Summary
Представлен метод обогащения и анализа летучих компонентов чайных экстрактов с использованием ароматизатора с помощью растворителя и экстракции растворителем с последующей газовой хромато-масс-спектрометрией, который может быть применен ко всем типам образцов чая.
Abstract
Аромат чая является важным фактором качества чая, но его сложно проанализировать из-за сложности, низкой концентрации, разнообразия и лабильности летучих компонентов чайного экстракта. В данной работе представлен метод получения и анализа летучих компонентов чайного экстракта с сохранением запаха с помощью выпаривания ароматизатора с помощью растворителя (SAFE) и экстракции растворителем с последующей газовой хромато-масс-спектрометрией (ГХ-МС). SAFE — это метод высоковакуумной дистилляции, который позволяет изолировать летучие соединения из сложных пищевых матриц без каких-либо нелетучих помех. В этой статье представлена полная пошаговая процедура анализа аромата чая, включая приготовление чайного настоя, экстракцию растворителем, безопасную дистилляцию, концентрирование экстракта и анализ методом ГХ-МС. Эта процедура была применена к двум образцам чая (зеленый чай и черный чай), и были получены качественные и количественные результаты по летучему составу образцов чая. Этот метод может быть использован не только для анализа ароматов различных типов образцов чая, но и для молекулярно-органолептических исследований на них.
Introduction
Чай является любимым напитком многих людей во всем мире 1,2. Аромат чая является критерием качества, а также фактором, определяющим цену на чайные листья 3,4. Таким образом, анализ ароматического состава и содержания чая имеет большое значение для молекулярно-органолептических исследований и контроля качества чая. В результате, анализ ароматического состава стал важной темой в исследованиях чая в последние годы 5,6,7.
Содержание ароматических компонентов в чае очень низкое, так как они обычно составляют всего 0,01%-0,05% сухой массы чайных листьев8. Кроме того, большое количество нелетучих компонентов в матрице образца существенно затрудняет анализ методом газовой хроматографии 9,10. Поэтому процедура пробоподготовки необходима для выделения летучих соединений в чае. Ключевым моментом при выборе метода выделения и обогащения является минимизация матричных помех и, в то же время, максимальное сохранение первоначального профиля запаха образца.
Выпаривание ароматизатора с помощью растворителя (SAFE), первоначально разработанное Энгелем, Баром и Шиберле, представляет собой усовершенствованный метод высоковакуумной дистилляции, используемый для выделения летучих соединений из сложных пищевых матриц11,12. Компактный стеклянный узел, соединенный с высоковакуумным насосом (при типичном рабочем давлении 5 x 10−3 Па), может эффективно собирать летучие соединения из экстрактов растворителей, маслянистых пищевых продуктов и водных образцов.
В данной статье описан метод, сочетающий технику SAFE с экстракцией растворителем для выделения летучих веществ из настоя черного чая с последующим анализом с помощью ГХ-МС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление внутреннего стандарта и чайного настоя
- Исходный раствор: Растворите 10,0 мг параксилола-d10 (см. таблицу материалов) в 10,0 мл безводного этанола для приготовления исходного раствора 1000 ppm внутреннего стандарта.
- Рабочий раствор: Разбавить 1 мл исходного раствора (шаг 1.1) до 100 мл чистой водой для приготовления рабочего раствора 10 ppm внутреннего стандарта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор должен быть приготовлен в тот же день, что и анализ. - Поместите 3 г чайных листьев (как для зеленого, так и для черного чая, см. Таблицу материалов) в колбу Эрленмейера и залейте 150 мл кипятка. Накройте колбу стеклянной пробкой.
- Через 5 мин быстро процедите чайный настой через сито на 300 меш.
- Отработанные чайные листья дважды промыть 30 мл воды и соединить промывочный раствор с чайным настоем.
- Быстро остудите чайный настой до комнатной температуры на водяной бане с ледяной водой.
- Добавьте в чайный настой 1,00 мл рабочего раствора (шаг 1.2) и хорошо перемешайте.
2. Дистилляция чайного настоя методом SAFE и жидкостно-жидкостной экстракции дистиллята
- Подготовьте сборку SAFE, выполнив следующие действия.
- Установите узел SAFE (Рисунок 1) и подсоедините дистилляционную бутылку в левом нижнем углу (Рисунок 1[3]) и бутылку для сбора в правом нижнем углу (Рисунок 1[4]). Подсоедините трубку циркуляционной воды в задней части стеклянного узла SAFE. Установите холодную ловушку (Рисунок 1[5]) и подсоедините трубку к вакуумному насосу (см. Таблицу материалов) в правом верхнем углу стеклянного узла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте соединение трубки циркуляционной воды; Убедитесь, что входное отверстие входит вверху, а выходное — снизу. Используйте деионизированную воду для циркуляции, чтобы предотвратить засорение накипью белой трубки в узле SAFE, что приведет к плохой циркуляции циркулирующей воды и, в конечном итоге, к взрыву узла SAFE. Дистилляционное дно (рис. 1[3]) может перемешиваться мешалкой для облегчения испарения пробы. - Установите температуру циркулирующей воды на 50 °C, а температуру водяной бани для колбы с образцом на 40 °C. Закройте вакуумный клапан (Рисунок 1[2]).
- Установите узел SAFE (Рисунок 1) и подсоедините дистилляционную бутылку в левом нижнем углу (Рисунок 1[3]) и бутылку для сбора в правом нижнем углу (Рисунок 1[4]). Подсоедините трубку циркуляционной воды в задней части стеклянного узла SAFE. Установите холодную ловушку (Рисунок 1[5]) и подсоедините трубку к вакуумному насосу (см. Таблицу материалов) в правом верхнем углу стеклянного узла.
- Выполните операцию вакуумного насоса.
- Включите вакуумный насос.
- Постепенно увеличивайте скорость до максимальной скорости 100%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если скорость не достигает 100%, проверьте, герметична ли система и нет ли внутри системы остатков растворителя. - После достижения высокого вакуума (предпочтительно 10-3 Па)
ПРИМЕЧАНИЕ: Вакуум улучшится, когда жидкий азот будет добавлен в холодную ловушку.
- Выполните дистилляцию образца.
- Запустите циркуляцию воды.
- Добавьте жидкий азот в холодную ловушку, чтобы покрыть внешнюю часть бутылки для сбора.
- Перелейте чайный настой в воронку для образцов в левом верхнем углу (Рисунок 1[1]), а затем накройте ее стеклянной пробкой.
- Вводят пробу в дистилляционную колбу по каплям. Контролируйте скорость падения образца таким образом, чтобы вакуум поддерживался в надлежащем диапазоне около 10−3 Па.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте жидкий азот во время процесса, чтобы гарантировать, что подходящая сборная бутылка всегда погружена в жидкий азот. Старайтесь не допускать образования конденсата в холодной ловушке.
- Выключите вакуумный насос после завершения дистилляции.
- Нажмите выключатель питания . Когда "STOP" начнет мигать, нажмите клавишу Enter для подтверждения.
- Отключите шнур питания, когда скорость молекулярного насоса уменьшится до «0».
ПРИМЕЧАНИЕ: Перезапускайте только тогда, когда скорость уменьшится до «0».
- Восстановите в системе атмосферное давление.
- Снимите размолочную пробку над бутылкой для отбора проб.
- Медленно открутите ручку вакуумного клапана, чтобы восстановить в системе атмосферное давление.
- Снимите бутылку для сбора с образцом.
- Удалите жидкий азот из емкости для сбора после восстановления системы до атмосферного давления.
- Медленно отвинтите флакон для сбора. Осторожно снимите бутылку для сбора с образцом.
- Закройте циркуляцию воды.
- Выполните жидкостно-жидкостную экстракцию БЕЗОПАСНОГО дистиллята.
- Дайте дистилляту SAFE в бутылке нагреться до комнатной температуры.
- Трижды извлеките дистиллят SAFE с 50 мл дихлорметана (см. Таблицу материалов).
- Соедините слои дихлорметана. Высушите экстракт безводным сульфатом натрия (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Безводный сульфат натрия в растворителе считается достаточно сухим, когда он больше не цементируется и может свободно течь. - Концентрируйте экстракт примерно до 2 мл, используя мягкую струю азота.
- Перелейте во флакон образца объемом 1-2 мл и далее концентрируйте до 200 мкл с помощью щадящей струи азота.
3. Анализ и обработка данных ГХ-МС
- Проанализируйте ароматические концентраты, приготовленные в разделе 2 протокола, с помощью системы ГХ-МС (рис. 2), оснащенной капиллярными колонками из плавленого кремнезема (см. таблицу материалов).
- Используйте гелий в качестве газа-носителя с линейной скоростью 40 см/с.
- Ввести 3 мкл концентрата в режиме бесщепленного впрыска.
- Установите программу температуры духовки GC: (1) держите при температуре 40 °C в течение 5 минут; (2) повышение до 200 °C при 5 °C/мин; (3) повышение до 280 °C при 10 °C/мин; (4) Держать при температуре 280 °C в течение 10 мин.
- Масс-селективный детектор работает в режиме положительного ЭИ13 с диапазоном масс-сканирования от 30 м/з до 350 м/з при напряжении 70 эВ.
- Деконволюция данных ГХ-МС с помощью Автоматизированной системы масс-спектральной деконволюции и идентификации (AMDIS, см. таблицу материалов).
- Сопоставление и уточнение данных после деконволюции с помощью программы поиска масс-спектрометра NIST (Национальный институт стандартов и технологий)17 3.
- Рассчитайте индекс удержания соединений14 по результату набора н-алканов (С5-С25, см. таблицу материалов) при тех же условиях ГХ.
- Определите пики GC с помощью библиотеки масс-спектрометрии NIST и базы данных индекса удержания на основе одновременного сопоставления индексов массы и удержания.
- Рассчитайте концентрацию каждого летучего компонента в образце SAFE относительно внутреннего стандарта, используя пиковую площадь TIC (общая ионная хроматография).
- Повторите анализ три раза, начиная с приготовления чайного настоя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанная выше аналитическая процедура проиллюстрирована в данном разделе на примере анализа аромата образцов черного чая и зеленого чая.
Репрезентативная хроматограмма ГХ-МС показана на рисунке 3. На рисунке 3A показан набор н-алканов, а на рисунке 3B показан профиль внутреннего стандарта. Результаты оценки экстрактов из образцов зеленого и черного чая показаны на рисунке 3C и рисунке 3D соответственно. Анализируя внутренние стандарты, можно обнаружить один окончательный пик со стабильным базовым уровнем (рис. 3B). Хроматограмма ГХ показывает полные профили ГХ, полученные из экстрактов настоя зеленого чая и черного чая после подсчета общего количества ионов.
В общей сложности 104 ароматических соединения были идентифицированы в образцах зеленого и черного чая с помощью масс-спектрометрического сопоставления в сочетании с индексом удержания. Относительная количественная оценка рассчитывалась по площади пика соединения относительно внутреннего эталона. Тепловая карта, составленная по качественным и количественным результатам, показывает содержание ароматических соединений относительно внутреннего стандарта для образцов зеленого и черного чая (рис. 4).
Рисунок 1: Принципиальная схема системы SAFE. (1) Бутылка для отбора проб. (2) Вакуумный клапан; Перед добавлением образцов система должна быть закрыта, а капельный поток пробы должен быть соответствующим образом отрегулирован. (3) Дистилляционная бутылка для дистилляции образца. (4) Бутылка для сбора дистиллированной пробы. (5) Холодная ловушка для извлечения проб, не собранных в бутылку для сбора, и для предотвращения попадания растворителя в вакуумный насос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Принципиальная схема системы GC-MSD. Система GC/MS оснащена (1) многорежимным портом впрыска, (2) модулем управления потоком (PCM), который управляет потоком носителя гелия, (3) капиллярной колонной размером 60 м x 0,25 м x 0,25 м и 5 мс и (4) колонной печью GC. Чайные экстракты во введенном образце отделяются в колонне ГХ, через которую проходит газ-носитель и повышается температура печи. Компоненты ионизируются источником ионов EI, а затем анализируются в масс-анализаторе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Типичная хроматограмма общих ионов при успешном анализе ГХ-МС. (А) Хроматограмма н-алканов. Все пики н-алканов относятся к соответствующему углеродному числу. (Б) Хроматограмма внутреннего эталона (параксилол-d10). (C) Репрезентативный профиль аромата настоя зеленого чая. (D) Репрезентативный ароматический профиль настоя черного чая. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Тепловая карта 104 ароматических соединений, идентифицированных в образцах черного чая (BT) и зеленого чая (GT). Цифра рядом с цветовым обозначением в правой части тепловой карты указывает на содержание соединения (относительно внутреннего стандарта). Глубина цвета указывает на уровень содержания материи; Чем насыщеннее цвет, тем выше относительное содержание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной статье описан эффективный метод анализа летучих соединений в чайных настоях с использованием SAFE и GC-MS анализа.
Чайные настои имеют сложную матрицу с высоким содержанием нелетучих компонентов. В литературе описано несколько методов выделения летучих компонентов из чайных настоев. Распространенным методом является симультанная дистилляционная экстракция (СДЭ)15,16. Однако он не подходит для анализа ароматов чая, поскольку чайные листья должны быть прокипячены с водой в течение всего процесса дистилляции/экстракции, в результате чего компоненты чая вступают в химическую реакцию и, таким образом, дают профиль запаха, сильно отличающийся от исходного образца17. SAFE дистиллирует чайный настой при низкой температуре под высоким вакуумом, что сводит к минимуму изменения в анализируемых веществах и позволяет сохранить первоначальный ароматический состав.
Твердофазная микроэкстракция (SPME) является еще одним методом, обычно используемым для анализа аромата чая18,19. Его преимущества заключаются в простой и не требующей растворителей процедуре. Однако селективность адсорбции волокон ароматических компонентов затрудняет получение количественного профиля, отражающего ароматические характеристики образца, что ограничивает применение этого метода для анализа аромата чая20.
Метод высоковакуумного переноса (HVT) был разработан для снижения вероятности образования артефактов при анализе ароматов21. Однако HVT имеет низкий выход экстракции для веществ с высокой температурой кипения и сильной полярностью, что ограничивает сферу его использования.
В отличие от вышеуказанных пользовательских методов, БЕЗОПАСНЫЙ дистиллят чайного настоя не содержит никаких нелетучих компонентов22,23,24. Аромат в дистилляте может быть количественно экстрагирован с помощью органических растворителей, что означает, что можно получить экстракт с профилем запаха, близким к исходному образцу. Engel et al.11 дистиллировали смеси н-алканов с помощью дистилляции HVT или SAFE для проверки эффективности. Было обнаружено, что выход дистиллята с использованием системы SAFE значительно выше, чем выход HVT для каждого алкана. Кроме того, алканы с температурой кипения ниже 285 °C могут быть полностью восстановлены с помощью SAFE.
Для дальнейшего успешного анализа необходимо уделять пристальное внимание деталям эксперимента. (1) Вакуумное давление во время безопасной дистилляции может повлиять на извлечение летучих компонентов и должно поддерживаться на высоком уровне, например, путем замедления добавления образца. (2) Необходимо убедиться, что сборная бутылка погружена в жидкий азот до того, как система вернется к атмосферному давлению, чтобы избежать конденсации летучих растворителей в верхней правой холодной ловушке или попадания в вакуумный насос. (3) Следует следить за тем, чтобы циркулирующая вода включалась в первую очередь и выключалась последней. Циркуляцию воды следует отключать только после удаления жидкого азота; В противном случае это приведет к зависанию устройства. (4) Водяную баню следует перемешивать с помощью магнита, чтобы способствовать теплопередаче.
В этом исследовании перед экстракцией растворителем была проведена безопасная дистилляция. Возможна и обратная процедура, и это будет особенно выгодно, если сначала экстрагируется большой объем чайного настоя, а затем полученный экстракт дистиллируется с помощью SAFE. Сложность инфузионной экстракции с использованием органического растворителя заключается в возможном образовании эмульсии. В этом случае необходимы дополнительные действия для восстановления органического слоя, такие как центрифугирование или выбор различных растворителей. После эксперимента стеклянный узел SAFE необходимо очистить. В качестве чистящего растворителя можно использовать этанол или ацетон. Перед использованием детали следует высушить.
Таким образом, в этом протоколе предлагается метод получения ароматического концентрата с профилем запаха, близким к исходному образцу чая, с использованием безопасной дистилляции с последующей экстракцией растворителем. Этот метод может быть применен ко всем типам образцов чая, включая, например, растворимые чайные порошки и чайные концентраты, и хорошо подходит для молекулярно-органолептических исследований чая.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (32002094, 32102444), Китайской системой сельскохозяйственных исследований Министерства финансов и МАРА (CARS-19) и Инновационным проектом для Китайской академии сельскохозяйственных наук (CAAS-ASTIP-TRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkane mix (C10-C25) | ANPEL | CDAA-M-690035 | |
| Alkane mix (C5-C10) | ANPEL | CDAA-M-690037 | |
| AMDIS | National Institute of Standards and Technology | version 2.72 | Gaithersburg, MD |
| Analytical balance | OHAUS | EX125DH | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm | ||
| Anhydrous sodium sulfate | aladdin | ||
| Black tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| Concentrator | Biotage | TurboVap | |
| Data processor | Agilent | MassHunter | |
| Dichloromethane | TEDIA | ||
| GC | Agilent | 7890B | |
| GC column | Agilent | DB-5MS | |
| Green tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| MS | Agilent | 5977B | |
| p-Xylene-d10 | Sigma-Aldrich | ||
| SAFE | Glasbläserei Bahr | ||
| Ultra-pure deionized water | Milipore | Milli-Q | |
| Vacuum pump | Edwards | T-Station 85H |
References
- Liang, S., et al. Processing technologies for manufacturing tea beverages: From traditional to advanced hybrid processes. Trends in Food Science & Technology. 118, 431-446 (2021).
- Guo, X. Y., Ho, C. T., Schwab, W., Wan, X. C. Aroma profiles of green tea made with fresh tea leaves plucked in summer). Food Chemistry. 363, 130328 (2021).
- Feng, Z. H., Li, M., Li, Y. F., Wan, X. C., Yang, X. G. Characterization of the orchid-like aroma contributors in selected premium tea leaves. Food Research International. 129, 108841 (2020).
- Hong, X., et al. Characterization of the key aroma compounds in different aroma types of Chinese yellow tea. Foods. 12 (1), 27 (2023).
- Flaig, M., Qi, S. C., Wei, G., Yang, X., Schieberle, P. Characterisation of the key aroma compounds in aLongjinggreen tea infusion (Camellia sinensis) by the sensomics approach and their quantitative changes during processing of the tea leaves. European Food Research and Technology. 246 (12), 2411-2425 (2020).
- Feng, Z., et al. Tea aroma formation from six model manufacturing processes. Food Chemistry. 285, 347-354 (2019).
- Wang, J. -Q., et al. Effects of baking treatment on the sensory quality and physicochemical properties of green tea with different processing methods. Food Chemistry. 380, 132217 (2022).
- Zhai, X., Zhang, L., Granvogl, M., Ho, C. -T., Wan, X. Flavor of tea (Camellia sinensis): A review on odorants and analytical techniques. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 21 (5), 3867-3909 (2022).
- Chaturvedula, V. S. P., Prakash, I. The aroma, taste, color and bioactive constituents of tea. Journal of Medicinal Plants Research. 5 (11), 2110-2124 (2011).
- Ridgway, K., Lalljie, S. P. D., Smith, R. M. Sample preparation techniques for the determination of trace residues and contaminants in foods. Journal of Chromatography A. 1153 (1-2), 36-53 (2007).
- Engel, W., Bahr, W., Schieberle, P. Solvent assisted flavour evaporation - A new and versatile technique for the careful and direct isolation of aroma compounds from complex food matrices. European Food Research and Technology. 209 (3-4), 237-241 (1999).
- Wang, B., et al. Characterization of aroma compounds of Pu-erh ripen tea using solvent assisted flavor evaporation coupled with gas chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-olfactometry. Food Science and Human Wellness. 11 (3), 618-626 (2022).
- Zou, C., et al. Zijuan tea- based kombucha: Physicochemical, sensorial, and antioxidant profile. Food Chemistry. 363, 130322 (2021).
- Vandendool, H., Kratz, P. D. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. Journal of Chromatography. 11, 463-471 (1963).
- Khvalbota, L., Virba, M., Furdikova, K., Spanik, I. Simultaneous distillation-solvent extraction gas chromatography-mass spectrometry analysis of Tokaj Muscat Yellow wines. Separation Science Plus. 5 (8), 393-406 (2022).
- Ayalew, Y., et al. Volatile organic compounds of anchote tuber and leaf extracted using simultaneous steam distillation and solvent extraction. International Journal of Food Science. 2022, 3265488 (2022).
- Zhu, M., Li, E., He, H. Determination of volatile chemical constitutes in tea by simultaneous distillation extraction, vacuum hydrodistillation and thermal desorption. Chromatographia. 68 (7-8), 603-610 (2008).
- Lau, H., et al. Characterising volatiles in tea (Camellia sinensis). Part I: Comparison of headspace-solid phase microextraction and solvent assisted flavour evaporation. Lwt-Food Science and Technology. 94, 178-189 (2018).
- Li, Z. W., Wang, J. H. Analysis of volatile aroma compounds from five types of Fenghuang Dancong tea using headspace-solid phase microextraction combined with GC-MS and GC-olfactometry. International Food Research Journal. 28 (3), 612-626 (2021).
- Dong, F., et al. Herbivore-induced volatiles from tea (Camellia sinensis) plants and their involvement in intraplant communication and changes in endogenous nonvolatile metabolites. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (24), 13131-13135 (2011).
- Acena, L., Vera, L., Guasch, J., Busto, O., Mestres, M. Comparative study of two extraction techniques to obtain representative aroma extracts for being analysed by gas chromatography-olfactometry: Application to roasted pistachio aroma. Journal of Chromatography A. 1217 (49), 7781-7787 (2010).
- Kumazawa, K., Wada, Y., Masuda, H. Characterization of epoxydecenal isomers as potent odorants in black tea (Dimbula) infusion. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (13), 4795-4801 (2006).
- Wu, H. T., et al. Effects of three different withering treatments on the aroma of white tea. Foods. 11 (16), 2502 (2022).
- Wang, J., et al. Decoding the specific roasty aroma Wuyi rock tea (Camellia sinensis: Dahongpao) by the sensomics approach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (34), 10571-10583 (2022).
