Summary
Her gir vi den detaljerte protokollen for en ett-trinns transformasjonsmetode mediert av Agrobacterium tumefaciens for å produsere komposittplanter.
Abstract
Å produsere sammensatte planter med transgene røtter og ikke-transgene stammer og knopper ved hjelp av Agrobacterium rhizogenes-mediert hårete rottransformasjon er et kraftig verktøy for å studere rotrelatert biologi. Hårete rottransformasjon er etablert i et bredt spekter av dikotyledoner og i flere monokotyledonarter og er nesten uavhengig av genotypen. Den tradisjonelle metoden for hypokotylinjeksjon med A. rhizogenes for å oppnå sammensatte planter er ineffektiv, tidkrevende, arbeidskrevende og forårsaker ofte død av ømme og små hypokotylplanter. En svært effektiv, ett-trinns hårete rottransformasjon mediert av A. rhizogenes ble etablert tidligere, noe som eliminerer behovet for transplantasjon etter å ha produsert hårete røtter. I denne studien ble en delvis hypokotyl og primærrot fjernet, hypokotylsnittstedet ble belagt med A. rhizogenes, og deretter ble hypokotyler plantet i steril vermikulitt. Etter 12 dagers dyrkning utvidet hypokotylsnittet seg og nye hårete røtter ble indusert. Denne artikkelen gir den detaljerte protokollen for en ett-trinns transformasjonsmetode mediert av A. rhizogenes, med dens effektivitet demonstrert ved å produsere sammensatte planter av vill soyabønne, Solanum americanum og gresskar.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes er en gram-negativ jordbakterie fra familien Rhizobiaceae. A. rhizogenes kan infisere nesten alle dikotyledoner, noen monokotyledoner og individuelle gymnospermer gjennom sår, og produserer hårete røtter i smittede planter. Bakterien bærer Ri (rotinduserende) plasmid, og T-DNA av Ri-plasmidet bærer opinsyntesegenet og rol-gener (rotlokusgener). Etter at T-DNA fra Ri-plasmidet kommer inn i en plantecelle og er integrert i et vertskromosom, induserer uttrykket av rol-genene produksjon av hårete røtter1. En plantebinær uttrykksvektor som bærer et målgen blir transformert til A. rhizogenes, og de transformerte A. rhizogenes brukes til å infisere en plante. Transgene røtter kan induseres i infiserte planter, og produserer sammensatte planter som inneholder transgene røtter og ikke-transgene stammer og knopper. Vanligvis kan en komposittplante oppnås innen 14-20 dager. A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjon er generelt ikke begrenset av genotype i dikotyledonøse planter2. De hårete røttene produsert av A. rhizogenes-infiserte planter er preget av en rask vekst, stabil arv og enkel betjening. Hårete rottransformasjon mediert av A. rhizogenes er for tiden mye brukt til å studere rotrelatert biologi. Videre kan transformasjonen av hårete røtter også brukes til å validere og optimalisere målredigeringseffektiviteten til CRISPR / Cas9-systemet 3,4,5 og protein subcellulær lokalisering. Derfor er hårete rottransformasjon et viktig verktøy i forskning på plantegenfunksjon, metabolsk engineering og interaksjoner mellom røtter og rhizosfærens mikroorganismer 6,7,8.
Sammensatte planter som inneholder transgene røtter oppnådd gjennom hårete rottransformasjon har blitt mye produsert i dikotyledonøse planter, spesielt i belgfrukter. Den tradisjonelle metoden for å injisere hypocotyl med A. rhizogenes har blitt brukt til å produsere sammensatt Lotus corniculatus9, soyabønner 10, tomat11, søtpoteter12 og mange andre planter 5,8. Hypokotylinjeksjonsmetoden er ineffektiv og vil sannsynligvis føre til død av unge eller små hypokotylplanter. Derfor ble metoden forbedret ved å kutte av embryonale røtter, belegge frøplantesnittet med A. rhizogenes, og deretter plassere hypocotyl på sterilt kulturmedium for rooting dyrking13. Disse trinnene utføres imidlertid i et sterilt miljø, og operasjonstrinnene er relativt tungvinte. Spesielt må de resulterende komposittplantene transplanteres, noe som øker arbeidsmengden. I tidligere arbeid ble ett-trinns A. rhizogenes-mediert (ARM) hårete rottransformasjon etablert i agurk, soyabønne, Lotus japonicus, Medicago truncatula og tomat 2,14,15,16,17. Den primære roten og delvis hypokotyl ble fjernet, snittstedet for den gjenværende hypokotylen ble belagt med transformerte A. rhizogenes, og frøplanten ble deretter plantet i fuktig steril vermikulitt. Etter 12 dagers dyrking ble hårete røtter produsert på snittstedet. Ett-trinns ARM-metoden er svært effektiv og krever mindre tid å produsere hårete røtter. Transplantasjon etter å ha dannet hårete røtter er heller ikke nødvendig. Fordi mikrobiell forurensning kan unngås uten transplantasjon, kan en-trinns ARM-metoden være spesielt nyttig når man studerer interaksjoner mellom planter og mikroorganismer, for eksempel symbiotisk nitrogenfiksering mellom bælgplanter og Rhizobia, og symbioser mellom planter og arbuskulær mykorrhizal sopp. I dette papiret er en detaljert ett-trinns A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjonsprotokoll utstyrt med eksempler på sammensatte planter produsert i vill soyabønne, Solanum americanum og gresskar. Med protokollen kan forskere jevnt utføre ett-trinns ARM-transformasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantevekstforhold og A. rhizogenes kultur
- Frø såing
MERK: Wild soyabønnefrø ble samlet i Yanggu County, Liaocheng, Kina; frø av S. americanum og gresskar lokal variasjon Yinsu ble kjøpt fra et marked.- Samle frø av vill soyabønne, S. americanum og det lokale sortimentet av gresskar, så dem i vermikulitt på en dybde på 1 cm, og vann dem grundig. Plant 20 frø i 8 cm x 11 cm x 9 cm plastbokser. Dyrk plantene i et vekstkammer ved 24 ± 2 °C med en mørk syklus på 16 timer / 8 timer ved omtrent 70 % relativ fuktighet.
NOTAT: Strøk med ville soyabønnefrø må brytes før såing. Hvis forskningsspørsmålet fokuserer på interaksjoner mellom planter og mikroorganismer, må frø, vermikulitt, plastbokser og vann steriliseres før bruk. - Aktivering og kultur av A. rhizogenes K599
MERK: A. rhizogenes K599-stammen hadde en binær vektor pRed13052 som bærer et rødt fluorescerende reportergen DsRed2.- Fjern A. rhizogenes-stammen K599 fra en fryser på -80 °C, og aktiver bakteriene på fast LB-medium (med 50 mg/L kanamycin og 50 mg/L streptomycin) ved 28 °C i 48 timer.
- Plukk ut en enkelt klon av stamme K599 og dyrk den i 1 ml flytende antibiotikaholdig LB-medium i 12 timer.
- Jevnt fordelt 500 μL av bakteriell suspensjon på fast antibiotikaholdig LB-medium, etterfulgt av inkubering ved 28 °C i 24 timer.
- Samle frø av vill soyabønne, S. americanum og det lokale sortimentet av gresskar, så dem i vermikulitt på en dybde på 1 cm, og vann dem grundig. Plant 20 frø i 8 cm x 11 cm x 9 cm plastbokser. Dyrk plantene i et vekstkammer ved 24 ± 2 °C med en mørk syklus på 16 timer / 8 timer ved omtrent 70 % relativ fuktighet.
2. Ett-trinns A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjonsmetode
- Hypokotylsnitt
- Etter 7 dager (definer såing av frøene som dag 0), har frøplantekotyledoner nettopp utviklet seg (figur 1A), bruk en sterilisert, skarp skalpell for å kutte ca. 0,5-1 cm av hypokotylen (figur 1B). Kast den primære roten og noen av de delvise hypocotyl.
MERK: Bruk skalpellen med forsiktighet.
- Etter 7 dager (definer såing av frøene som dag 0), har frøplantekotyledoner nettopp utviklet seg (figur 1A), bruk en sterilisert, skarp skalpell for å kutte ca. 0,5-1 cm av hypokotylen (figur 1B). Kast den primære roten og noen av de delvise hypocotyl.
- K599 inokulering
- Belegg hypokotylsnittet med K599-bakterier (figur 1C).
- Plante plantene i fuktig vermikulitt (figur 1D).
- Infiser 30 planter av hver art via A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjon. Vann hver plante med 5 ml resuspendert K599 bakteriell suspensjon (OD600 = 0,5-0,6) i en kvart styrke (0,25x) Gamborg B-5 basisk medium (figur 1E).
- Dekk pottene med en svært gjennomsiktig plastpose (figur 1F) og plasser dem i et vekstkammer.
3. Hårete rotproduksjon
- Dyrk plantene i ~ 12 dager etter inokulering, nye hårete røtter vil bli indusert og generert på snittstedet. Etter 15 dager når de hårete rotlengdene typisk 2-5 cm (figur 2).
- For å avgjøre om de hårete røttene som produseres er transgene, undersøk uttrykket av reportergener avhengig av den transformerte vektoren i K599.
- Oppdag ekspresjonen av reportergenet DsRed2 ved hjelp av et kjemiluminescensavbildningssystem med grønt eksitasjonslys ved 540 nm og utslipp ved 600 nm (figur 2B, figur 2D og figur 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Svært effektiv ett-trinns A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjon
Hårete røtter ble produsert på hypokotylsnittstedet 12 dager etter inokulering med konstruert K599. Transgene hårete røtter ble bestemt basert på uttrykket av reportergenet inneholdt i den binære vektoren. Transgene røtter transformert med reportergenet DsRed2 av sammensatt villsoyabønne, S. americanum og gresskar ble observert under naturlig (figur 2A, figur 2C og figur 2E) og grønt eksitasjonslys (figur 2B, figur 2D og figur 2F).
Når en sammensatt plante inneholdt minst en transgen rot, ble den utpekt som en transgen komposittplante. Blant de 30 inokulerte plantene av hver av de tre artene var 28 ville soyabønner, 18 S. Americanum og 30 gresskarplanter transgene kompositter. Dermed var den hårete rottransformasjonseffektiviteten 93,3% (soyabønne), 60% (S. americanum) og 100% (gresskar). En sammenligning av de tre typer planter indikerte at planter med tykke hypokotyler produserte mer transgene hårete røtter enn de med tynne hypokotyler.
Figur 1: One-step A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjon. (A) Syv dager gamle gresskarplanter. (B) Apikal del av hypocotyl kuttet i K599 bakteriell løsning. (C) K599 bakteriemasse belegg hypocotyl snitt. (D) Eksplant plantet i våt, steril vermikulitt. (E) Vanning med 5 ml resuspendert K599 bakteriell oppløsning i kvart styrke (0,25x) Gamborg B-5 basisk medium. (F) Svært gjennomsiktig plastposetrekk. Skalastenger = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammensatte planter hentet fra ett-trinns A. rhizogenes-mediert hårete rottransformasjon. Røtter av sammensatte planter av (A,B) vill soyabønne, (C,D) Solanum americanum, og (E,F) gresskar under (A,C,E) naturlig og (B,D,F) grønt eksitasjonslys. Hvite piler indikerer transgene hårete røtter; Svarte piler indikerer ikke-transgene hårete røtter. Skalastenger = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den en-trinns A. rhizogenes-medierte hårete rotmetoden er en enklere og mer effektiv metode for å produsere komposittplanter enn hypokotylinjeksjonsmetoden. Ett-trinns ARM-metoden forbedrer effektiviteten av hårete rottransformasjon betydelig, forkorter tiden for å produsere hårete røtter, øker antall hårete røtter og reduserer mengden arbeid som er involvert. Den forbedrede transformasjonsprotokollen er optimal for studier på symbioser mellom bælgplanter og rhizobia og mellom planter og arbuskulære mykorrhizal sopp. Dette kan tilskrives det faktum at transplantasjon av sammensatte planter etter produksjon av hårete røtter ikke er nødvendig, noe som unngår forurensning med ikke-inokulerte stammer som oppstår under transplantasjon. Videre var transformasjonseffektiviteten 100% i en planteart (gresskar).
Følgende årsaker kan forklare hvorfor ett-trinns ARM-metoden var mer effektiv enn hypokotylinjeksjonsmetoden i hårrottransformasjon. For det første, selv om den primære roten ble fjernet, ble transpirasjon av frøplanter opprettholdt. Dermed lettet transpirasjonstrekk A. rhizogenes invasjon av hypokotylceller i snittet. For det andre var sårområdet forårsaket av hypokotylsnittet større enn det som var forårsaket av hypokotylinjeksjonsmetoden, og derfor ble flere planteceller infisert av A. rhizogenes. Sist, etter å ha fjernet den primære roten, ble hypokotylsnittet begravet i mørk og fuktig vermikulitt, som er et gunstig miljø for å produsere røtter18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av forskningsfondet ved Liaocheng University (318012028) og Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
