a 30 °C durante la noche durante 20-24 h.
  6. Escoja una sola colonia del cultivo bacteriano con una aguja estéril e inocule 5 ml de caldo estéril de infusión cerebro-corazón (BHI, ver Tabla de materiales) con el cultivo.
  7. Incubar el caldo inoculado en una incubadora agitadora a 30 °C durante la noche durante 20-24 h a unas 150 rpm.
  8. Transfiera 1 ml del cultivo nocturno a un tubo de microcentrífuga estéril y centrifugue el cultivo nocturno a 6.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
  9. Retire el sobrenadante con una pipeta.
  10. Con un vórtice, vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
  11. Centrifugar a 6.000 × g durante 10 min a RT y retirar el sobrenadante.
  12. Vuelva a suspender el gránulo en BHI estéril diez veces diluido utilizando vórtice hasta una densidad óptica de alrededor de 0,1 a 600 nm.
    NOTA: La densidad óptica de alrededor de 0,1 equivale aproximadamente a 107 UFC/ml.

2. Cuantificación de biopelículas mediante cristal violeta

  1. Agregue 200 μL de inóculo a cada pocillo de una placa estéril de poliestireno de 96 pocillos (ver Tabla de Materiales) y agregue 200 μL de agua desionizada a cada uno de los pocillos más externos para evitar que los pocillos internos se sequen15.
  2. Agregue 200 μL de BHI diluido diez veces a cada pocillo de la misma placa como control negativo.
  3. Incubar la placa a 25 °C durante 24 h.
  4. Retire el sobrenadante con una pipeta.
    NOTA: La pipeta multicanal suele ser más conveniente para varias muestras.
  5. Agregue con cuidado 300 μL de PBS a cada pocillo y retire el sobrenadante con una pipeta.
    NOTA: La pipeta multicanal suele ser más conveniente para varias muestras.
  6. Repita el paso 2.5 dos veces más.
  7. Añadir 200 μL de solución de violeta cristalina (1%) (ver Tabla de Materiales) a cada pocillo e incubar a RT durante 30 min.
  8. Repita los pasos 2.4-2.6.
  9. Agregue 200 μL de etanol absoluto a cada pocillo e incube durante 15 minutos a RT. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
  10. Transfiera 100 μL de elución de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos.
  11. Mida la absorbancia a 595 nm con un lector de microplacas (consulte la tabla de materiales).
  12. Cuando la absorbancia sea superior a 2,0, se debe diluir adecuadamente la muestra hasta alcanzar una absorbancia inferior a 2,0 en etanol absoluto y se debe medir como se indica en el paso 2.11. A continuación, calcule la absorbancia de la muestra (valor final) multiplicando el valor observado por el factor de dilución.
  13. Calcule la absorbancia real de las muestras restando el valor promedio del control negativo del valor de cada pocillo de las muestras de prueba en la misma placa de pocillo.

3. Recuento de viabilidad de la biopelícula

  1. Agregue 1 mL de inóculo (paso 1) a cada pocillo de una placa estéril de poliestireno de 12 pocillos15. Incubar la placa a 25 °C durante 24 h. Retire el sobrenadante con una pipeta.
  2. Agregue con cuidado 1,5 ml de PBS estéril a cada pocillo y retire el sobrenadante con una pipeta. Agregue 1 ml de PBS estéril a cada pocillo.
  3. Raspe el fondo y las superficies de la pared del pozo con raspadores de celdas instalados.
  4. Transfiera la suspensión celular recolectada a un tubo de plástico estéril (10-1) que contenga 9 ml de solución salina (0,85% de NaCl) y 10-20 perlas de vidrio (consulte la tabla de materiales).
    NOTA: Para recoger cualquier residuo de biopelícula que quede en la superficie inferior del pozo, se puede resuspender y transferir con una pipeta utilizando solución salina del tubo 10-1 .
  5. Agite el tubo 10-1 durante 60 s a una velocidad máxima.
  6. Realice una dilución seriada de 10 veces transfiriendo 1 mL al siguiente tubo estéril (10-2) que contenga 9 mL de solución salina (0,85 % NaCl) hasta 10-7.
  7. Esparcir 100 μL de cada dilución en agar Acinetobacter (ver Tabla de Materiales) e incubar las placas de agar a 30 °C durante 24-42 h.
  8. Cuente manualmente el número de colonias rojas típicas en cada plato en el rango entre 10 y 250.
  9. Calcule el número de células viables en la biopelícula de cada pocillo utilizando la siguiente ecuación:
    Células viables = Número de colonias × Factores de dilución × 10

4. Visualización de biopelículas mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM)

  1. Añadir 200 μL de inóculo a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos destinada al análisis microscópico.
  2. Incubar la placa a 25 °C durante 24 h.
  3. Retire el sobrenadante con una pipeta.
  4. Agregue con cuidado 300 μL de agua desionizada esterilizada con filtro a cada pocillo y retire el sobrenadante con una pipeta.
  5. Repita el paso 4.4.
  6. Preparar la mezcla de SYTO 9 y yoduro de propidio (ver Tabla de Materiales) diluida en agua desionizada esterilizada por filtro hasta una concentración final de 10 μM y 60 μM, respectivamente.
  7. Agregue la mezcla a cada pocillo a 200 μL e incube la placa durante 20-30 min a RT en la oscuridad.
  8. Repita los pasos 4.3-4.4
  9. Visualice las biopelículas adheridas a la superficie inferior utilizando CLSM con la longitud de onda de excitación de 488 nm y 561 nm y el rango de longitud de onda de emisión de 499-535 nm y 568-712 nm, respectivamente.

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Representative Results

Siguiendo el protocolo, las biopelículas de aislados de Acinetobacter , originalmente aisladas de las superficies de la cocina, se formaron en una placa de poliestireno de 96 pocillos, teñida con violeta cristalino, y los colorantes se solubilizaron en etanol y se midió la masa de la biopelícula (Figura 1). El número de biopelículas varió mucho en función de las cepas, oscilando entre 0,04 y 1,69 DO (Figura 1). Con base en los criterios establecidos por Stepanović et al.16, todos los aislamientos, excepto A. bouvetii , formaron biopelículas. A. radioresistens formó una biopelícula débil. A. junii y A. baumannii formaron biopelículas moderadas, mientras que A. pittii y A . ursingii formaron biopelículas fuertes.

Para contar las células viables en las biopelículas, las biopelículas se rasparon con raspadores celulares, se agitaron en vórtice a alta velocidad, se diluyeron y se esparcieron en las placas selectivas de Acinetobacter . Después de la incubación, se contó el número de colonias para estimar el número de células de biofilm (Figura 2). Todos los aislados, excepto A. bouvetii , tenían células equivalentes a 7-8 Log UFC en sus biopelículas. De acuerdo con la propiedad de no formación de biopelícula mostrada por el ensayo de violeta cristalino, A. bouvetii tenía un nivel mucho más bajo de número de células a 4.4 Log UFC.

Las biopelículas adheridas a la superficie inferior se visualizaron utilizando CLSM (Figura 3). Se encontró una cantidad sustancial de biopelícula en A. junii, A. baumannii y A. ursingii con distintas morfologías de biopelícula. Si bien A. pittii fue un fuerte formador de biopelícula en el ensayo de violeta cristalino, no formó mucha biopelícula en la superficie inferior.

Figure 1
Figura 1: Medición de la masa de la biopelícula de Acinetobacter formada en una placa de poliestireno de 96 pocillos utilizando un ensayo de cristal violeta. Las barras de error representan la desviación estándar del triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Recuentos viables de biopelículas de Acinetobacter formadas en una placa de poliestireno de 12 pocillos. Las barras de error representan la desviación estándar del duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Biopelículas de Acinetobacter adheridas a la superficie inferior formadas en una placa de 96 pocillos visualizada por CLSM utilizando colorantes SYTO 9 y yoduro de propidio. Barras de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Utilizando el protocolo descrito, se midió y visualizó la formación de biopelículas de aislados de Acinetobacter en diversos grados y se estimaron las células viables en las biopelículas (Figura 1, Figura 2 y Figura 3).

En este protocolo, se utilizaron dos temperaturas diferentes, 30 °C para el crecimiento y 25 °C para la formación de biopelículas de Acinetobacter. Se utilizó 30 °C debido a que muchos estudios utilizaron más de 30 °C para el crecimiento óptimo de Acinetobacter, lo que sería apropiado para obtener suficiente inóculo12,13,14,17. Sin embargo, esta temperatura es generalmente más alta que las temperaturas del entorno donde se produciría la formación de biopelículas, como las superficies de los hospitales o los entornos de procesamiento de alimentos. Por lo tanto, se utilizaron 25 °C para la formación de biopelículas, lo que simularía más estas condiciones ambientales.

Este protocolo utilizó BHI diluido 10 veces en lugar del BHI original para formar biopelículas (paso 1.12). Es probable que muchas superficies, como las superficies hospitalarias o los entornos de procesamiento de alimentos, sean bajas en nutrientes18,19. Además, los microorganismos presentes en las superficies contaminadas permanecen en las superficies después de la limpieza y persisten en condiciones de bajo contenido de nutrientes20. Por lo tanto, las condiciones bajas en nutrientes, como el BHI diluido 10 veces, son más deseables que las condiciones con alto contenido de nutrientes, como el BHI original.

El ensayo de violeta cristalino es un método generalmente aceptado y bien establecido para medir la masa de la biopelícula, y este estudio mostró que la formabilidad de la biopelícula de Acinetobacter es discernible a diferentes niveles mediante el uso de este método.

El recuento de viables en la biopelícula también es importante porque las células viables en las biopelículas son responsables de las infecciones humanas que tienen más probabilidades de ocurrir por un mayor número de células21. Además, el conteo viable puede ser una buena herramienta para distinguir a los productores pobres de biopelículas, como se demostró en A. bouvetii y A. radioresistens (Figura 1 y Figura 2). El recuento viable de A. radioresistens fue mucho mayor que el de A. bouvetii, mientras que se encontró poca diferencia en la masa de la biopelícula, lo que sugiere un mayor potencial de infección por A. radioresistens (Figura 1 y Figura 2). Además, este método se puede utilizar para estimar la proporción de Acinetobacter en biopelículas de múltiples especies, que es más común en el medio ambiente.

Acinetobacter forma biopelícula no solo en la superficie inferior sino también en la pared lateral, especialmente en la interfaz aire-líquido en los tubos17,22. El análisis CLSM con una placa de microtitulación se limita a las biopelículas adheridas a la superficie inferior, lo que a veces dificulta la comparación con los resultados mediante el ensayo de violeta cristalino, que mide todas las superficies sumergidas, incluidas las superficies de las paredes. También se encontró una cantidad sustancial de biopelícula en la interfaz aire-líquido en estos aislados, especialmente en el fuerte productor de biopelícula, A. pittii. Formó una biopelícula relativamente pobre en la superficie inferior en comparación con otros aislados (Figura 3). Por lo tanto, se debe seguir desarrollando una técnica de análisis microscópico para visualizar las biopelículas formadas en la pared lateral.

En este estudio, se utilizaron tres ensayos diferentes, violeta cristal, conteo viable y CLSM, para caracterizar las biopelículas de Acinetobacter. El ensayo de violeta cristalino es el método bien establecido para cuantificar las biopelículas, y existen los criterios para determinar la conformabilidad de las biopelículas16. Sin embargo, no solo mide las células vivas y las EPS, sino también las células muertas, que son menos significativas en términos de infección y virulencia humanas. Las células vivas en las biopelículas se pueden medir mediante el método de recuento viable. Sin embargo, la conformabilidad de la biopelícula no se puede determinar mediante el método de recuento viable porque este método no mide el EPS, un componente crítico en la estructura de la biopelícula. Por lo tanto, este método no tiene los criterios ni el valor de corte para determinar la conformabilidad de la biopelícula. Además, el método de recuento de viables mide únicamente la cultivabilidad de las células y no mide las células en «estado viable pero no cultivable»11. La presencia de biopelículas se puede confirmar mediante el método CLSM, que visualiza eficazmente las biopelículas. Sin embargo, solo mide las biopelículas adheridas a la superficie inferior, aunque a menudo también se forman biopelículas en las paredes laterales. Por lo tanto, se recomienda utilizar el ensayo de cristal violeta para determinar la conformabilidad de la biopelícula. A continuación, las células vivas y cultivables en las biopelículas pueden cuantificarse mediante el método de recuento viable, y las biopelículas adheridas a la superficie inferior pueden confirmarse o caracterizarse mediante el método CLSM.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el Programa Principal de Investigación (E0210702-03) del Instituto de Investigación Alimentaria de Corea (KFRI), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well cell culture plate SPL 30096 Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth Merck KGaA 1.10493.0500
Blood Agar Base Plate KisanBio MB-B1005-P50 Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter CHROMagar AC092 Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution Sigma-Aldrich V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit Invitrogen L10316 SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader Tecan Infinite M200 PRO NanoQuant Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads RBC RG001 Glass beads
μ-Plate 96 Well Black ibidi 89621 Microplate intended for CLSM

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References

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