Summary
Qui viene presentato un metodo per arricchire e analizzare i componenti volatili degli estratti di tè utilizzando l'evaporazione del sapore assistita da solvente e l'estrazione con solvente seguita da gascromatografia-spettrometria di massa, che può essere applicata a tutti i tipi di campioni di tè.
Abstract
L'aroma del tè è un fattore importante nella qualità del tè, ma è difficile da analizzare a causa della complessità, della bassa concentrazione, della diversità e della labilità dei componenti volatili dell'estratto di tè. Questo studio presenta un metodo per ottenere e analizzare i componenti volatili dell'estratto di tè con conservazione degli odori utilizzando l'evaporazione del sapore assistita da solvente (SAFE) e l'estrazione con solvente seguita da gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS). SAFE è una tecnica di distillazione ad alto vuoto in grado di isolare composti volatili da matrici alimentari complesse senza alcuna interferenza non volatile. In questo articolo viene presentata una procedura completa passo-passo per l'analisi dell'aroma del tè, compresa la preparazione dell'infusione di tè, l'estrazione con solvente, la distillazione SAFE, la concentrazione dell'estratto e l'analisi mediante GC-MS. Questa procedura è stata applicata a due campioni di tè (tè verde e tè nero) e sono stati ottenuti risultati qualitativi e quantitativi sulla composizione volatile dei campioni di tè. Questo metodo può essere utilizzato non solo per l'analisi dell'aroma di vari tipi di campioni di tè, ma anche per studi sensoriali molecolari su di essi.
Introduction
Il tè è una bevanda preferita di molte persone in tutto il mondo 1,2. L'aroma del tè è un criterio di qualità e un fattore determinante per il prezzo delle foglie di tè 3,4. Pertanto, l'analisi della composizione aromatica e del contenuto del tè è di grande importanza per gli studi sensoriali molecolari e il controllo di qualità del tè. Di conseguenza, l'analisi della composizione aromatica è stata un argomento importante nella ricerca sul tè negli ultimi anni 5,6,7.
Il contenuto di componenti aromatici nel tè è molto basso, in quanto generalmente rappresentano solo lo 0,01% -0,05% del peso secco delle foglie di tè8. Inoltre, la grande quantità di componenti non volatili nella matrice del campione interferisce significativamente con l'analisi mediante gascromatografia 9,10. Pertanto, una procedura di preparazione del campione è essenziale per isolare i composti volatili nel tè. La considerazione chiave per il metodo di isolamento e arricchimento è ridurre al minimo l'interferenza della matrice e, allo stesso tempo, massimizzare la conservazione del profilo di odore originale del campione.
L'evaporazione del sapore assistita da solvente (SAFE), originariamente sviluppata da Engel, Bahr e Schieberle, è una tecnica di distillazione ad alto vuoto migliorata utilizzata per isolare composti volatili da matrici alimentari complesse11,12. Un gruppo di vetro compatto collegato a una pompa ad alto vuoto (con una pressione di esercizio tipica di 5 x 10−3 Pa) può raccogliere in modo efficiente composti volatili da estratti di solventi, alimenti oleosi e campioni acquosi.
Questo articolo ha descritto un metodo che combina la tecnica SAFE con l'estrazione con solvente per isolare sostanze volatili da un'infusione di tè nero, seguita da un'analisi utilizzando GC-MS.
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Protocol
1. Preparazione dello standard interno e infusione di tè
- Soluzione madre: sciogliere 10,0 mg di paraxilene-d10 (vedere Tabella dei materiali) in 10,0 ml di etanolo anidro per preparare una soluzione madre da 1.000 ppm dello standard interno.
- Soluzione di lavoro: Diluire 1 mL della soluzione madre (fase 1.1) a 100 mL con acqua pura per preparare una soluzione di lavoro da 10 ppm dello standard interno.
NOTA: la soluzione di lavoro deve essere preparata lo stesso giorno dell'analisi. - Mettere 3 g di foglie di tè (sia per il tè verde che per il tè nero, vedi Tabella dei materiali) in un matraccio Erlenmeyer e aggiungere 150 ml di acqua bollente. Coprire il pallone con un tappo di vetro.
- Dopo 5 minuti, filtrare rapidamente l'infuso di tè attraverso un setaccio a 300 maglie.
- Lavare le foglie di tè esaurite due volte con 30 ml di acqua e combinare la soluzione di lavaggio con l'infuso di tè.
- Raffreddare rapidamente l'infuso di tè a temperatura ambiente in un bagno di acqua ghiacciata.
- Aggiungere 1,00 ml di soluzione di lavoro (fase 1.2) nell'infuso di tè e mescolarli bene.
2. Distillazione dell'infuso di tè mediante estrazione SICURA e liquido-liquido del distillato
- Preparare l'assieme SAFE seguendo i passaggi seguenti.
- Installare l'assieme SAFE (Figura 1) e collegare la bottiglia di distillazione in basso a sinistra (Figura 1[3]) e la bottiglia di raccolta in basso a destra (Figura 1[4]). Collegare il tubo dell'acqua di circolazione sul retro del gruppo vetro SAFE. Installare la trappola del freddo (Figura 1[5]) e collegare il tubo alla pompa per vuoto (vedi Tabella dei materiali) in alto a destra del gruppo di vetro.
NOTA: Controllare il collegamento del tubo dell'acqua circolante; Assicurarsi che l'ingresso entri nella parte superiore e l'uscita esca dal basso. Utilizzare acqua deionizzata per la circolazione per evitare che la bilancia blocchi il tubo bianco nel gruppo SAFE, il che comporterebbe una cattiva circolazione dell'acqua circolante e l'eventuale esplosione del gruppo SAFE. Il fondo di distillazione (figura 1[3]) può essere agitato da una barra di agitazione per facilitare l'evaporazione del campione. - Impostare la temperatura dell'acqua di circolazione a 50 °C e quella del bagnomaria per il matraccio campione a 40 °C. Chiudere la valvola del vuoto (Figura 1[2]).
- Installare l'assieme SAFE (Figura 1) e collegare la bottiglia di distillazione in basso a sinistra (Figura 1[3]) e la bottiglia di raccolta in basso a destra (Figura 1[4]). Collegare il tubo dell'acqua di circolazione sul retro del gruppo vetro SAFE. Installare la trappola del freddo (Figura 1[5]) e collegare il tubo alla pompa per vuoto (vedi Tabella dei materiali) in alto a destra del gruppo di vetro.
- Eseguire il funzionamento della pompa per vuoto.
- Accendere la pompa per vuoto.
- Aumentare gradualmente la velocità fino alla velocità massima del 100%.
NOTA: Se la velocità non raggiunge il 100%, controllare se il sistema è ermetico e se ci sono residui di solvente all'interno del sistema. - Dopo aver raggiunto un alto vuoto (preferibilmente 10-3 Pa)
NOTA: Il vuoto migliora quando l'azoto liquido viene aggiunto alla trappola fredda.
- Eseguire la distillazione del campione.
- Avviare la circolazione dell'acqua.
- Aggiungere azoto liquido alla trappola fredda per coprire l'esterno della bottiglia di raccolta.
- Versare l'infuso di tè nell'imbuto del campione in alto a sinistra (Figura 1[1]), quindi coprirlo con un tappo di vetro.
- Introdurre il campione nel matraccio di distillazione a goccia. Controllare la velocità di caduta del campione in modo che il vuoto sia mantenuto nell'intervallo corretto di circa 10−3 Pa.
NOTA: Aggiungere azoto liquido durante il processo per garantire che la bottiglia di raccolta giusta sia sempre immersa nell'azoto liquido. Cerca di evitare la formazione di condensa nella trappola fredda.
- Spegnere la pompa per vuoto al termine della distillazione.
- Premere l'interruttore di alimentazione . Quando "STOP" lampeggia, premere il tasto Invio per confermare.
- Scollegare il cavo di alimentazione quando la velocità della pompa molecolare diminuisce a "0".
NOTA: riavviare solo quando la velocità diminuisce a "0".
- Ripristinare il sistema alla pressione atmosferica.
- Rimuovere il tappo di macinazione sopra la bottiglia di campionamento.
- Svitare lentamente la manopola della valvola del vuoto per ripristinare la pressione atmosferica del sistema.
- Smontare la bottiglia di raccolta con il campione.
- Rimuovere l'azoto liquido all'esterno del flacone di raccolta dopo aver riportato il sistema alla pressione atmosferica.
- Svitare lentamente il flacone di raccolta. Smontare con cura la bottiglia di raccolta con il campione.
- Chiudere l'acqua circolante.
- Eseguire l'estrazione liquido-liquido del distillato SAFE.
- Lasciare riscaldare il distillato SAFE in bottiglia a temperatura ambiente.
- Estrarre il distillato SAFE tre volte con 50 mL di diclorometano (vedi Tabella dei materiali).
- Unire gli strati di diclorometano. Asciugare l'estratto con solfato di sodio anidro (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Il solfato di sodio anidro nel solvente è considerato abbastanza secco quando non è più cementato e può fluire liberamente. - Concentrare l'estratto a circa 2 ml utilizzando un getto di azoto delicato.
- Trasferire in un flaconcino di campione da 1-2 ml e concentrarsi ulteriormente a 200 μL utilizzando un flusso di azoto delicato.
3. Analisi GC-MS ed elaborazione dei dati
- Analizzare i concentrati di aroma preparati nella sezione 2 del protocollo utilizzando un sistema GC-MS (Figura 2) dotato di colonne capillari di silice fusa (vedere la Tabella dei Materiali).
- Utilizzare l'elio come gas vettore con una velocità lineare di 40 cm/s.
- Iniettare 3 μL del concentrato in modalità di iniezione splitless.
- Impostare il programma di temperatura del forno GC: (1) tenere a 40 °C per 5 minuti; 2) aumentare a 200 °C a 5 °C/min; 3) aumentare a 280 °C a 10 °C/min; (4) tenere a 280 °C per 10 min.
- Azionare il rivelatore selettivo di massa in modalità EI positiva13 con un intervallo di scansione di massa da 30 m/z a 350 m/z a 70 eV.
- Deconvolutare i dati GC-MS utilizzando l'Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System (AMDIS, vedere la tabella dei materiali).
- Abbinare e qualificare i dati dopo la deconvoluzione utilizzando il programma di ricerca dello spettrometro di massa NIST (National Institute of Standards and Technology) 173.
- Calcolare l'indice di ritenzione dei composti14 in base al risultato di un insieme di n-alcani (C5-C25, vedere la Tabella dei Materiali) nelle stesse condizioni GC.
- Identificare i picchi GC utilizzando la libreria di spettrometria di massa NIST e il database degli indici di ritenzione in base alla corrispondenza simultanea degli indici di massa e di ritenzione.
- Calcolare la concentrazione di ciascun componente volatile nel campione SAFE rispetto allo standard interno utilizzando l'area di picco TIC (cromatografia ionica totale).
- Ripetere l'analisi tre volte, a partire dalla preparazione dell'infusione di tè.
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Representative Results
La procedura analitica sopra descritta è illustrata in questa sezione utilizzando l'esempio dell'analisi dell'aroma di campioni di tè nero e tè verde.
Un cromatogramma GC-MS rappresentativo è mostrato nella Figura 3. La Figura 3A mostra un insieme di n-alcani e la Figura 3B mostra il profilo di uno standard interno. I risultati della valutazione per gli estratti dei campioni di tè verde e tè nero sono mostrati rispettivamente nella Figura 3C e nella Figura 3D. Analizzando gli standard interni, è possibile rilevare un picco definitivo con una linea di base stabile (Figura 3B). Il cromatogramma GC mostra i profili GC completi ottenuti dagli estratti di tè verde e infuso di tè nero dopo il conteggio totale degli ioni.
Un totale di 104 composti aromatici sono stati identificati nei campioni di tè verde e tè nero mediante spettrometria di massa combinata con l'indice di ritenzione. La quantificazione relativa è stata calcolata dall'area di picco del composto rispetto allo standard interno. La mappa di calore, disegnata in base ai risultati qualitativi e quantitativi, mostra il contenuto di composti aromatici rispetto allo standard interno per i campioni di tè verde e tè nero (Figura 4).
Figura 1: Schema del sistema SAFE. (1) Il flacone campione per la raccolta del campione. (2) La valvola del vuoto; Il sistema deve essere tenuto chiuso prima di aggiungere campioni e il flusso di goccia del campione deve essere regolato in modo appropriato. (3) La bottiglia di distillazione per la distillazione del campione. (4) La bottiglia di raccolta per la raccolta del campione distillato. (5) La trappola fredda per il recupero di campioni non raccolti dalla bottiglia di raccolta e per impedire al solvente di entrare nella pompa per vuoto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Schema del sistema GC-MSD. Il sistema GC/MS è dotato di (1) una porta di iniezione multimodale, (2) un modulo di controllo del flusso (PCM) che controlla il flusso del vettore di elio, (3) una colonna capillare di 60 m x 0,25 m x 0,25 m 5 ms e (4) un forno a colonna GC. Gli estratti di tè nel campione iniettato vengono separati nella colonna GC, attraverso la quale scorre il gas vettore e aumenta la temperatura del forno. I componenti vengono ionizzati da una sorgente di ioni EI e quindi analizzati in un analizzatore di massa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Tipico cromatogramma ionico totale da un'analisi GC-MS di successo. (A) Il cromatogramma degli n-alcani. Tutti i picchi di n-alcani sono assegnati al corrispondente numero di carbonio. (B) Il cromatogramma dello standard interno (paraxilene-d10). C) Profilo aromatico rappresentativo dell'infuso di tè verde. D) Profilo aromatico rappresentativo dell'infuso di tè nero. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Mappa termica di 104 composti aromatici identificati nei campioni di tè nero (BT) e tè verde (GT). Il numero accanto alla nota a colori sul lato destro della mappa di calore indica il contenuto del composto (relativo allo standard interno). La profondità del colore indica il livello di contenuto di materia; Più profondo è il colore, maggiore è il contenuto relativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo articolo descrive un metodo efficiente per analizzare i composti volatili nelle infusioni di tè utilizzando l'analisi SAFE e GC-MS.
Le infusioni di tè hanno una matrice complessa con un alto contenuto di componenti non volatili. Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per isolare i componenti volatili dalle infusioni di tè. Un metodo comune è l'estrazione simultanea per distillazione (SDE)15,16. Tuttavia, non è adatto per l'analisi degli aromi del tè perché le foglie di tè devono essere bollite con acqua per l'intero processo di distillazione/estrazione, il che comporta una reazione chimica dei componenti del tè e, quindi, produce un profilo di odore molto diverso dal campione originale17. SAFE distilla l'infuso di tè a bassa temperatura sotto vuoto, riducendo così al minimo i cambiamenti negli analiti e consentendo di preservare la composizione aromatica originale.
La microestrazione in fase solida (SPME) è un altro metodo comunemente usato per l'analisi dell'aroma del tè18,19. I suoi vantaggi risiedono nella procedura semplice e priva di solventi. Tuttavia, la selettività dell'adsorbimento delle fibre dei componenti aromatici rende difficile ottenere un profilo quantitativo che rifletta le caratteristiche aromatiche del campione, il che limita l'applicazione di questo metodo per l'analisi dell'aroma del tè20.
La tecnica di trasferimento ad alto vuoto (HVT) è stata sviluppata per ridurre la possibilità che si formino artefatti nelle analisi degli aromi21. Tuttavia, l'HVT ha una bassa resa di estrazione per sostanze con alti punti di ebollizione e forte polarità, che ne limita l'ambito di utilizzo.
A differenza dei metodi personalizzati di cui sopra, il distillato SAFE di un infuso di tè è privo di componenti non volatili22,23,24. L'aroma nel distillato può essere estratto quantitativamente utilizzando solventi organici, il che significa che è possibile ottenere un estratto con un profilo di odore vicino al campione originale. Engel et al.11 hanno distillato miscele di n-alcani utilizzando la distillazione HVT o SAFE per verificarne l'efficienza. Le rese del distillato utilizzando il sistema SAFE sono risultate significativamente superiori a quelle dell'HVT per ciascun alcano. Inoltre, gli alcani con punti di ebollizione inferiori a 285 °C potrebbero essere completamente recuperati da SAFE.
È necessario prestare particolare attenzione ai dettagli sperimentali per ulteriori analisi di successo. (1) La pressione del vuoto durante la distillazione SAFE può influire sul recupero dei componenti volatili e deve essere mantenuta a un livello elevato, ad esempio rallentando l'aggiunta del campione. (2) È necessario assicurarsi che la bottiglia di raccolta sia immersa in azoto liquido prima che il sistema ritorni alla pressione atmosferica per evitare che i volatili del solvente vengano condensati dalla trappola del freddo in alto a destra o entrino nella pompa per vuoto. (3) Si dovrebbe assicurarsi che l'acqua circolante sia accesa per prima e spenta per ultima. L'acqua circolante deve essere spenta solo dopo che l'azoto liquido è stato rimosso; in caso contrario, bloccherà il dispositivo. (4) Il bagno d'acqua deve essere agitato con un magnete per facilitare il trasferimento di calore.
In questo studio, la distillazione SAFE è stata eseguita prima dell'estrazione con solvente. È anche possibile una procedura inversa, e ciò sarebbe particolarmente vantaggioso se prima venisse estratto un grande volume di infusione di tè e l'estratto ottenuto venisse poi distillato da SAFE. La sfida dell'estrazione per infusione utilizzando un solvente organico è la possibile formazione di un'emulsione. In questo caso, sono necessari ulteriori passaggi per recuperare lo strato organico, come la centrifugazione o la scelta di solventi diversi. Dopo l'esperimento, il gruppo vetro SAFE deve essere pulito. L'etanolo o l'acetone possono essere usati come solvente per la pulizia. Le parti devono essere asciugate prima dell'uso.
In sintesi, questo protocollo propone un metodo per ottenere un concentrato aromatico con un profilo di odore vicino al campione di tè originale utilizzando la distillazione SAFE seguita dall'estrazione con solvente. Questo metodo può essere applicato a tutti i tipi di campioni di tè, inclusi, ad esempio, polveri di tè istantaneo e concentrati di tè, ed è adatto per studi sensoriali molecolari del tè.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (32002094, 32102444), dal China Agriculture Research System di MOF e MARA (CARS-19) e dal Progetto di innovazione per l'Accademia cinese delle scienze agricole (CAAS-ASTIP-TRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkane mix (C10-C25) | ANPEL | CDAA-M-690035 | |
| Alkane mix (C5-C10) | ANPEL | CDAA-M-690037 | |
| AMDIS | National Institute of Standards and Technology | version 2.72 | Gaithersburg, MD |
| Analytical balance | OHAUS | EX125DH | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm | ||
| Anhydrous sodium sulfate | aladdin | ||
| Black tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| Concentrator | Biotage | TurboVap | |
| Data processor | Agilent | MassHunter | |
| Dichloromethane | TEDIA | ||
| GC | Agilent | 7890B | |
| GC column | Agilent | DB-5MS | |
| Green tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| MS | Agilent | 5977B | |
| p-Xylene-d10 | Sigma-Aldrich | ||
| SAFE | Glasbläserei Bahr | ||
| Ultra-pure deionized water | Milipore | Milli-Q | |
| Vacuum pump | Edwards | T-Station 85H |
References
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