Summary
Burada, kompozit bitkiler üretmek için Agrobacterium tumefaciens'in aracılık ettiği tek adımlı bir dönüşüm yönteminin ayrıntılı protokolünü sunuyoruz.
Abstract
Agrobacterium rhizogenes aracılı tüylü kök dönüşümü kullanılarak transgenik kökleri ve transgenik olmayan gövdeleri ve tomurcukları olan kompozit bitkiler üretmek, kökle ilgili biyolojiyi incelemek için güçlü bir araçtır. Tüylü kök transformasyonu, çok çeşitli dikotiledonlarda ve birkaç monokotiledon türünde kurulur ve neredeyse genotipten bağımsızdır. Kompozit bitkiler elde etmek için A. rhizogenes ile geleneksel hipokotil enjeksiyonu yöntemi verimsiz, zaman alıcı, zahmetlidir ve sıklıkla hassas ve küçük hipokotil bitkilerin ölümüne neden olur. Daha önce A. rhizogenes'in aracılık ettiği yüksek verimli, tek aşamalı bir tüylü kök dönüşümü kurulmuştu, bu da tüylü kökler üretildikten sonra ekim ihtiyacını ortadan kaldırıyor. Bu çalışmada, kısmi bir hipokotil ve primer kök çıkarıldı, hipokotil insizyon bölgesi A. rhizogenes ile kaplandı ve daha sonra hipokotiller steril vermikülit içine ekildi. 12 günlük ekimden sonra hipokotil insizyonu genişledi ve yeni tüylü kökler indüklendi. Bu makale, A. rhizogenes'in aracılık ettiği tek aşamalı bir dönüşüm yönteminin ayrıntılı protokolünü ve etkinliği yabani soya fasulyesi, Solanum americanum ve balkabağının kompozit bitkilerinin üretilmesiyle gösterilmiştir.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes, Rhizobiaceae familyasından gram negatif bir toprak bakterisidir. A. rhizogenes, hemen hemen tüm dikotiledonları, birkaç monokotiledonu ve bireysel açık tohumluları yaralar yoluyla enfekte edebilir ve enfekte bitkilerde tüylü kökler üretebilir. Bakteri, Ri (kök indükleyici) plazmidini taşır ve Ri plazmidinin T-DNA'sı, opin sentez genini ve rol genlerini (kök lokus genleri) taşır. Ri plazmidinin T-DNA'sı bir bitki hücresine girdikten ve bir konakçı kromozomuna entegre edildikten sonra, rol genlerinin ekspresyonu tüylü köklerin üretimini indükler1. Bir hedef geni taşıyan bir bitki ikili ekspresyon vektörü, A. rhizogenes'e dönüştürülür ve dönüştürülmüş A. rhizogenes, bir bitkiyi enfekte etmek için kullanılır. Transgenik kökler, enfekte olmuş bitkilerde indüklenebilir, transgenik kökler ve transgenik olmayan gövdeler ve tomurcuklar içeren kompozit bitkiler üretilebilir. Genellikle 14-20 gün içinde kompozit bir bitki elde edilebilir. A. rhizogenes aracılı tüylü kök transformasyonu genellikle dikotiledon bitkilerde genotiple sınırlı değildir2. A. rhizogenes ile enfekte olmuş bitkiler tarafından üretilen tüylü kökler, hızlı büyüme hızı, istikrarlı kalıtım ve kolay kullanım ile karakterizedir. A. rhizogenes'in aracılık ettiği tüylü kök dönüşümü şu anda kökle ilgili biyolojiyi incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, tüylü köklerin dönüşümü, CRISPR/Cas9 sistemi 3,4,5'in hedef düzenleme verimliliğini ve protein hücre altı lokalizasyonunu doğrulamak ve optimize etmek için de kullanılabilir. Bu nedenle, tüylü kök transformasyonu, bitki gen fonksiyonu, metabolik mühendislik ve kökler ile rizosfer mikroorganizmaları arasındaki etkileşimler üzerine araştırmalarda önemli bir araçtır6,7,8.
Tüylü kök transformasyonu ile elde edilen transgenik kökleri içeren kompozit bitkiler, özellikle baklagillerde dikotiledon bitkilerde yaygın olarak üretilmektedir. Hipokotilin A. rhizogenes ile enjekte edilmesinin geleneksel yöntemi, kompozit Lotus corniculatus9, soya fasulyesi10, domates 11, tatlı patates12 ve diğer birçok bitki 5,8 üretmek için kullanılmıştır. Hipokotil enjeksiyon yöntemi verimsizdir ve genç veya küçük hipokotil bitkilerin ölümüne neden olması muhtemeldir. Bu nedenle, embriyonik köklerin kesilmesi, fide kesisinin A. rhizogenes ile kaplanması ve ardından hipokotilin köklendirme ekimi için steril kültür ortamına yerleştirilmesiyle yöntem geliştirildi13. Ancak bu adımlar steril bir ortamda gerçekleştirilir ve operasyon adımları nispeten zahmetlidir. Özellikle, ortaya çıkan kompozit bitkilerin nakledilmesi gerekir, bu da iş miktarını arttırır. Önceki çalışmalarda, salatalık, soya fasulyesi, Lotus japonicus, Medicago truncatula ve domates 2,14,15,16,17'de tek aşamalı A. rhizogenes aracılı (ARM) tüylü kök dönüşümü tespit edilmiştir. Birincil kök ve kısmi hipokotil çıkarıldı, kalan hipokotilin insizyon bölgesi dönüştürülmüş A. rhizogenes ile kaplandı ve fide daha sonra nemli steril vermikülite dikildi. 12 günlük ekimden sonra kesi yerinde saçlı kökler üretildi. Tek adımlı ARM yöntemi oldukça verimlidir ve tüylü kökler üretmek için daha az zaman gerektirir. Saçlı kökler oluşturulduktan sonra ekim yapılmasına da gerek yoktur. Mikrobiyal kontaminasyon transplantasyon olmadan önlenebildiğinden, tek adımlı ARM yöntemi, baklagil bitkileri ve Rhizobia arasındaki simbiyotik nitrojen fiksasyonu ve bitkiler ile arbusküler mikorizal mantarlar arasındaki simbiyozlar gibi bitkiler ve mikroorganizmalar arasındaki etkileşimleri incelerken özellikle yararlı olabilir. Bu yazıda, yabani soya, Solanum americanum ve balkabağında üretilen kompozit bitki örnekleri ile ayrıntılı bir tek aşamalı A. rhizogenes aracılı tüylü kök transformasyon protokolü verilmiştir. Protokol ile araştırmacılar tek adımlı ARM dönüşümünü sorunsuz bir şekilde gerçekleştirebilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitki büyüme koşulları ve A. rhizogenes kültürü
- Tohum ekimi
NOT: Yabani soya fasulyesi tohumları Yanggu İlçesi, Liaocheng, Çin'de toplandı; S. americanum tohumları ve yerel kabak çeşidi Yinsu bir pazardan satın alındı.- Yabani soya fasulyesi, S. americanum ve yerel balkabağı çeşidi tohumlarını toplayın, 1 cm derinlikte vermikülit içine ekin ve iyice sulayın. 8 cm x 11 cm x 9 cm plastik kutulara 20 tohum ekin. Bitkileri 24 ± 2 °C'de, yaklaşık% 70 bağıl nemde 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık döngüsü ile bir büyüme odasında yetiştirin.
NOT: Yabani soya fasulyesi tohumlarının katları ekimden önce kırılmalıdır. Araştırma sorusu bitkiler ve mikroorganizmalar arasındaki etkileşimlere odaklanıyorsa, tohumlar, vermikülit, plastik kutular ve su kullanılmadan önce sterilize edilmelidir. - A. rhizogenes K599'un aktivasyonu ve kültürü
NOT: A. rhizogenes K599 suşu, kırmızı floresan raportör geni DsRed2 taşıyan bir ikili vektör pRed1305 2'ye sahipti.- A. rhizogenes suşu K599'u -80 °C'lik bir dondurucudan çıkarın ve bakterileri katı LB ortamında (50 mg/L kanamisin ve 50 mg/L streptomisin ile) 28 °C'de 48 saat boyunca aktive edin.
- Tek bir K599 suşu klonu seçin ve 12 saat boyunca 1 mL sıvı antibiyotik içeren LB ortamında kültürleyin.
- 500 μL bakteri süspansiyonunu katı antibiyotik içeren LB ortamına eşit olarak yayın, ardından 24 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
- Yabani soya fasulyesi, S. americanum ve yerel balkabağı çeşidi tohumlarını toplayın, 1 cm derinlikte vermikülit içine ekin ve iyice sulayın. 8 cm x 11 cm x 9 cm plastik kutulara 20 tohum ekin. Bitkileri 24 ± 2 °C'de, yaklaşık% 70 bağıl nemde 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık döngüsü ile bir büyüme odasında yetiştirin.
2. Tek adımlı A. rhizogenes aracılı tüylü kök transformasyon yöntemi
- Hipokotil insizyonu
- 7 gün sonra (tohumların ekimini 0. gün olarak tanımlayın), fide kotiledonları yeni açılmıştır (Şekil 1A), hipokotilin yaklaşık 0,5-1 cm'sini kesmek için sterilize edilmiş, keskin bir neşter kullanın (Şekil 1B). Birincil kökü ve kısmi hipokotilin bir kısmını atın.
NOT: Neşteri dikkatli kullanın.
- 7 gün sonra (tohumların ekimini 0. gün olarak tanımlayın), fide kotiledonları yeni açılmıştır (Şekil 1A), hipokotilin yaklaşık 0,5-1 cm'sini kesmek için sterilize edilmiş, keskin bir neşter kullanın (Şekil 1B). Birincil kökü ve kısmi hipokotilin bir kısmını atın.
- K599 aşılama
- Hipokotil insizyonunu K599 bakterileri ile kaplayın (Şekil 1C).
- Fideleri nemli vermikülit içine dikin (Şekil 1D).
- Her türden 30 bitkiyi A. rhizogenes aracılı tüylü kök dönüşümü yoluyla enfekte edin. Her bitkiyi 5 mL yeniden süspansiyon K599 bakteri süspansiyonu (OD600 = 0.5-0.6) ile çeyrek kuvvette (0.25x) Gamborg B-5 bazik ortamında sulayın (Şekil 1E).
- Saksıları oldukça şeffaf bir plastik torba ile örtün (Şekil 1F) ve bir büyüme odasına yerleştirin.
3. Tüylü kök üretimi
- Bitkileri aşılamadan sonra ~ 12 gün boyunca büyütün, insizyon bölgesinde yeni tüylü kökler indüklenecek ve üretilecektir. 15 gün sonra tüylü kök uzunlukları tipik olarak 2-5 cm'ye ulaşır (Şekil 2).
- Üretilen tüylü köklerin transgenik olup olmadığını belirlemek için, K599'daki dönüştürülmüş vektöre bağlı raportör genlerin ekspresyonunu inceleyin.
- 540 nm'de yeşil uyarma ışığı ve 600 nm'de emisyon ile bir kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak raportör gen DsRed2'nin ekspresyonunu tespit edin (Şekil 2B, Şekil 2D ve Şekil 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüksek verimli tek adımlı A. rhizogenes aracılı tüylü kök dönüşümü
Tüylü kökler, tasarlanmış K599 ile aşılamadan 12 gün sonra hipokotil insizyon bölgesinde üretildi. Transgenik kıllı kökler, ikili vektörde bulunan raportör genin ekspresyonuna göre belirlendi. Kompozit yabani soya fasulyesi, S. americanum ve balkabağının raportör geni DsRed2 ile transforme edilen transgenik kökler, doğal (Şekil 2A, Şekil 2C ve Şekil 2E) ve yeşil uyarma ışığı (Şekil 2B, Şekil 2D ve Şekil 2F) altında gözlendi.
Bir kompozit bitki en az bir transgenik kök içerdiğinde, transgenik bir kompozit bitki olarak adlandırıldı. Üç türün her birinin 30 aşılanmış bitkisi arasında 28 yabani soya fasulyesi, 18 S. Americanum ve 30 kabak bitkisi transgenik kompozitlerdi. Böylece tüylü kök transformasyon etkinliği %93.3 (soya fasulyesi), %60 (S. americanum) ve %100 (kabak) olarak gerçekleşmiştir. Üç bitki türünün karşılaştırılması, kalın hipokotillere sahip bitkilerin, ince hipokotillere sahip olanlara göre daha fazla transgenik tüylü kökler ürettiğini gösterdi.
Şekil 1: Tek adımlı A. rhizogenes aracılı tüylü kök dönüşümü. (A) Yedi günlük kabak fidanları. (B) K599 bakteri çözeltisinde kesilen hipokotilin apikal kısmı. (C) Hipokotil insizyonunu kaplayan K599 bakteri kütlesi. (D) Islak, steril vermikülit içine ekilen eksplant. (E) Çeyrek kuvvette (0.25x) Gamborg B-5 bazik ortamında 5 mL yeniden süspanse edilmiş K599 bakteri çözeltisi ile sulama. (F) Son derece şeffaf plastik torba kaplaması. Ölçek çubukları = 1 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tek aşamalı A. rhizogenes aracılı tüylü kök dönüşümünden elde edilen kompozit bitkiler. (A,B) yabani soya fasulyesi, (C,D) Solanum americanum ve (E,F) balkabağı kompozit bitkilerinin kökleri (A,C,E) doğal ve (B,D,F) yeşil uyarma ışığı altındadır. Beyaz oklar transgenik tüylü kökleri gösterir; Siyah oklar, transgenik olmayan tüylü kökleri gösterir. Ölçek çubukları = 1 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek adımlı A. rhizogenes aracılı tüylü kök yöntemi, kompozit bitkiler üretmek için hipokotil enjeksiyon yönteminden daha basit ve daha verimli bir yöntemdir. Tek adımlı ARM yöntemi, tüylü kök dönüşümünün verimliliğini önemli ölçüde artırır, tüylü kök üretme süresini kısaltır, tüylü kök sayısını artırır ve ilgili iş miktarını azaltır. Geliştirilmiş transformasyon protokolü, baklagil bitkileri ile rizobi arasındaki ve bitkiler ile arbusküler mikorizal mantarlar arasındaki simbiyozlar üzerine yapılan çalışmalar için idealdir. Bu, tüylü köklerin üretiminden sonra kompozit bitkilerin transplantasyonunun gerekli olmamasına bağlanabilir, bu da nakil sırasında meydana gelen aşılanmamış suşlarla kontaminasyonu önler. Ayrıca, bir bitki türünde (balkabağı) dönüşüm verimliliği %100 olarak gerçekleşmiştir.
Aşağıdaki nedenler, tek adımlı ARM yönteminin saçlı kök dönüşümünde neden hipokotil enjeksiyon yönteminden daha verimli olduğunu açıklayabilir. İlk olarak, birincil kök çıkarılmış olmasına rağmen, fide terlemesi sağlandı. Böylece, terleme çekişi, A. rhizogenes'in insizyondaki hipokotil hücrelerin istilasını kolaylaştırdı. İkincisi, hipokotil insizyonunun neden olduğu yara alanı, hipokotil enjeksiyon yönteminin neden olduğu yara alanından daha büyüktü ve bu nedenle, daha fazla bitki hücresi A. rhizogenes tarafından enfekte edildi. Son olarak, birincil kök çıkarıldıktan sonra, hipokotil insizyonu, kök üretmek için uygun bir ortam olan koyu ve nemli vermikülite gömüldü18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Liaocheng Üniversitesi Araştırma Fonu (318012028) ve Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2020MC034) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
