ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
كما علم الأعصاب التحقيق يصبح أكثر تعقيدا ، والتحقيق في هياكل الدماغ والدوائر يتطلب تحسين مستويات الدقة ودقة أعلى. طورنا طريقة لإعداد وغرس نظام ضخ مزمنة في الدماغ وذلك باستخدام microcannula البورسليكات التي يبلغ قطرها 50 ميكرون طرف.
Abstract
البروتوكولات المستخدمة في ضخ تجريبي المزمنة من وكلاء neuroactive ضمن مناطق الدماغ غالبا ما تستخدم نظام مضخة صغيرة التناضحي. عادة يتم تسليمها عن طريق وكلاء قنية الفولاذ المقاوم للصدأ مع قطره 0.30 ملم أو أكثر. وقد نظم استخدام قنية من هذا العيار فرض صدمة إلى منطقة الفائدة مما أدى إلى أضرار المعمارية ، وبالتالي تعريض السلامة الهيكلية والأداء الطبيعي. كما علم الأعصاب التحقيق يصبح أكثر تعقيدا ، والتحقيق في هياكل الدماغ والدوائر يتطلب تحسين مستويات الدقة ودقة أعلى. طورنا طريقة لإعداد وغرس نظام ضخ مزمنة في الدماغ وذلك باستخدام microcannula البورسليكات التي يبلغ قطرها 50 ميكرون طرف. هذا الأسلوب يقلل من الأضرار التي لحقت بالبيئة المحلية ويقلل من رد الفعل دباق في موقع الحقن. تكوين نظام microinfusion هي أيضا قادرة على مطابقة لسطح الجمجمة والحيوان ، والحيلولة دون الحاجة إلى الركائز الجمجمة الكبيرة ، وبالتالي تسهيل إغلاق شق فروة الرأس والحد من مخاطر العدوى. نظهر التسليم مستدامة ويعول عليها صبغة وجود ممثل الوزن الجزيئي باستخدام نموذج في التجارب المختبرية والدراسات المجراة في الفئران.
Protocol
مقدمة
دعما مباشرا من وكلاء neuroactive يسمح بدراسة مناطق المخ محددة ، بينما تجاوز حاجز الدم في الدماغ. تطبيقات هذا النهج في علم الأعصاب ومتنوعة وتشمل تغيير مستوى نشاط الدماغ في مناطق فرعية منفصلة (Berretta وآخرون ، 2004 ؛. Gliddon وآخرون ، 2005 ؛. كيم وآخرون ، 2000) ، والتحقيق في تصرفات وكلاء العقلية ( كلينتون وآخرون ، 2006 ؛. دي بينيديتو وآخرون ، 2004) ، وتوفير نماذج للرقابة من التهاب الدماغ (Hauss - Wegrzyniak وآخرون ، 1998 ؛. Marchalant وآخرون ، 2007 ؛. روسي وآخرون ، 2004) ، ودراسة الآليات إدمان (كيم وآخرون ، 2005 ؛. Lockman وآخرون ، 2005 ؛. تشانغ وآخرون ، 2006) ، وتمكين الإدارة على المدى الطويل من العوامل الغذائية (Naert وآخرون ، 2006 ؛. Radecki وآخرون ، 2005 ؛ تاكاهاشي وآخرون ، 2006).
الأساليب القياسية للتسليم المزمنة من وكلاء غالبا ما تستخدم مضخة صغيرة التناضحي (على سبيل المثال ، مضخات ALZET تنافذي ، كوبرتينو ، كاليفورنيا) محملة عامل neuroactive التي يتم تسليمها في الدماغ من خلال قنية الفولاذ المقاوم للصدأ مع قطر التي قد تتراوح من 0.25 مم (وليامز وآخرون ، 1987). إلى 0.5 ملم ، ولكن الأكثر شيوعا هو ما يقرب من 0.3 ملم (بلاستيك واحد ، رونوك ، فرجينيا ، انظر الشكل رقم 6A). بينما cannulas التسليم بهذا الحجم قد تكون مناسبة للعديد من التطبيقات التي لا تتطلب مستويات عالية من الدقة والصدمة لالمكروية ليس مصدر قلق كبير ، وهذه cannulas غير كافية لتقديم وكلاء لمواقع صغيرة والدقيق الذي تمر به قنية يماثل ويجب في حجم (أو أكبر من) هيكل المستهدفة نفسها ، أو حيث لا وظيفة معرضة للخطر بسبب الاهانة المؤلمة.
قدم هنا هو وسيلة لإعداد وغرس نظام ضخ المزمنة لإيصال عوامل neuroactive داخل الدماغ وذلك باستخدام "microcannula" التي يبلغ قطرها أكثر غيض مخفضة. هذه التقنية تتيح لتكون مستهدفة الأساسات الصغيرة ويقلل من صدمة إلى منطقة المصالح. تدرس بذلك الإجراء الحالي كبديل للطرق التقليدية للباحثين الذين يرغبون في تقليل تعطل في المنطقة من المخ قيد التحقيق.
المواد والأساليب
الحيوانات والتصميم
واستخدمت ثمانية عشر الكبار (400-450 جم) من الذكور سبراغ داولي الفئران للتدليل على الإجراء واختبار وظيفة الأسلوب الحالي. زرعت اثنتي عشرة الحيوانات مع أنظمة microinfusion وساهم في تقييم الوقت طبعا وظيفة مستمرة على مدى 4 أيام. وقد استخدمت ستة حيوانات لمقارنة مستوى الصدمة والتفاعل دباق 5 أيام بعد غرس إما التسليم القياسية 28 قنية الجا (N = 3) أو microcannula (N = 3) يعلق على مضخة صغيرة مليئة التناضحي المالحة. وتم إيواء الحيوانات في أقفاص بلاستيكية واضحة ، وحافظت على ضوء لمدة 12 ساعة / جدول الظلام ، مع توفير الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. وقد وافق جميع الإجراءات المتبعة في مستشفى ماكلين رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم اللجنة ، وفقا لمبادئ توجيهية للتطبيق الفدرالية والمحلية للاستخدام التجريبي من الحيوانات.
Microinfusion نظام التجميع
الشكل 1 يوضح مكونات والتجمع من نظام microinfusion. نوصي بناء وزرع النظام باستخدام تقنية معقمة. بالإضافة إلى ذلك ، من أجل الحيلولة دون إدخال الهواء إلى داخل النظام ، فإنه يتم تجميعها في حين غمرت المياه المالحة داخل الحمام. للاختبارات الحاضر ، كانوا يعملون مصغرة التناضحي مضخات (اجتماعات الأطراف) (ALZET ، نموذج # 1002 ، كوبرتينو ، كاليفورنيا) مع مدة 14 يوما ، ومعدل تدفق 0.25 ميكرولتر / ساعة ، والقدرة على ملء ميكرولتر 98.6. ومع ذلك ، لأن معدلات تدفق طوفان المفرطة يمكن أن أصغر مجالات الاهتمام في الدماغ وتسبب الضرر الهيكلي ، وكان معدل التدفق للانخفضت هذه الدراسات إلى 0،125 ميكرولتر / ساعة قبل نصف طلاء للاجتماع مع البارافين وفقا للتعليمات من قبل الشركة المصنعة. لتقييم الصدمات المحلية ، وامتلأت اجتماعات الأطراف مع المالحة عقيمة. لتقييم وظيفة مستمرة نظم microinfusion ، سريعة الخضراء (1 ٪ في المالحة ، فيشر العلمية ، وبارك لين بيتسبرغ ، والسلطة الفلسطينية) واختير كحل اختبار بسبب سميتها المنخفضة ، وقدرتها على الانتشار داخل أنسجة الدماغ قابلة للحياة ، ولأنها له وزن جزيئي (808.84) في نهاية العلوي من نطاق "جزيئات صغيرة" (<1000) التي هي عادة من الفائدة للتسريب المزمنة (مثل muscimol ، بيكروتوكسين ، فلوكستين ، الخ).
الشكل 1 : عاصمبلاي نظام microinfusion. (أ) وضع عناصر النظام في مواضعها النسبية للتجميع. ملاحظة لقد تم كسر شفة من تدفق أنابيب modulater بعيدا. نوصي أن يكون المضمون السلك محاذاة قبل الزرع (انظر النص). (ب) نظام microinfusion تجميعها قبل مرفق من الأسلاك المواءمة والتوطين.
إعداد Microcannula
ويمكن أن الطراز microcannula باستخدام معيار مجتذب القطب أفقي أو عمودي (Stoelting شركة وود ديل ، IL) مع ضبط لإنتاج الزجاج الكهربائي مع ساق طويل مستدق بلطف (الشكل 2A). أنابيب البورسليكات هو مناسب لهذا الغرض (الجزء 1B100F - 6 ، 1.0 مم ، و 6 في ؛ الآلات الدقيقة العالمي ، وشركة ، ساراسوتا ، فلوريدا) ، كما أن لديها نقطة انصهار منخفضة نسبيا ، مما يسمح للثني مع الحرارة ركزت اللاحقة. يمكن قطع جزء من القاصي أقصى لmicrocannula التوالي مع مقص تشريح أو يمكن جعلها تسيطر فاصل مع microforceps (الآلات الدقيقة العالمي ، وشركة ، ساراسوتا ، فلوريدا) لإعطاء المطلوب القطر تلميح النهائي (50 ميكرون عن التظاهرات الحالية ) ، ومرحلة ميكرومتر المجهر مفيد لتوجيه وتأكيد القطر المطلوب. ويمكن خفض غيض ساخنة لفترة وجيزة ، أو "نار المصقول" ، لإزالة حواف خشنة أو حادة. ثم يتم استخدام ملف التسخين للمجتذب الكهربائي أو ناسخ بنسن لفرض زاوية اليمين باتجاه microcannula على مسافة محددة سلفا من طرف microcannula (الشكل 2B) عن طريق وضع أنابيب البورسليكات داخل ملف التسخين (أو لهب بنسن ) واستخدام القوة لطيف في الجزء القاصي مع ملقط كما يتم تسخين الأنابيب. وقرر سلفا من طول microcannula القاصي إلى زاوية الحق المفروضة استنادا إلى عمق المنطقة من المخ لتكون مستهدفة (على سبيل المثال ، 5 ملم) وأخذا في الاعتبار سمك الجمجمة (~ 1 ملم) والعمل عن بعد فوق الجمجمة ( على سبيل المثال ، 1-2 ملم). وهكذا فإن المسافة المحددة سلفا من طرف microcannula إلى زاوية الحق المفروضة على المظاهرات الحالية 7-8 ملم. ثم يتم استخدام قلم الماس لقطع الأنابيب البورسليكات حوالي 8 ملم الأقرب إلى الزاوية اليمنى.
الشكل 2 : إعداد microcannula. (أ) يتم استخدام مجتذب الكهربائي (Stoelting شركة وود ديل ، IL) لإنتاج microcannula مع ساق طويل مستدق. (ب) يمكن إعادة توجيه ملف التسخين لسهولة الاستخدام ، ويتم وضع microcannula داخل لفائف ، مما يسمح بتشكيل ثني الزاوية اليمنى باستخدام الملقط كما يتم تسخين أنابيب زجاجية.
بعد أن أحرز العدد المرغوب فيه من microcannulas ، نوصي التعقيم بأكسيد الإيثيلين أو باستخدام الأوتوكلاف. يمكن أن تكون ملونة مم القاصي أقصى 1-2 من microcannula مع علامة جراحية معقمة (أو الحبر دائمة قبل التعقيم) للسماح لطرف microcannula يمكن تصور بسهولة أثناء العملية الجراحية.
MOP إعداد
وأعدت اجتماعات الأطراف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، يتم إزالة أول شفة البلاستيك من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ MOP ("تدفق المغير") باستخدام مقص أو rongeurs. وترد إلى المنطقة من الفولاذ المقاوم للصدأ الأنابيب التي كانت تحتلها شفة (~ 4 ملم) وذلك بإضافة المقاوم للصدأ : أنابيب بطول البولي ايثيلين (0.72 ملم بلاستيك رقم واحد ، رونوك ، فرجينيا ، # C312 VT ؛ ؛ OD ، 1.22 ملم) أنابيب الصلب في تجويف الأنبوب البولي اثيلين وتأمين مناسبة مع مادة لاصقة حول محيط الخارجي للاتصال. LumaBond (myNeuroLab ، وشركة ، وسانت لويس ، MO) مفيد بشكل خاص لأنها تشفي في غضون ثوان عند التعرض للضوء مركزة (على سبيل المثال ، من مصباح الألياف البصرية). وينبغي أن طول الأنبوب التقريبية المسافة بين قاعدة جمجمة الحيوان والجانب منقاري ، أكثر من كتف (على سبيل المثال ، ما يقرب من 1،5-3،0 سم للفئران التجارب). يتم تعبئة المضخة كما أمرهم ، ويتم إدراج ALZET أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ ، مع طول أنابيب البولي ايثيلين تعلق حتى نهايتها ، في ضخ شغلها. وسيضطر وحدة تخزين صغيرة من محلول من ضخ نحو الخارج من المضخة واجهة أنابيب (وينبغي أن يكون بعيدا مست) وأيضا في المنطقة القريبة من أنابيب البولي ايثيلين. وحضنت ثم ضخ أنابيب مملوءة تعلق في المياه المالحة عقيمة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. إذا المضخة يعمل بشكل صحيح ، وبعد هذه الفترة الحضانة ، وسوف ينظر إلى السائل سافروا بضعة مليمترات داخل أنابيب البولي ايثيلين.
بناء ايون النظام microinfusion
هو مضخة مغمورة مع أنابيب الملحقة في طبق بتري 10 سم تحتوي على المياه المالحة عقيمة ، ويتم إزالة الهواء المتبقي داخل أنابيب البولي ايثيلين باستخدام حقنة مليئة نفس الحل الوارد في مضخة والتي تم تركيبها مع الأنابيب ذات القطر الصغير التي يمكن إدراجها داخل أنابيب البولي ايثيلين. وبالتالي يمكن أن يكون الحل حقنه في أنابيب البولي ايثيلين ليحل محل الهواء. وبالمثل ، منغمسين في microcannula في حمام المالحة ويتم إزالتها عن طريق ضخ الهواء مع الحل. ويتحقق هذا بسهولة مع حل حقنة مليئة second مزودة أنابيب (مثل سيليكون) الذي يناسب أكثر مرونة النهاية (القريبة) واسعة من microcannula.
ثم يتم إدراجها في نهاية القريبة من أنابيب البورسليكات في أنابيب البولي اثيلين. علما بأن هذا قد يتطلب اتساع أنابيب البولي ايثيلين بالضغط بقوة نصائح مغلقة microforceps في التجويف حرق وبالتالي فتح باب الإدراج سهل للأنابيب البورسليكات. ثم تتم إزالة نظام ضخ الهواء الخالية من حمام المالحة وضعت على سطح المعقمة والمجففة أو الشاش بلطف مع مسحة القطن. يتم تأمين الاتصال أنابيب البولي ايثيلين microcannula - بطبقة من مادة لاصقة كفافي (على سبيل المثال ، LumaBond).
إذا كان قد تم تجميعها في النظام بشكل صحيح ، وإذا كان مؤتمر الأطراف لا تزال تعمل كما ينبغي ، خلال المرحلة الأخيرة من هذا الإجراء قطرات من محلول سوف تظهر عادة في غيض من microcannula كآلية التناضحي داخل المضخة تستمر خلال التحضير. ويمكن انخفض معدل التدفق نسبيا MOP بواسطة طلاء مساحة مناسبة مع البارافين وفقا للتعليمات من قبل الشركة المصنعة. عن التظاهرات الحالية ، والمغلفة 50 ٪ من كل اجتماع من قبل فترة وجيزة في التغميس البرافين المنصهر ، والسماح لتبرد ، وبالتالي تقليل معدل تدفق بمقدار النصف الى 0.125 ميكرولتر / ساعة. هي مغمورة ثم استكمل في نظام microinfusion المالحة عقيمة وتخزينها على 37 درجة مئوية حتى الزرع.
غرس نظام microinfusion
هو مزروع نظام microinfusion باستخدام أساليب التجسيمي القياسية كما هو موضح سابقا (كولي ، 1990). بعد إعداد الجراحي الميداني ، يتم حفر حفرة للدغ دخول microcannula. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أيضا أن تكون موضع الجمجمة مسامير لتحقيق الاستقرار في مجمع الرابطة تستخدم لتأمين microcannula. مجمع المستخدمة في هذا المختبر (Geribond ، دن بساط شركة ، وسانتا ماريا ، كاليفورنيا) لا يتطلب ترسيخ إضافية ، ولكن يجب أن يكون مستعدا على سطح الجمجمة عن طريق تنظيف مع مسحة القطن acetonedampened. يتم إجراء مم 1-2 "هوك" في نهاية البعيدة للسلك المحاذاة (انظر الشكل رقم 1) ، والسماح لها لتطويق منعطف في أنابيب البورسليكات. هو المضمون ثم (باستخدام LumaBond) ، وذلك في اتجاه طول محور نفس الجزء الأعلى من microcannula (الذي هو أن تكون متقدمة في الدماغ ، انظر الشكل 3B). ثم يتم تركيب نظام ضخ على الناقل التجسيمي (الشكل 3) ، ولقط السلك المحاذاة على حاملها. يستخدم لخياطة العقيمة حبل مضخة التسريب الى أعلى تتلاعب التجسيمي ، وبالتالي وقف منع فقدان التوجه أثناء الإجراء نظرا لوزن (وعزم الدوران) للمضخة (الشكل 3B). ثم يمكن أن يكون وضع microcannula في الاتجاه المطلوب (مثل عمودي على وجه التحديد) باستخدام ملقط لثني السلك بلطف محاذاة القاصي إلى المشبك الناقل. تم وضع أكثر من طرف microcannula نقطة مرجعية (على سبيل المثال ، أو bregma امدا) وناور ثم إلى نقطة الدخول إلى الدماغ. وكانت إحداثيات المستخدمة للحيوانات في هذه التجارب : Bregma +0.2 مم ، 3.2 مم الوحشي ، وبطني 5.0 مم تحت الجافية مع رأس الحيوان في وضع الجمجمة المسطحة.
بعد microcannula متقدمة الى عمق المناسبة داخل الدماغ ، ويتم إصلاح النظام في موقف مع مجمع رمى (على سبيل المثال ، Geribond). يمكن أن تكون قاعدة التمثال المنحوت على مقربة من سطح الجمجمة لتسهيل إغلاق الجرح. بعد مجمع الشفاء وقد رمى (~ 2 دقيقة) ، وقطع الأسلاك محاذاة تدفق مع رمى به عجلة الحفر في عدة قطاعات. ويمكن استخدام كمية صغيرة من مركب لتغطية وسلاسة الشائكة المتبقية من الأسلاك مقطوعة. ثم يتم إدراج اجتماع تحت الجلد ، وضعه بين كتف الحيوان. وأخيرا ، lavaged الجرح بمحلول ملحي معقم ، وشق مغلقة باستخدام خياطة الجرح أو لقطات (الشكل رقم 3 ، لوحة D).
يتم وضع نظام لcroinfusion التنسيب والتثبيت داخل حيوان. (د) تصميم نظام يسمح microinfusion إغلاق سهل من خلال شق رمى الأضواء ، مما يقلل من خطر العدوى والحد من عدم الراحة للحيوان. "العرض =" 511 "ذروة =" 381 "/>
الشكل 3 : زرع نظام microinfusion. (أ) من نظام تحديد المواقع على صك microinfusion التجسيمي. (ب) هو مربوط به وزارة التخطيط خياطة معقمة لمنع وزنها من عرقلة توجه microcannula. يتم وضع microcannula للدخول العمودي دقيقة في الدماغ باستخدام السلك المحاذاة. (ج) يتم وضع نظام لmicroinfusion التنسيب والتثبيت داخل حيوان. (د) تصميم نظام يسمح microinfusion إغلاق سهل من خلال شق رمى الأضواء ، مما يقلل من خطر العدوى والحد من عدم الراحة للحيوان.
إعداد وغرس نظام ضخ القياسية
إجراءات لإعداد نظام التسريب هو معيار مماثل إلى أنه بالنسبة لنظام microinfusion إلا يتم استبدال microcannula من قبل "التناضحي مضخة قنية الموصل" التي يبلغ قطرها 300 ميكرون (28 GA ؛ بلاستيك واحد ، رونوك ، فرجينيا ، # 3300PM / المجلس الأعلى للبترول ، وانظر الشكل 5A). غرس النظام هو معيار أيضا مماثلة لنظام microinfusion ، بما في ذلك الحجز على سلك محاذاة رأسية للسماح لتحديد المواقع الدقيقة للقنية دخوله الى الدماغ.
وتحليل الأنسجة.
لفحص قدرة النظام على توفير microinfusion التسليم السريع المطرد الخضراء ، تمت التضحية مجموعات من ثلاثة حيوانات في 12 ساعة ، 1 يوم ، أيام 2 و 4 أيام بعد الجراحة. وكانت الموضوعات تخدير عميق مع بنتوباربيتال الصوديوم (120 ملغ / كلغ ، والملكية الفكرية) وperfused transcardially مع 200 مل من الفوسفات 0.1M مخزنة المالحة (PBS) ، يليه 400 مل من 4 ٪ في بارافورمالدهيد العازلة phospate 0.1M. بقيت الحلول نضح في 4 درجات مئوية ، ودرجة الحموضة من 7.4 و perfused بمعدل 50 مل في الدقيقة باستخدام مضخة تمعجية. وقد كان من أجل إزالة cannulas دون الإضرار الأنسجة بعد الوفاة ، ثابتة الحيوان perfused في إطار التجسيمي ، تأمين التمثال بمادة لاصقة للسلك الجامدة التي تعلق على تتلاعب المشبك الذراع ، وأزيل بعناية الجمجمة من جميع أنحاء رمى به a لدغ الأسنان. وبالتالي إزالة التمثال وقنية الكامنة على طول المسار نفسه الذي كان للقنية متقدمة التنسيب. ثم أزيلت من العقول وcalvaria مغمورة لمدة 12 ساعة في تثبيتي نفسه.
وقطعت لتقييم التسريب المستمر للأخضر سريع ، مع أقسام بسمك 200 ميكرومتر باستخدام Vibratome (myNeuroLab ، وسانت لويس ، MO) والتي شنت الرطب على الشرائح الزجاجية. وكانت المقاطع المصورة ممثل باستخدام الطراز CanoScan كانون الماسح 600F LIDE. لتقييم الصدمات المحلية ودباق رد الفعل ، وكانت المقاطع 70μm Vibratome first الرطب محمولة وتصويرها غير ملوثين لمنع تشويه الأنسجة التي قد تحدث مع العمليات النسيجية ، مثل التجفيف ، والتلوين ، والجفاف. ثم سمح لنفسه هذه المقاطع لتجف على الشرائح من الزجاج المطلي الجيلاتين ، وكانت ملطخة لهم الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) ، المجففة مع الكحول متدرج ، وتراجع الغطاء مع Permount.
وخضع 70 ميكرومتر المتاخمة المقاطع إجراء القياسية المناعي للكشف عن البروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP) ، والتي يعبر عنها النجمية خلال عملية التفاعل دباق ردا على الصدمة (أقرع وآخرون ، 2000 ؛. ما وآخرون ، 1991). باختصار ، كانت تشطف التعويم الحر مع المقاطع في برنامج تلفزيوني وسدت مع 10 ٪ المصل حمار عادي (NDS) و 3 ٪ مصل بقري الزلال في برنامج تلفزيوني مع 0.1 م 0.3 ٪ تريتون X - 100 (PBS / تريتون) لمدة ساعة وبعد ذلك في المحتضنة أرنب المضادة للGFAP الأضداد (1:500 ؛ سيغما كيميكال ، وسانت لويس ، MO) في برنامج تلفزيوني / تريتون مع NDS 1 ٪ لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية. ثم تشطف والمقاطع مع برنامج تلفزيوني وحضنت مع فلور اليكسا ® - 594 حمار antirabbit الضد الثانوية (1:500 ؛ المسابر الجزيئية ، وشركة ، يوجين ، OR) في برنامج تلفزيوني مع NDS 5 ٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. وتشطف جيدا المقاطع مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني وcounterstained مع NeuroTrace ® الخضراء نيسل الفلورسنت وصمة عار (1:500 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، والمسابر الجزيئية ، وشركة ، يوجين ، OR). بعد شطف النهائي مع برنامج تلفزيوني ، ووضعت على أبواب الجيلاتين الشرائح المغلفة وcoverslipped بطيئة مع تضاؤل (المسابر الجزيئية). تم الحصول على جميع photomicrographs باستخدام المجهر Axioskop زايس مع برنامج AxioVision (كارل زايس ، وشركة ، Thornwood ، NY).
النتائج
الاختبار في المختبر
وقبل التقييم في الحيوانات ، وأعدت نظم microinfusion الثلاثة على وضع السريع الخضراء المليئة اجتماعات الأطراف في حجرة واحدة (15 مل أنبوب مخروطي) ووضع microcannulas في المقصورة الثانية (1 مل شعبة التقييم والتخطيط endorf أنبوب) ، وكلاهما العقيمة المالحة التي تحتوي على 37 درجة مئوية. أظهر كل نظام التدفق المستمر للصبغة أكثر من 12 ساعة من المراقبة. الشكل 4 يوضح وظيفة من نظام نموذجي أكثر من 3 ساعات.
الرقم 4 : في مظاهرة المختبر من وظيفة نظام microinfusion. وينظر بسهولة (أ) تدفق الصبغة الخضراء السريع دون عوائق من microcannula في بداية لفترة اختبار في المختبر. (ب) كما لا تزال تتدفق ، فإن الحل يصبح الخزان المشبعة (B) ، ومبهمة في نهاية المطاف مع تلوين (C).
تقييم النظام في microinfusion فيفو
بعد نضح ، وجرى تفتيش دقيق للmicrocannulas إزالتها وصلاتهم ، ووجدت كل شيء أن تكون سليمة تماما. وهكذا ، لم تحدث هناك كسر الزجاج البورسليكات داخل الأنسجة ، ولا توجد أية عيوب في الاتصالات من مكونات النظام. تم استخدام 10. L حقنة مليئة المالحة هاميلتون الذي يبلغ طوله قصيرة أنابيب السيليكون المرفقة إبرة ليطبق تدفق لطيف حتى نهاية قطع من أنابيب البولي ايثيلين تعلق على microcannula. يسمح لجميع اثني عشر من استمرار تدفق microcannulas ولا يبدو أن هناك عرقلة. وعلاوة على ذلك ، بعد إزالة كل اجتماع من هذه الحيوانات ، وقد تم قياس حجم الحل المتبقية وجدت لتكون مناسبة لمعدل التدفق في اجتماع (0،125 ميكرولتر / ساعة) وكمية من الوقت سمح لها وظيفة.
في التسليم فيفو
أظهر تقييم المقاطع الاكليلية من الأنسجة التي غرست مع الأخضر السريع تقلب قليلا في التوزيع بين الحيوانات ضمن مجموعات في أي نقطة زمنية معينة (12 ساعة ، 1 يوم ، أيام 2 و 4 أيام). الشكل 5 يوضح المناطق الخضراء ممثل نشر سريع في هذه النقاط مرة تظهر زيادة مطردة في صبغ تسلل على مدى أربعة أيام. علما ان التجارب السابقة باستخدام تركيزات أعلى من الأخضر السريع (على سبيل المثال ، 5 -- 15 ٪) عن عتامة السريع لحمة ، متجاهلا بذلك تقييم دقيق للنظام microinfusion الدالة على مر الزمن. في حين أن المدى الكامل لنشر صبغة 1 ٪ يمكن أن يكون من الصعب تحديد بدقة على التفتيش الإجمالي ، وكانت مناطق التسلل بسهولة ملحوظ في 2.5X التكبير ، وأشار مع الخطوط المتقطعة في الشكل 5.
الشكل 5 : في demonstation المجراة من microinfusion مستمرة من الأخضر السريع. (أ) اثنا عشر ساعة بعد التنسيب intrastriatal نظام سريع microinfusion الخضراء محملة ، وينظر الى نزع فتيل صبغة لحمة المحيطة بموقع microcannula. ملاحظات في 1 اليوم (B) ، و 2 يوما (C) ، و 4 أيام (D) تشير إلى استمرار تقديم حل سريع مع المناطق الخضراء تزايد تسلل صباغة. ولوحظ الحد الخارجي للنشر تحت المجهر المنخفض للطاقة ، ويشار هنا مع الخطوط المتقطعة. مقياس شريط ، 2 ملم.
تقييم الصدمات والتفاعل دباق
وأظهرت المراقبة الجسيمة لقطع طازجة ، وأقسام الأنسجة غير ملوثين أن النظام microinfusion أدى إلى انخفاض في مجال الصدمات النفسية المترجمة في موقع التسليم. كان ينظر دائما إلى قنية القياسية لعرقلة وتهجير أكبر مساحة من الأنسجة (الشكل 6B & C) ، والتي هي محل تقدير أفضل في أعلى السلطة مع H & E (الشكل 6D & E). علاوة على ذلك ، كثيرا ما كان ينظر إلى الدم المتراكم في موقع الحقن القياسية (الشكل 6D) ، مما يشير إلى درجة أكبر من التوافق على الأوعية الدموية وسلامتها مما يعني انخفاض حاجز الدم في الدماغ.
نظام microinfusion أسفرت أيضا عن رد الفعل دباق تقلص إلى حد كبير كما يتضح من انخفاض تفاعلية مناعية لGFAP على مقربة من طريق التسريب microcannula (الشكل 6G) عند مقارنة مستوى قنية (الشكل 6F). بينما كانت مرتفعة بفعل microcannula GFAP تلوين فوق المستويات العادية (الشكل 6H) ، لم يكن ينظر إلى التصعيد في ضرب دباق التفاعل مع التنسيب القياسية وقنية تسريب (6F) عندما كان يعمل النظام microinfusion.
ivery قنية بعد 5 أيام من ضخ المياه المالحة. (A) وانسحب من microcannula البورسليكات أنابيب بقطر غيض من 50. متر حرة يسمح ، والتدفق غير المقيد للعملاء معظم neuroactive ، إلا أنها أصغر من 6X قنية التسليم القياسية (28 GA ، 0.30 ملم). (B ، C) غير ملوثين ، يتصاعد الرطب من المقاطع الاكليلية (سمك ، 70. م) التي توضح زيادة تلف الأنسجة المحلية (الأسهم) التي تسببها معيار قنية (B) عند مقارنة microcannula (C). (D ، E) photomicrographs العالي السلطة من الأبواب H & E الملون هو موضح في وباء وجيم ، على التوالي. تسببت في إصابة قنية معيار الصدمة أكثر شمولا كما هو موضح في D ، بعد أن المشردين مساحة أكبر من الأنسجة وتسبب أكبر إهانة للالأوعية الدموية كما يدل على ذلك جمع الدم داخل تجويف آفة (السهم). الآفة التي سببتها microcannula ، ومع ذلك ، هو أصغر بكثير وأقل اضطراب في الأنسجة في موقع الحقن. يوضح زيادة كبيرة (F ، G ، H) المناعي ضد GFAP أعداد الخلايا النجمية + GFAP حول آفة من قنية القياسية (F) عند مقارنة ذلك من microcannula (G) والعادي ، المخطط unlesioned (H). أشرطة النطاق : A & B ، 1 مم ؛ د -- ه ، 250 م "/>.
الشكل 6 : الصدمة المترجمة يسببه microcannula مقارنة قنية التسليم القياسية بعد 5 أيام من ضخ المياه المالحة. (أ) microcannula سحبها من البورسليكات أنابيب بقطر 50 ميكرون غيض من يسمح الحر ، والتدفق غير المقيد للعملاء معظم neuroactive ، إلا أنها أصغر من 6X قنية التسليم القياسية (28 GA ، 0.30 ملم). (B ، C) غير ملوثين ، يتصاعد الرطب من المقاطع الاكليلية (سمك ، 70 ميكرومتر) التي توضح زيادة تلف الأنسجة المحلية (الأسهم) التي تسببها قنية القياسية (B) عند مقارنة microcannula (C). (D ، E) photomicrographs العالي السلطة من الأبواب H & E الملون هو موضح في وباء وجيم ، على التوالي. تسببت في إصابة قنية معيار الصدمة أكثر شمولا كما هو موضح في D ، بعد أن المشردين مساحة أكبر من الأنسجة وتسبب أكبر إهانة للالأوعية الدموية كما يدل على ذلك جمع الدم داخل تجويف آفة (السهم). الآفة التي سببتها microcannula ، ومع ذلك ، هو أصغر بكثير وأقل اضطراب في الأنسجة في موقع الحقن. يوضح زيادة كبيرة (F ، G ، H) المناعي ضد GFAP أعداد الخلايا النجمية + GFAP حول آفة من قنية القياسية (F) عند مقارنة ذلك من microcannula (G) والعادي ، المخطط unlesioned (H). أشرطة النطاق : A & B ، 1 مم ؛ D -- H ، 250 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مختلف الدراسات التي أثبتت أن تقليل حجم قنية تسليم دفعات داخل المخ ، والصدمات النفسية الأنسجة والاهانة على حاجز الدم في الدماغ وخفض (بيري وآخرون ، 1993) ، وانخفض الالتهاب والمخففة للمناعة الاستجابة (فنسن وآخرون تتقلص ، 1991) ، وعلى رد الفعل دباق (Nikkhah وآخرون ، 1994). نقدم هنا طريقة لإيصال المزمنة من وكلاء neuroactive داخل الدماغ عن طريق microcannula بقطر أن يتم تخفيض 6 أضعاف مقارنة بما كان عليه من cannulas التسليم التقليدية المستخدمة. لقد أثبتنا أن هذا النظام يوفر حلا موثوق به ممثل على مر الزمن ، وانخفاض كبير في مستوى الصدمة والمترجمة دباق رد الفعل. استخدمت هذه الدراسات قنية التسليم مع قطر الحافة النهائية من 50 مترا ، ومع ذلك ، يمكن استخدام غيض أقطار أصغر. الفضيلة الأساسية للنظم microinfusion هذه قدرتها على تحقيق الأهداف وكلاء ل، صغيرة جدا منفصلة ، في حين تكبد الحد الأدنى من الصدمة في المنطقة المجاورة للالتسريب.
يمكن للmicrocannulas المستخدمة في بناء نظام ضخ وصفنا يمكن بسهولة مبنية خصيصا مع أطوال محددة سلفا وبأقطار الحافة. تم تصميم نظام microinfusion ليتطابق مع سطح جمجمة الحيوان السماح آمن ، وانخفاض المستوى التثبيت واستبعاد الحاجة الى رمى a الجمجمة الكبيرة. ويمكن بالتالي أن تكون خياطة الجروح بسهولة على قاعدة التمثال microinfusion مبسطة ، وبالتالي تقليل كلا من الانزعاج للحيوانات وخطر للعدوى. بالإضافة إلى ذلك ، تأمين النظام إلى الجمجمة يتطلب أقل مساحة سطح الجمجمة ، وبالتالي ، قد يتم تنفيذ إجراءات إضافية أو لاحقة دون تدخل من أوسع قاعدة.
ينبغي لأحد ، ومع ذلك ، تأخذ في الحسبان اعتبارات فنية معينة عند استخدام المنهجية الموصوفة هنا. مطلوب مستوى أعلى من المهارة ، وإجراءات الإنتاج وغرس وقتا أقل كفاءة من أنها قد تكون للأنظمة ضخ القياسية. من ناحية أخرى ، قد يكون هذا تفوق ، أو على الأقل موازنته ، وبحلول الوقت (والحيوان) التي نجت من ممارسة درجة عالية من الدقة التقنية. صعوبة أخرى هي أنه في حين يمكن تخصيص microcannula بقطر أي تقريبا ، microcannula مع تجويف صغير جدا يمكن أن تصبح إعاقة ، سواء من جانب عناصر infusate أو عن طريق زرع نسيج واجهتها خلال (على سبيل المثال ، وأنسجة الدماغ بالدم ،). يتم تقليل هذه المخاطر عن طريق الحفاظ على الحافة microcannula مبلل (على سبيل المثال ، وذلك باستخدام المياه المالحة أو مشبعة مسحة القطن لمنع تجفيف المواد المذابة infusate) أثناء إجراء الزرع وقبل تنفيذ نظيفة "خالية من الدم" لعملية جراحية.
نوصي بأن الباحث إنشاء القطر تلميح microcannula غير مناسبة لتكوين خاص و / أو اللزوجة من الحل الذي سيتم تحميلها في اجتماع الأطراف. ويتحقق هذا بسهولة باستخدام نظام اختبار في المختبر مشابهة لتلك الموصوفة في هذا البروتوكول (الشكل 4) ، أو ببساطة عن طريق غمر النظام تجميعها في الحمام 37 درجة مئوية المالحة ورصد تكوين الحمام و / أو قياس حجم محتويات اجتماع مع مرور الوقت. والعيب هو أن microcannula هش نسبيا ، لا سيما إذا غيض قطرها صغير جدا (على سبيل المثال ، ~ 10-50 ميكرون). كسر microcannula بطريق الخطأ خلال عملية جراحية وعادة ما يتطلب أن يتم استبدال النظام بأكمله ، وترميم أو إعادة بناء تلك الوحدة وتمديد الوقت لعملية جراحية كبيرة. المهرة في مثل هذه التقنيات والعلماء الذين أسلوب الممارسة الصارمة نادرا الكسر الخبرة ، ولكن.
في ختام التجربة ، يمكن فحص النظام للتأكد من أن microinfusion لم microcannula التالفة ، وأنه ظل البراءة. ويمكن أيضا حجم مضخة صغيرة يمكن قياسها التناضحي لضمان انه تم تسليم كمية مناسبة من وكيل neuroactive ، ونحن لا نوصي إعادة تدوير أو إعادة استخدام المضخات ، ولكن. بينما أظهرت الأساليب الحالية في الفئران الكبار ، واستخدام نظام الذي يقلل من الصدمات ويمكن اعتبار يتطلب أقل مساحة سطح الجمجمة لتثبيت الأفضل على الأساليب التقليدية للتجارب مع الحيوانات الصغيرة مثل الفئران أو الجرذان الشباب.
على الرغم من أن الأسلوب الحالي يتطلب مستوى أكثر تقدما إلى حد ما من الكفاءة والمهارة من قبل المجرب ، فهو يقدم لزيادة الدقة وربما بأمر من حجمها ، والتقليل من يفند التجريبية المرتبطة صدمة إلى منطقة الفائدة. في المختبر لدينا ، وجدنا أن هذا يترجم إلى مزيد من الآثار متينة وموثوق بها للتدخل التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
Tags
علم الأعصاب ، المسألة 13 ، ومضخة صغيرة التناضحي ، التسريب المزمنة ، microcannula ، سريع الخضراءErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
