Summary
단백질은 별개의 굴지 구속력이 모듈을 통해 filamentous 굴지 (F - 굴지)에 바인딩합니다. 이 비디오에서 우리는 굴지의 절차를 정기적으로 단백질이나 F - 굴지 바인딩 특정 도메인을 분석하는 데 사용되는 시험 관내 분석이다 공동 침전을 보여줍니다.
Abstract
세포 내에서 굴지의 cytoskeleton는 세포와 세포 프로세스의 움직임을 허용 굴지의 필라멘트의 네트워크이며, 그것은 긴장을 생성하고 세포 모양을 유지하는 데 도움이됩니다. 굴지의 cytoskeleton는 단단한 구조로되어 있지만, 지속적인 리모델링있는 역동적인 구조입니다. 단백질의 숫자는 굴지의 cytoskeleton에 바인딩할 수 있습니다. F - 굴지 특정 단백질의 바인딩은 종종 세포 생물 학적 관찰을 지원하거나 추가로 굴지의 cytoskeleton의 리모델링으로 인해 역동적인 프로세스를 이해하기 원하는 것입니다. 굴지 공동 침강 분석은 정기적으로 특정 단백질이나 F - 굴지와 단백질 도메인의 바인딩을 분석하는 데 사용되는 시험 관내 분석이다. 분석의 기본 원칙은 F - 굴지과 관심의 단백질의 부화 (의 전체 길이 또는 도메인), F - 굴지 공동 sedimenting 단백질의 펠렛 F - 굴지 및 분석 ultracentrifugation 단계를 포함하고 있습니다. 굴지 공동 침강 assays는 굴지 바인딩 동질성 및 경쟁 assays을 측정하기 위하여 적절하게 설계할 수 있습니다.
Protocol
1. 굴지의 준비
이 분석에 사용되는 굴지의 소스는 10 MG / ML은 -70 º C의 냉동고에 보관 Cytoskeleton 주식 회사 주식 aliquots에서 얻은 비 근육 인간의 혈소판 (β - 굴지)되었습니다. 분석은 굴지는 0.4 4 º C. 10 분 대한 20,000g에 centrifuged 5 MM 트리스 산도 8, 0.2 MM CaCl 2, 0.2 MM ATP와 0.5 MM의 DTT를 포함하는 버퍼에 MG / ML로 희석합니다 monomeric 굴지 있습니다 뜨는은 polymerized 될 준비가 된 것입니다. 굴지의 중합은 또한 50 MM KCl, 1 ㎜ ATP 2 MM MgCl 2 유도합니다. 중합은 1 시간 동안 실온에서 발생합니다.
2. 단백질의 준비
이 분석에서, 우리는 GST - 태그 단백질로 정화되어 talin의 C - 말단를 사용하고 있습니다. 분석에 사용되는 단백질은 F - 굴지와 사전 부화로 집계 사전을 취소 고속 원심 분리를 받게됩니다.
단백질 22 º C. 20 분 대한 베크맨 초원 심 분리기에 10만g에 늘인입니다
3. 굴지 - 단백질 인큐베이션
분석에 굴지 및 단백질의 양은 달라집니다. 이 예제에서 우리는 초과 굴지를 사용하고 있습니다. 일반적으로 어금니 비율은 예를 들어, 계산됩니다. 단백질에 굴지의 4시 1분 어금니 비율.
다음과 같은 분석에서 최종 반응 량은 150 μl입니다. 단백질과 F - 굴지이 incubated하는 버퍼 테스트하기 위해 단백질과 요구 조건에 따라 달라집니다. 이 예제에서, 우리는 10 MM 트리스 산도 7.0, 1 ㎜ ATP, 0.2 MM DTT, 1 MM EGTA, 0.1 MM CaCl 2, MgCl 2 MM 2 포함하는 버퍼를 사용합니다. 단백질과 F - 굴지는 실온에서 1 시간 동안 버퍼에 incubated 수 있습니다.
4. F - 굴지의 침강
부화 후, 샘플 22 º C.에 10만g에 늘인 아르 우리는 비디오 베크맨 초원 심 분리기를 사용합니다. 로터는 신중하게 알약을 방해하지 않는 정도로 제거됩니다.
5. F - 굴지와 단백질 공동 침강 분석
supernatants은 신중 eppendorf 튜브 5 X Laemmli SDS - PAGE 샘플 버퍼로 pipetting하여 제거하는 것은 추가됩니다. 1 X Laemmli SDS - PAGE 샘플 버퍼의 적절한 볼륨, 남은 알약에 추가 최대 pipetted 아래, 새로운 eppendorf 튜브로 전송됩니다. 알약과 supernatants에서 단백질의 상대적인 양의 SDS - PAGE와 젤 또는 모래 바닥 서양의 쿠매시 블루 얼룩하여 분리 따라 분석하고 있습니다.
, 굴지와 단백질 상호 작용의 특이성을 결정하기 위해 굴지 공동 sedimentations 농도 - 의존을 수행할 수 있습니다. 에 대한 실험, 단백질의 고정 금액과 굴지의 증가 금액 일련의 이런 종류는 incubated 있으며, 위에 설명된대로 분석 수행됩니다.
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Discussion
굴지 공동 침전은 F - 굴지에 바인딩 specfic 단백질을 분석하는 시험 관내 분석 간단합니다. 이 비디오에서 우리는 간단한 굴지이 공동 침전을 실시 할 수있는 방법 중 하나를 예를 보여줍니다. 우리는 F - 굴지를 준비하는 방법을 보여줍니다, 테스트하는 단백질과 굴지의 절차 공동 침전을 준비합니다. 굴지 공동 침강 assays을 수행하면 포인트의 수를 고려되어야합니다. 예를 들어, 부화에 대한 버퍼 구성 요소가 테스트하고 산도, 온도 및 소금 농도가 F - 굴지에 바인딩을 영향을 미칠 수있는 단백질에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 F - 굴지하는 간단한 바인딩, 분석의 그러나 이러한 유형에 따라 정교하고 F - 굴지에 단백질이나 단백질 도메인의 결합 특이성을 결정하는 데 사용할 수를 증명하고있다.
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Acknowledgments
HaCAT 세포에서 굴지의 영화 UCSF에서 위트먼 연구실에서 박사 Praveen 쿠마에 감사합니다.
References
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