Summary
Qui, forniamo il protocollo dettagliato di un metodo di trasformazione in un'unica fase mediato da Agrobacterium tumefaciens per produrre piante composite.
Abstract
La produzione di piante composite con radici transgeniche e steli e gemme non transgenici utilizzando la trasformazione delle radici pelose mediata da Agrobacterium rhizogenes è un potente strumento per studiare la biologia correlata alle radici. La trasformazione della radice pelosa è stabilita in una vasta gamma di dicotiledoni e in diverse specie di monocotiledoni ed è quasi indipendente dal genotipo. Il metodo tradizionale di iniezione di ipocotile con A. rhizogenes per ottenere piante composite è inefficiente, richiede tempo, laborioso e spesso causa la morte di piante ipocotiliche tenere e minuscole. In precedenza è stata stabilita una trasformazione delle radici pelose in un solo passaggio altamente efficiente, mediata da A. rhizogenes , che elimina la necessità di trapianto dopo aver prodotto radici pelose. In questo studio, un ipocotile parziale e la radice primaria sono stati rimossi, il sito di incisione ipocotilicica è stato rivestito con A. rhizogenes, e quindi gli ipocotili sono stati piantati in vermiculite sterile. Dopo 12 giorni di coltivazione, l'incisione ipocotilicica si è espansa e sono state indotte nuove radici pelose. Questo articolo fornisce il protocollo dettagliato di un metodo di trasformazione in un'unica fase mediato da A. rhizogenes, con la sua efficacia dimostrata dalla produzione di piante composite di soia selvatica, Solanum americanum e zucca.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes è un batterio del suolo gram-negativo della famiglia Rhizobiaceae. A. rhizogenes può infettare quasi tutte le dicotiledoni, alcune monocotiledoni e singole gimnosperme attraverso le ferite, producendo radici pelose nelle piante infette. Il batterio trasporta il plasmide Ri (che induce la radice) e il T-DNA del plasmide Ri trasporta il gene di sintesi dell'opina e i geni rol (geni del locus radicale). Dopo che il T-DNA del plasmide Ri entra in una cellula vegetale ed è integrato in un cromosoma ospite, l'espressione dei geni rol induce la produzione di radici pelose1. Un vettore di espressione binaria vegetale che trasporta un gene bersaglio viene trasformato in A. rhizogenes e l'A. rhizogenes trasformato viene utilizzato per infettare una pianta. Le radici transgeniche possono essere indotte nelle piante infette, producendo piante composite contenenti radici transgeniche e steli e gemme non transgenici. Generalmente, una pianta composita può essere ottenuta entro 14-20 giorni. A. La trasformazione delle radici pelose mediata da rizogeni non è generalmente limitata dal genotipo nelle piante dicotiledoni2. Le radici pelose prodotte da piante infette da A. rhizogenes sono caratterizzate da un rapido tasso di crescita, ereditarietà stabile e facilità d'uso. La trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes è attualmente ampiamente utilizzata per studiare la biologia correlata alle radici. Inoltre, la trasformazione delle radici pelose può anche essere utilizzata per convalidare e ottimizzare l'efficienza di target-editing del sistema CRISPR/Cas9 3,4,5 e la localizzazione subcellulare delle proteine. Pertanto, la trasformazione delle radici pelose è uno strumento importante nella ricerca sulla funzione genica delle piante, sull'ingegneria metabolica e sulle interazioni tra radici e microrganismi della rizosfera 6,7,8.
Le piante composite contenenti radici transgeniche ottenute attraverso la trasformazione delle radici pelose sono state ampiamente prodotte nelle piante dicotiledoni, specialmente nei legumi. Il metodo tradizionale di iniezione dell'ipocotile con A. rhizogenes è stato utilizzato per produrre Lotus corniculatus 9, soia 10, pomodoro11, patate dolci12 e molte altre piante 5,8. Il metodo di iniezione di ipocotile è inefficiente ed è probabile che causi la morte di piante ipocotiliche giovani o minuscole. Pertanto, il metodo è stato migliorato tagliando le radici embrionali, rivestendo l'incisione della piantina con A. rhizogenes e quindi posizionando l'ipocotile su terreno di coltura sterile per la coltivazione del radicamento13. Tuttavia, questi passaggi vengono eseguiti in un ambiente sterile e le fasi operative sono relativamente ingombranti. In particolare, le piante composite risultanti devono essere trapiantate, il che aumenta la quantità di lavoro. Nel lavoro precedente, la trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes (ARM) è stata stabilita in cetriolo, soia, Lotus japonicus, Medicago truncatula e pomodoro 2,14,15,16,17. La radice primaria e l'ipocotile parziale sono stati rimossi, il sito di incisione dell'ipocotile rimanente è stato rivestito con A. rhizogenes trasformato e la piantina è stata quindi piantata in vermiculite sterile umida. Dopo 12 giorni di coltivazione, le radici pelose sono state prodotte nel sito di incisione. Il metodo ARM one-step è altamente efficiente e richiede meno tempo per produrre radici pelose. Anche il trapianto dopo aver formato radici pelose non è necessario. Poiché la contaminazione microbica può essere evitata senza trapianto, il metodo ARM in un'unica fase può essere particolarmente utile quando si studiano le interazioni tra piante e microrganismi, come la fissazione simbiotica dell'azoto tra leguminose e rizobia e le simbiosi tra piante e funghi micorrizici arbuscolari. In questo articolo, viene fornito un dettagliato protocollo di trasformazione delle radici pelose mediato da A. rhizogenes con esempi di piante composite prodotte in soia selvatica, Solanum americanum e zucca. Con il protocollo, i ricercatori possono eseguire senza problemi la trasformazione ARM in un solo passaggio.
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Protocol
1. Condizioni di crescita delle piante e coltura di A. rhizogenes
- Semina di semi
NOTA: I semi di soia selvatica sono stati raccolti nella contea di Yanggu, Liaocheng, Cina; semi di S. americanum e zucca varietà locale Yinsu sono stati acquistati da un mercato.- Raccogli semi di soia selvatica, S. americanum e la varietà locale di zucca, seminali in vermiculite ad una profondità di 1 cm e annaffiali accuratamente. Pianta 20 semi in scatole di plastica da 8 cm x 11 cm x 9 cm. Coltivare le piante in una camera di crescita a 24 ± 2 °C con un ciclo di 16 ore di luce/8 ore di buio a circa il 70% di umidità relativa.
NOTA: I manti di semi di soia selvatica devono essere rotti prima della semina. Se la domanda di ricerca si concentra sulle interazioni tra piante e microrganismi, semi, vermiculite, scatole di plastica e acqua devono essere sterilizzati prima dell'uso. - Attivazione e coltura di A. rhizogenes K599
NOTA: Il ceppo A. rhizogenes K599 aveva un vettore binario pRed13052 portatore di un gene reporter fluorescente rosso DsRed2.- Rimuovere il ceppo K599 di A. rhizogenes da un congelatore a -80 °C e attivare i batteri su un terreno solido LB (con 50 mg/L di kanamicina e 50 mg/L di streptomicina) a 28 °C per 48 ore.
- Prelevare un singolo clone del ceppo K599 e coltivarlo in 1 mL di terreno liquido contenente antibiotici LB per 12 ore.
- Distribuire uniformemente 500 μL della sospensione batterica su terreno solido contenente antibiotico, seguito da incubazione a 28 °C per 24 ore.
- Raccogli semi di soia selvatica, S. americanum e la varietà locale di zucca, seminali in vermiculite ad una profondità di 1 cm e annaffiali accuratamente. Pianta 20 semi in scatole di plastica da 8 cm x 11 cm x 9 cm. Coltivare le piante in una camera di crescita a 24 ± 2 °C con un ciclo di 16 ore di luce/8 ore di buio a circa il 70% di umidità relativa.
2. Metodo di trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes
- Incisione ipocotilicica
- Dopo 7 giorni (definire la semina dei semi come giorno 0), le cotiledoni della piantina si sono appena dispiegate (Figura 1A), utilizzare un bisturi sterilizzato e affilato per tagliare circa 0,5-1 cm dell'ipocotile (Figura 1B). Scartare la radice primaria e parte dell'ipocotile parziale.
NOTA: Utilizzare il bisturi con cura.
- Dopo 7 giorni (definire la semina dei semi come giorno 0), le cotiledoni della piantina si sono appena dispiegate (Figura 1A), utilizzare un bisturi sterilizzato e affilato per tagliare circa 0,5-1 cm dell'ipocotile (Figura 1B). Scartare la radice primaria e parte dell'ipocotile parziale.
- Inoculazione K599
- Rivestire l'incisione ipocotilicica con batteri K599 (Figura 1C).
- Piantare le piantine in vermiculite umida (Figura 1D).
- Infettare 30 piante di ogni specie attraverso la trasformazione delle radici pelose mediata da A. rhizogenes. Innaffia ogni pianta con 5 ml di sospensione batterica K599 risospesa (OD600 = 0,5-0,6) in un quarto di forza (0,25x) Gamborg B-5 terreno di base (Figura 1E).
- Coprire i vasi con un sacchetto di plastica altamente trasparente (Figura 1F) e metterli in una camera di crescita.
3. Produzione di radici pelose
- Coltiva le piante per ~ 12 giorni dopo l'inoculazione, nuove radici pelose saranno indotte e generate nel sito di incisione. Dopo 15 giorni, le lunghezze delle radici pelose raggiungono tipicamente i 2-5 cm (Figura 2).
- Per determinare se le radici pelose prodotte sono transgeniche, esaminare l'espressione dei geni reporter dipendenti dal vettore trasformato in K599.
- Rilevare l'espressione del gene reporter DsRed2 utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza con luce di eccitazione verde a 540 nm ed emissione a 600 nm (Figura 2B, Figura 2D e Figura 2F).
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Representative Results
Trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes altamente efficiente
Le radici pelose sono state prodotte nel sito di incisione ipocotilicica 12 giorni dopo l'inoculazione con K599 ingegnerizzato. Le radici pelose transgeniche sono state determinate in base all'espressione del gene reporter contenuto nel vettore binario. Le radici transgeniche trasformate con il gene reporter DsRed2 della soia selvatica composita, S. americanum e la zucca sono state osservate sotto luce di eccitazione naturale (Figura 2A, Figura 2C e Figura 2E) e verde (Figura 2B, Figura 2D e Figura 2F).
Quando una pianta composita conteneva almeno una radice transgenica, veniva designata come pianta composita transgenica. Tra le 30 piante inoculate di ciascuna delle tre specie, 28 piante di soia selvatica, 18 S. Americanum e 30 piante di zucca erano compositi transgenici. Pertanto, l'efficienza di trasformazione delle radici pelose era del 93,3% (soia), 60% (S. americanum) e 100% (zucca). Un confronto tra i tre tipi di piante ha indicato che le piante con ipocotili spessi producevano radici pelose più transgeniche di quelle con ipocotili sottili.
Figura 1: Trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes in un solo passaggio. (A) Piantine di zucca di sette giorni. (B) Porzione apicale dell'ipocotile tagliato in soluzione batterica K599. (C) K599 massa batterica che ricopre l'incisione ipocotile. (D) Espianto piantato in vermiculite umida e sterile. (E) Irrigazione con 5 ml di soluzione batterica K599 risospesa in quarto di forza (0,25x) Gamborg B-5 terreno basico. (F) Copertura di sacchetti di plastica altamente trasparente. Barre della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Piante composite ottenute dalla trasformazione delle radici pelose mediata da A. rhizogenes. Radici di piante composite di (A,B) soia selvatica, (C,D) Solanum americanum e (E,F) zucca sotto (A,C,E) naturale e (B,D,F) luce di eccitazione verde. Le frecce bianche indicano radici pelose transgeniche; Le frecce nere indicano radici pelose non transgeniche. Barre della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il metodo della radice pelosa mediata da A. rhizogenes è un metodo più semplice ed efficiente per la produzione di piante composite rispetto al metodo di iniezione ipocotile. Il metodo ARM in un'unica fase migliora significativamente l'efficienza della trasformazione delle radici pelose, riduce il tempo per produrre radici pelose, aumenta il numero di radici pelose e riduce la quantità di lavoro coinvolto. Il protocollo di trasformazione migliorato è ottimale per studi sulle simbiosi tra leguminose e rizobie e tra piante e funghi micorrizici arbuscolari. Ciò può essere attribuito al fatto che non è richiesto il trapianto di piante composite dopo la produzione di radici pelose, il che evita la contaminazione con ceppi non inoculati che si verifica durante il trapianto. Inoltre, l'efficienza di trasformazione era del 100% in una specie vegetale (zucca).
Le seguenti ragioni potrebbero spiegare perché il metodo ARM one-step era più efficiente del metodo di iniezione ipocotile nella trasformazione delle radici pelose. In primo luogo, sebbene la radice primaria sia stata rimossa, la traspirazione della piantina è stata mantenuta. Pertanto, l'attrazione della traspirazione ha facilitato l'invasione di A. rhizogenes delle cellule ipocotiliche nell'incisione. In secondo luogo, l'area della ferita causata dall'incisione ipocotilicica era più grande di quella causata dal metodo di iniezione di ipocotile e, pertanto, più cellule vegetali sono state infettate da A. rhizogenes. Infine, dopo aver rimosso la radice primaria, l'incisione ipocotilicica è stata sepolta in vermiculite scura e umida, che è un ambiente favorevole in cui produrre radici18.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo di ricerca dell'Università di Liaocheng (318012028) e dalla Fondazione di Scienze Naturali della Provincia di Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
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