Summary
在这里，我们提供了由 根癌农杆菌 介导的一步转化方法的详细协议，以生产复合植物。
Abstract
使用根茎农杆菌介导的毛根转化生产具有转基因根和非转基因茎芽的复合植物是研究 根相关生物学的有力工具。毛根转化在广泛的双子叶植物和几种单子叶植物中建立，并且几乎独立于基因型。传统的下胚轴注射根 茎得到 复合植株的方法效率低下、耗时、费力，且经常导致嫩小下胚轴植株死亡。此前建立了以根 茎曲霉 介导的高效一步法毛根转化，无需在产生毛根后进行移植。本研究切除部分下胚轴和主根，下胚轴切口部位涂有 根茎曲霉， 然后将下胚轴种植在无菌蛭石中。栽培12天后，下胚轴切口扩大，诱导新的毛根。本文提供了由 根茎介导的一步转化方法的详细方案，其有效性通过生产野生大豆、 美洲茄和南瓜的复合植物来证明。
Introduction
根茎农杆菌是根茎科革兰氏阴性土壤细菌。 A. rhanzogenes可以通过伤口感染几乎所有的双子叶植物，少数单子叶植物和单个裸子植物，在受感染的植物中产生毛根。细菌携带Ri（发根）质粒，Ri质粒的T-DNA携带opine合成基因和rol基因（根位点基因）。Ri质粒的T-DNA进入植物细胞并整合到宿主染色体中后，rol基因的表达诱导毛根的产生1。携带靶基因的植物二元表达载体转化为根茎曲霉，转化后的根茎曲霉用于感染植物。转基因根可以在受感染的植物中诱导，产生含有转基因根和非转基因茎和芽的复合植物。通常，复合植物可以在14-20天内获得。根茎介导的毛根转化在双子叶植物中一般不受基因型的限制2。根茎感染植物产生的毛根具有生长速度快、遗传稳定、操作方便等特点。由根茎A. rhizogene介导的毛根转化目前广泛用于研究与根相关的生物学。此外，毛根的转化也可用于验证和优化CRISPR/Cas9系统3,4,5和蛋白质亚细胞定位的靶点编辑效率。因此，毛根转化是研究植物基因功能、代谢工程以及根与根际微生物相互作用的重要工具6,7,8。
通过毛根转化获得的含有转基因根的复合植物已在双子叶植物中广泛生产，特别是在豆科植物中。将下胚轴注射根茎曲霉的传统方法已被用于生产复合莲花9，大豆10，番茄11，甘薯12和许多其他植物5,8。下胚轴注射方法效率低下，可能导致幼小或微小的下胚轴植物死亡。因此，通过切断胚根，用根茎涂覆幼苗切口，然后将下胚轴置于无菌培养基上进行生根栽培来改进该方法13。但是，这些步骤是在无菌环境中进行的，并且操作步骤相对繁琐。特别是，由此产生的复合植物需要移植，这增加了工作量。在以前的工作中，在黄瓜、大豆、粳米莲、芥芷和番茄2,14,15,16,17中建立了一步法根茎介导的（ARM）毛根转化。去除主根和部分下胚轴，在剩余下胚轴的切口部位涂覆转化根茎，然后将幼苗种植到湿润的无菌蛭石中。栽培12天后，切口部位产生毛根。一步法 ARM 方法非常高效，产生毛根所需的时间更少。形成毛根后移植也是没有必要的。由于无需移植即可避免微生物污染，因此一步法ARM方法在研究植物与微生物之间的相互作用时特别有用，例如豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮，以及植物与丛枝菌根真菌之间的共生。本文提供了详细的一步法根茎介导的毛根转化方案，并以野生大豆、美洲茄和南瓜中生产的复合植物为例。使用该协议，研究人员可以顺利地执行一步式ARM转换。
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Protocol
1. 植物生长条件与根茎培养
- 播种
注：野生大豆种子采自中国聊城阳谷县;美洲南瓜和 南 瓜当地品种银苏的种子是从市场上购买的。- 收集野生大豆，美洲南瓜和当地 南瓜品种的种子，将它们播种在1厘米深的蛭石中，并彻底浇水。将 20 颗种子种植在 8 厘米 x 11 厘米 x 9 厘米的塑料盒中。在24±2°C的生长室中以约70%相对湿度进行16小时光照/ 8小时黑暗循环培养植物。
注意：播种前必须打破野生大豆种子的外套。如果研究问题集中在植物和微生物之间的相互作用上，种子、蛭石、塑料盒和水在使用前必须进行消毒。 - 根茎曲霉K599的活化和培养
注意：根茎A. rhizogenes K599菌株有一个二元载体pRed13052 携带红色荧光报告基因 DsRed2。- 从-80°C冰箱中取出根 茎曲霉 菌株K599，并在固体LB培养基（用50mg / L卡那霉素和50mg / L链霉素）上在28°C下活化细菌48小时。
- 挑选菌株K599的单个克隆，并将其在1mL含液体抗生素的LB培养基中培养12小时。
- 将500μL细菌悬浮液均匀地散布在含有固体抗生素的LB培养基上，然后在28°C下孵育24小时。
- 收集野生大豆，美洲南瓜和当地 南瓜品种的种子，将它们播种在1厘米深的蛭石中，并彻底浇水。将 20 颗种子种植在 8 厘米 x 11 厘米 x 9 厘米的塑料盒中。在24±2°C的生长室中以约70%相对湿度进行16小时光照/ 8小时黑暗循环培养植物。
2. 一步法 A . 根茎介导的毛根转化方法
- 下胚轴切口
- 7天后（将种子的播种定义为第0天），幼苗子叶刚刚展开（图1A），使用无菌的锋利手术刀切割约0.5-1厘米的下胚轴（图1B）。丢弃主根和部分下胚轴。
注意：请小心使用手术刀。
- 7天后（将种子的播种定义为第0天），幼苗子叶刚刚展开（图1A），使用无菌的锋利手术刀切割约0.5-1厘米的下胚轴（图1B）。丢弃主根和部分下胚轴。
- K599接种
- 用K599细菌涂覆下胚轴切口（图1C）。
- 将幼苗种植在潮湿的蛭石中（图1D）。
- 通过根 茎介导的毛根转化感染每个物种的 30 株植物。在四分之一强度（0.25x）Gamborg B-5碱性培养基中用5mL重悬的K599细菌悬浮液（OD600 = 0.5-0.6）浇灌每株植物（图1E）。
- 用高度透明的塑料袋（图1F）盖住花盆，并将它们放入生长室中。
3.毛根生产
- 接种后种植植物~12天，将在切口部位诱导并产生新的毛根。15天后，毛根长度通常达到2-5厘米（图2）。
- 为了确定产生的毛根是否是转基因的，检查依赖于K599中转化载体的报告基因的表达。
- 使用化学发光成像系统检测报告基因DsRed2的表达，绿色激发光在540nm处，发射波长为600nm（图2B，图2D和图2F）。
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Representative Results
高效一步法根 茎介导的毛根转化
在接种工程K599后12天，在下胚轴切口部位产生毛根。根据二元载体中所含报告基因的表达确定转基因毛根。在自然（图2A、图2C和图2E）和绿色激发光（图2B、图2D和 图2F）下观察用复合野生大豆、美洲沙门氏菌和南瓜的报告基因DsRed2转化的转基因根。
当复合植物含有至少一个转基因根时，它被指定为转基因复合植物。3个品种各接种30株中，野生大豆28株、美洲南瓜18株、 南瓜 30株为转基因复合材料。因此，毛根转化效率分别为93.3%（大豆）、60%（美洲南瓜）和100%（南瓜）。对三种类型植物的比较表明，具有厚下胚轴的植物比具有薄下胚轴的植物产生更多的转基因毛根。
图 1：一步法 A. 根茎介导的毛根转化。 （A）七日龄南瓜幼苗。（B）K599细菌溶液中下胚轴切口的顶端部分。（C）K599细菌团块涂覆下胚轴切口。（D）外植体种植在潮湿、无菌的蛭石中。（E） 用 5 mL 重悬的 K599 细菌溶液在四分之一强度 （0.25x） Gamborg B-5 碱性培养基中浇水。（F） 高透明塑料袋覆盖物。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图2：从一步法根茎介导的毛根转化中获得的复合植物。 （A，B）野生大豆，（C，D）美洲茄和（E，F）南瓜在（A，C，E）天然和（B，D，F）绿色激发光下复合植物的根。白色箭头表示转基因毛根;黑色箭头表示非转基因毛根。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
一步法根茎介导的毛根法是比下胚轴注射法更简单、更有效的复合植物生产方法。一步法ARM方法显著提高了毛根转化效率，缩短了产生毛根的时间，增加了毛根的数量，减少了所涉及的工作量。改进的转化方案最适合研究豆科植物与根瘤菌之间以及植物与丛枝菌根真菌之间的共生关系。这可以归因于这样一个事实，即在产生毛根后不需要移植复合植物，这避免了移植过程中发生的非接种菌株污染。此外，一种植物（南瓜）的转化效率为100%。
以下原因可以解释为什么一步法ARM方法在毛根转化中比下胚轴注射方法更有效。首先，虽然去除了主根，但保持了幼苗蒸腾作用。因此，蒸腾作用拉动促进了根 际真菌对 切口中下胚轴细胞的侵袭。其次，下胚轴切口引起的伤口面积大于下胚轴注射法引起的伤口面积，因此，更多的植物细胞被 根茎曲霉感染。最后，去除主根后，将下胚轴切口埋在黑暗潮湿的蛭石中，这是产生根的有利环境18。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了聊城大学研究基金（318012028）和山东省自然科学基金（ZR2020MC034）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
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