Summary
Hier bieden we het gedetailleerde protocol van een transformatiemethode in één stap, gemedieerd door Agrobacterium tumefaciens om samengestelde planten te produceren.
Abstract
Het produceren van samengestelde planten met transgene wortels en niet-transgene stengels en knoppen met behulp van Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde harige worteltransformatie is een krachtig hulpmiddel om wortelgerelateerde biologie te bestuderen. Harige worteltransformatie wordt vastgesteld in een breed scala van tweezaadlobbigen en in verschillende eenzaadlobbige soorten en is bijna onafhankelijk van het genotype. De traditionele methode van hypocotylinjectie met A. rhizogenes om samengestelde planten te verkrijgen is inefficiënt, tijdrovend, arbeidsintensief en veroorzaakt vaak de dood van zachte en kleine hypocotylplanten. Een zeer efficiënte, eenstaps harige worteltransformatie gemedieerd door A. rhizogenes werd eerder vastgesteld, waardoor de noodzaak voor transplantatie na het produceren van harige wortels wordt geëlimineerd. In deze studie werden een gedeeltelijke hypocotyl en primaire wortel verwijderd, de hypocotylincisieplaats werd bedekt met A. rhizogenes en vervolgens werden hypocotylen geplant in steriel vermiculiet. Na 12 dagen van de teelt breidde de hypocotylincisie zich uit en werden nieuwe harige wortels geïnduceerd. Dit artikel biedt het gedetailleerde protocol van een transformatiemethode in één stap, gemedieerd door A. rhizogenes, waarvan de effectiviteit wordt aangetoond door samengestelde planten van wilde sojabonen, Solanum americanum en pompoen te produceren.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes is een gramnegatieve bodembacterie uit de familie Rhizobiaceae. A. rhizogenes kan bijna alle tweezaadlobbigen, een paar eenzaadlobbigen en individuele gymnospermen via wonden infecteren en harige wortels in geïnfecteerde planten produceren. De bacterie draagt het Ri (wortel-inducerend) plasmide en het T-DNA van het Ri-plasmide draagt het opinesynthesegen en rolgenen (wortellocusgenen). Nadat het T-DNA van het Ri-plasmide een plantencel binnendringt en is geïntegreerd in een gastheerchromosoom, induceert de expressie van de rolgenen de productie van harige wortels1. Een plant binaire expressievector met een doelgen wordt omgezet in A. rhizogenes en de getransformeerde A. rhizogenes wordt gebruikt om een plant te infecteren. Transgene wortels kunnen worden geïnduceerd in geïnfecteerde planten, waardoor samengestelde planten worden geproduceerd die transgene wortels en niet-transgene stengels en knoppen bevatten. Over het algemeen kan een samengestelde plant binnen 14-20 dagen worden verkregen. A. rhizogenes-gemedieerde harige worteltransformatie wordt over het algemeen niet beperkt door genotype in tweezaadlobbige planten2. De harige wortels geproduceerd door A. rhizogenes-geïnfecteerde planten worden gekenmerkt door een snelle groeisnelheid, stabiele overerving en eenvoudige bediening. Harige worteltransformatie gemedieerd door A. rhizogenes wordt momenteel veel gebruikt om wortelgerelateerde biologie te bestuderen. Bovendien kan de transformatie van harige wortels ook worden gebruikt om de doelbewerkingsefficiëntie van het CRISPR / Cas9-systeem 3,4,5 en eiwitsubcellulaire lokalisatie te valideren en te optimaliseren. Daarom is harige worteltransformatie een belangrijk hulpmiddel bij onderzoek naar de genfunctie van planten, metabole engineering en interacties tussen wortels en rhizosfeermicro-organismen 6,7,8.
Samengestelde planten die transgene wortels bevatten die zijn verkregen door harige worteltransformatie, zijn op grote schaal geproduceerd in tweezaadlobbige planten, vooral in peulvruchten. De traditionele methode om de hypocotyl te injecteren met A. rhizogenes is gebruikt om composiet Lotus corniculatus9, sojabonen 10, tomaat11, zoete aardappelen12 en vele andere planten 5,8 te produceren. De hypocotyl-injectiemethode is inefficiënt en veroorzaakt waarschijnlijk de dood van jonge of kleine hypocotylplanten. Daarom werd de methode verbeterd door de embryonale wortels af te snijden, de zaailingincisie te bedekken met A. rhizogenes en vervolgens het hypocotyl op steriel kweekmedium te plaatsen voor bewortelingsteelt13. Die stappen worden echter uitgevoerd in een steriele omgeving en de bedieningsstappen zijn relatief omslachtig. In het bijzonder moeten de resulterende samengestelde planten worden getransplanteerd, wat de hoeveelheid werk verhoogt. In eerder werk werd eenstaps A. rhizogenes-gemedieerde (ARM) harige worteltransformatie vastgesteld in komkommer, sojabonen, Lotus japonicus, Medicago truncatula en tomaat 2,14,15,16,17. De primaire wortel en gedeeltelijke hypocotyl werden verwijderd, de incisieplaats van de resterende hypocotyl werd bedekt met getransformeerde A. rhizogenes en de zaailing werd vervolgens geplant in vochtig steriel vermiculiet. Na 12 dagen van de teelt werden harige wortels geproduceerd op de incisieplaats. De eenstaps ARM-methode is zeer efficiënt en vereist minder tijd om harige wortels te produceren. Verplanten na het vormen van harige wortels is ook niet nodig. Omdat microbiële besmetting kan worden vermeden zonder transplantatie, kan de eenstaps ARM-methode bijzonder nuttig zijn bij het bestuderen van interacties tussen planten en micro-organismen, zoals symbiotische stikstoffixatie tussen vlinderbloemige planten en Rhizobia, en symbiose tussen planten en arbusculaire mycorrhizaschimmels. In dit artikel wordt een gedetailleerd één-stap A. rhizogenes-gemedieerd harig worteltransformatieprotocol gegeven met voorbeelden van samengestelde planten geproduceerd in wilde sojabonen, Solanum americanum en pompoen. Met het protocol kunnen onderzoekers de armtransformatie in één stap soepel uitvoeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Groeiomstandigheden van planten en A. rhizogenes-cultuur
- Zaaien van zaden
OPMERKING: Wilde sojabonenzaden werden verzameld in Yanggu County, Liaocheng, China; zaden van S. americanum en pompoen lokale variëteit Yinsu werden gekocht van een markt.- Verzamel zaden van wilde sojabonen, S. americanum en de lokale variëteit van pompoen, zaai ze in vermiculiet op een diepte van 1 cm en geef ze grondig water. Plant 20 zaden in plastic dozen van 8 cm x 11 cm x 9 cm. Kweek de planten in een groeikamer bij 24 ± 2 °C met een 16 h licht/8 h dark cyclus bij ongeveer 70% relatieve vochtigheid.
OPMERKING: Jassen van wilde sojabonenzaden moeten worden gebroken voordat ze worden gezaaid. Als de onderzoeksvraag zich richt op interacties tussen planten en micro-organismen, moeten zaden, vermiculiet, plastic dozen en water voor gebruik worden gesteriliseerd. - Activering en kweek van A. rhizogenes K599
OPMERKING: De A. rhizogenes K599-stam had één binaire vector pRed13052 met een rood fluorescerend reportergen DsRed2.- Verwijder de A. rhizogenes stam K599 uit een vriezer van -80 °C en activeer de bacteriën op vast LB-medium (met 50 mg/L kanamycine en 50 mg/L streptomycine) bij 28 °C gedurende 48 uur.
- Kies een enkele kloon van stam K599 en kweek deze gedurende 12 uur in 1 ml vloeibaar antibioticumbevattend LB-medium.
- Verdeel 500 μL van de bacteriële suspensie gelijkmatig over vast antibioticumbevattend LB-medium, gevolgd door incubatie bij 28 °C gedurende 24 uur.
- Verzamel zaden van wilde sojabonen, S. americanum en de lokale variëteit van pompoen, zaai ze in vermiculiet op een diepte van 1 cm en geef ze grondig water. Plant 20 zaden in plastic dozen van 8 cm x 11 cm x 9 cm. Kweek de planten in een groeikamer bij 24 ± 2 °C met een 16 h licht/8 h dark cyclus bij ongeveer 70% relatieve vochtigheid.
2. One-step A. rhizogenes-gemedieerde harige worteltransformatiemethode
- Hypocotylincisie
- Na 7 dagen (definieer het zaaien van de zaden als dag 0), zijn zaadling zaadlobben net ontvouwd (figuur 1A), gebruik een gesteriliseerd, scherp scalpel om ongeveer 0,5-1 cm van het hypocotyl te snijden (figuur 1B). Gooi de primaire wortel en een deel van de gedeeltelijke hypocotyl weg.
OPMERKING: Gebruik de scalpel met zorg.
- Na 7 dagen (definieer het zaaien van de zaden als dag 0), zijn zaadling zaadlobben net ontvouwd (figuur 1A), gebruik een gesteriliseerd, scherp scalpel om ongeveer 0,5-1 cm van het hypocotyl te snijden (figuur 1B). Gooi de primaire wortel en een deel van de gedeeltelijke hypocotyl weg.
- K599 inenting
- Bedek de hypocotylincisie met K599-bacteriën (figuur 1C).
- Plant de zaailingen in vochtig vermiculiet (figuur 1D).
- Infecteer 30 planten van elke soort via A. rhizogenes-gemedieerde harige worteltransformatie. Geef elke plant water met 5 ml geresuspendeerde K599 bacteriële suspensie (OD600 = 0,5-0,6) in een kwartsterkte (0,25x) Gamborg B-5 basisch medium (figuur 1E).
- Bedek de potten met een zeer transparante plastic zak (figuur 1F) en plaats ze in een groeikamer.
3. Harige wortelproductie
- Laat de planten groeien gedurende ~ 12 dagen na inenting, nieuwe harige wortels zullen worden geïnduceerd en gegenereerd op de incisieplaats. Na 15 dagen bereiken de behaarde wortellengtes meestal 2-5 cm (figuur 2).
- Om te bepalen of de geproduceerde harige wortels transgeen zijn, onderzoekt u de expressie van reportergenen die afhankelijk zijn van de getransformeerde vector in K599.
- Detecteer de expressie van het reportergen DsRed2 met behulp van een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem met groen excitatielicht bij 540 nm en emissie bij 600 nm (figuur 2B, figuur 2D en figuur 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zeer efficiënte eenstaps A. rhizogenes-gemedieerde harige worteltransformatie
Harige wortels werden geproduceerd op de injectieplaats van de hypocotylincisie 12 dagen na inenting met gemanipuleerde K599. Transgene harige wortels werden bepaald op basis van de expressie van het reporter-gen in de binaire vector. Transgene wortels getransformeerd met het reportergen DsRed2 van samengestelde wilde sojabonen, S. americanum en pompoen werden waargenomen onder natuurlijk (figuur 2A, figuur 2C en figuur 2E) en groen excitatielicht (figuur 2B, figuur 2D en figuur 2F).
Wanneer een samengestelde plant ten minste één transgene wortel bevatte, werd deze aangeduid als een transgene composietplant. Onder de 30 geënte planten van elk van de drie soorten waren 28 wilde sojabonen, 18 S. Americanum en 30 pompoenplanten transgene composieten. De efficiëntie van de harige worteltransformatie was dus 93,3% (soja), 60% (S. americanum) en 100% (pompoen). Een vergelijking van de drie soorten planten gaf aan dat planten met dikke hypocotylen meer transgene harige wortels produceerden dan die met dunne hypocotylen.
Figuur 1: One-step A. rhizogenes-gemedieerde harige worteltransformatie. (A) Zeven dagen oude pompoenzaailingen. (B) Apicale deel van hypocotyl gesneden in K599 bacteriële oplossing. (C) K599 bacteriële massa die de hypocotylincisie bedekt. (D) Explant geplant in nat, steriel vermiculiet. (E) Water geven met 5 ml geresuspendeerde K599 bacteriële oplossing in kwartsterkte (0,25x) Gamborg B-5 basisch medium. (F) Zeer transparante plastic zakbedekking. Schaalstaven = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Samengestelde planten verkregen uit eenstaps A. rhizogenes-gemedieerde harige worteltransformatie. Wortels van samengestelde planten van (A,B) wilde sojabonen, (C,D) Solanum americanum en (E,F) pompoen onder (A,C,E) natuurlijk en (B,D,F) groen excitatielicht. Witte pijlen geven transgene harige wortels aan; Zwarte pijlen duiden op niet-transgene harige wortels. Schaalstaven = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eenstaps A. rhizogenes-gemedieerde harige wortelmethode is een eenvoudigere en efficiëntere methode voor het produceren van samengestelde planten dan de hypocotyl-injectiemethode. De ARM-methode in één stap verbetert de efficiëntie van harige worteltransformatie aanzienlijk, verkort de tijd om harige wortels te produceren, verhoogt het aantal harige wortels en vermindert de hoeveelheid werk die ermee gemoeid is. Het verbeterde transformatieprotocol is optimaal voor studies naar symbiose tussen vlinderbloemige planten en rhizobia en tussen planten en arbusculaire mycorrhizaschimmels. Dit kan worden toegeschreven aan het feit dat transplantatie van samengestelde planten na de productie van harige wortels niet nodig is, wat de besmetting met niet-geënte stammen die optreedt tijdens het verplanten voorkomt. Bovendien was de omzettingsefficiëntie 100% bij één plantensoort (pompoen).
De volgende redenen kunnen verklaren waarom de ARM-methode in één stap efficiënter was dan de hypocotyl-injectiemethode bij harige worteltransformatie. Ten eerste, hoewel de primaire wortel werd verwijderd, werd de transpiratie van de zaailing gehandhaafd. Transpiratietrek vergemakkelijkte dus de invasie van A. rhizogenes van hypocotylcellen in de incisie. Ten tweede was het wondgebied veroorzaakt door de hypocotylincisie groter dan dat veroorzaakt door de hypocotyl-injectiemethode, en daarom werden meer plantencellen geïnfecteerd door A. rhizogenes. Ten slotte, na het verwijderen van de primaire wortel, werd de hypocotylincisie begraven in donker en vochtig vermiculiet, wat een gunstige omgeving is om wortels te produceren18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Onderzoeksfonds van de Liaocheng Universiteit (318012028) en de Natural Science Foundation van de provincie Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
