ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
כפי חקירה המוח הופך מתוחכם יותר, חקירה של מבנים מוחיים המעגלים דורש שיפור רמות של דיוק רזולוציה גבוהה יותר. פיתחנו שיטה להכנת ואת ההשתלה של מערכת עירוי כרונית בתוך המוח ניצול microcannula בורוסיליקט בקוטר טיפ של 50 מיקרון.
Abstract
פרוטוקולים ניסיוני המשמש עירוי כרונית של סוכני neuroactive בתוך אזורים במוח לעיתים קרובות לנצל מערכת מיני האוסמוטי המשאבה. סוכני מועברות בדרך כלל באמצעות צינורית נירוסטה בקוטר של 0.30 מ"מ או יותר. מערכות ניצול צינורית בקוטר זה עלול להטיל טראומה לאזור הריבית וכתוצאה מכך לנזק ארכיטקטוני, ובכך לסכן את השלמות המבנית ואת לתפקוד תקין. כפי חקירה המוח הופך מתוחכם יותר, חקירה של מבנים מוחיים המעגלים דורש שיפור רמות של דיוק רזולוציה גבוהה יותר. פיתחנו שיטה להכנת ואת ההשתלה של מערכת עירוי כרונית בתוך המוח ניצול microcannula בורוסיליקט בקוטר טיפ של 50 מיקרון. טכניקה זו מפחיתה את הנזק לסביבה המקומית פוחתת דבקת תגובתי באתר של אינפוזיה. התצורה של מערכת microinfusion הוא גם מסוגל להתאים את פני השטח של הגולגולת של בעל החיים, מניעת הצורך כנים גולגולתי גדול, ובכך להקל על סגירת החתך הקרקפת וצמצום הסיכון לזיהום. אנו מדגימים משלוח מתמשכת אמין של צבע בעל משקל מולקולרי נציג שימוש במודל במבחנה במחקרים vivo בעכברים.
Protocol
הקדמה
עירוי ישיר של neuroactive סוכני מאפשר אזורי מוח ספציפיים כדי להיחקר תוך עקיפת מחסום דם מוח. היישומים של גישה זו במדעי המוח מגוונת הכוללת שינוי ברמה של פעילות המוח אזורי המשנה בדידים (Berretta et al, 2004;. Gliddon et al, 2005;.. קים et al, 2000), חוקרת את מעשיהם של סוכני פסיכוטרופיות ( קלינטון et al, 2006;.. די בנדטו et al, 2004), מתן מודלים מבוקרת של דלקת מוח (Hauss-Wegrzyniak et al, 1998;. Marchalant et al, 2007;.. רוזי et al, 2004), ללמוד את המנגנונים ההתמכרות (Kim et al, 2005;. לוקמן et al, 2005;. Zhang et al, 2006.), ומאפשרת לטווח ארוך של גורמי ממשל trophic (Naert et al, 2006;.. Radecki et al, 2005; טקהאשי et al. 2006).
שיטות תקן למסירה כרונית של סוכני לעתים קרובות לנצל משאבה מיני אוסמוטי (למשל, משאבות ALZET אוסמוטי, בקופרטינו, קליפורניה) טעון עם סוכן neuroactive, אשר מועבר במוח באמצעות צינורית נירוסטה בקוטר שעשוי לנוע בין 0.25 מ"מ (Williams et al, 1987.) ל 0.5 מ"מ, אך לרוב הוא כ 0.3 מ"מ (פלסטיק אחת, Roanoke, VA, ראה איור 6 א). בעוד cannulas המסירה של גודל זה עשוי להיות מתאים ליישומים רבים בהם רמות גבוהות של דיוק לא נדרשים טראומה microenvironment אינו החשש העיקרי, cannulas אלה הם לא טובים עבור אספקת סוכנים, אתרים קטנים עדין שבו קנית הוא דומה בגודלו (או גדול יותר) מבנה היעד עצמו, או כאשר הפונקציה לא חייבת להיות בסכנה על ידי פגיעה טראומטית.
מוגש כאן היא שיטה להכנת ואת ההשתלה של מערכת עירוי כרונית למסירה של סוכני neuroactive בתוך המוח ניצול "microcannula" בקוטר טיפ הרבה מופחת. טכניקה זו מאפשרת substructures קטן להיות ממוקד ומצמצם טראומה של אזור עניין. ההליך הנוכחי הוא לימד ובכך כחלופה בשיטות המקובלות עבור חוקרים המבקשים לצמצם את שיבוש לאזור במוח תחת חקירה.
חומרים ושיטות
בעלי חיים ועיצוב
שמונה עשרה מבוגרים (400-450 גרם) זכר Sprague-Dawley חולדות שימשו כדי להדגים את התהליך ולבחון את הפונקציה של השיטה הנוכחית. שתים עשרה החיות היו מושתלים עם מערכות microinfusion ותרמו הערכת זמן בקורס של תפקוד מתמשך על פני 4 ימים. ששת החיות שימשו להשוות ברמה של טראומה דבקת תגובתי 5 ימים לאחר ההשתלה של תקן 28 או ga משלוח צינורית (N = 3) או microcannula (N = 3) מחוברת משאבה מיני האוסמוטי מלוחים מלאים. בעלי חיים שוכנו בכלובים פלסטיק שקוף, ומתוחזק על אור של 12 שעות / זמנים כהה, עם מזון ומים סיפקה כרצונך המודעה. כל ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים החולים מקלין מוסדיים ועדת שימוש, בהתאם להנחיות הפדרלי המקומיים החלים לשימוש ניסיוני של בעלי חיים.
Microinfusion הרכבה מערכת
איור 1 מדגים את הרכיבים ואת הרכבה של מערכת microinfusion. אנו ממליצים בנייה להשתיל את המערכת באמצעות טכניקה סטרילית. בנוסף, כדי למנוע כניסת אוויר לתוך המערכת, זה מורכב תוך שקוע בתוך אמבטיה מלוחים. עבור הבדיקות הנוכחי, מיני האוסמוטי משאבות (מגבים) היו מועסקים (ALZET, מודל # 1002, בקופרטינו, קליפורניה) עם משך 14 יום, קצב הזרימה של μL 0.25 / hr, ויכולת למלא μL של 98.6. עם זאת, מאז ספיקות מופרז יכול מבול אזורים קטנים של עניין במוח ולגרום נזק מבני, את קצב הזרימה של המחקרים הללו היה ירד ל 0.125 μL / hr בחצי ציפוי של MOP עם פרפין כפי שהורה על ידי היצרן. להערכת טראומה מקומית, מגבים היו מלאים מלוחים סטרילית. להערכת תפקוד מתמשך של מערכות microinfusion, מהיר גרין (1% ב מלוחים, פישר סיינטיפיק, פארק ליין פיטסבורג, פנסילבניה) נבחרה כפתרון מבחן בגלל רעילות נמוכה שלה, היכולת שלה מפוזר בתוך רקמת המוח קיימא, ובגלל זה יש משקל מולקולרי (808.84) בקצה העליון של טווח עבור "מולקולות קטנות" (<1000), כי הם בדרך כלל עניין של עירוי כרונית (למשל muscimol, picrotoxin, פלואוקסטין, וכו ').
איור 1: עאסםבליי של מערכת microinfusion. (א) מרכיבי המערכת להציב עמדות היחסי להרכבה. שים לב מקורבות מתוך צינורות modulater תזרים נשבר משם. אנו ממליצים על חוט יישור להיות מאובטח לפני ההשתלה (ראה טקסט). (ב) Assembled מערכת microinfusion לפני התקשרות של תיל יישור ההשתלה.
Microcannula הכנה
Microcannula יכול להיות מעוצב באמצעות חולץ סטנדרטי אלקטרודה אופקי או אנכי (Stoelting ושות' ווד דייל, אילינוי) עם הגדרות לייצור אלקטרודות זכוכית עם שוק ארוכה, בעדינות מתחדדת (איור 2 א). צינורות בורוסיליקט מתאים למטרה זו (חלק 1B100F-6, 1.0 מ"מ, 6 ב; Precision Instruments העולם, Inc, סרסוטה, פלורידה), שכן יש נקודת התכה נמוכה יחסית, המאפשר כיפוף עם חום ממוקד הבאים. החלק הדיסטלי ביותר של microcannula ישר ניתן לגזור במספריים לנתיחה או הפסקה מבוקרת יכולה להתבצע באמצעות microforceps (מכשירים העולם Precision, Inc, סרסוטה, פלורידה) לתת בקוטר הרצוי קצה הסופי (50 מיקרומטר עבור ההפגנות הנוכחי ), וכן לשלב מיקרומטר מיקרוסקופ שימושי להדריך לאשר את בקוטר הרצוי. טיפ חתך יכול להיות מחומם בקצרה, או "אש מלוטש", כדי להסיר את הקצוות הגסים או חדים. סליל החימום של חולץ את האלקטרודה או מבער בונזן לאחר מכן נעשה שימוש כדי לכפות זווית ישרה על microcannula במרחק קבוע מראש מהקצה של microcannula (איור 2B) על ידי הנחת צינורות בורוסיליקט בתוך סליל החימום (או להבה בונזן ) לבין הפעלת כוח עדין על החלק הדיסטלי עם מלקחיים כמו בצינור מחומם. אורך מראש של microcannula הדיסטלית לזווית הנכונה שהוטל הוא החליט מבוסס על עומק של האזור במוח להיות ממוקד (למשל, 5 מ"מ) תוך לקיחה בחשבון את עובי הגולגולת (~ 1 מ"מ) ועבודה מרחוק מעל הגולגולת ( למשל, 1-2 מ"מ). לכן המרחק מראש מקצה microcannula לזווית הנכונה שהוטל בשל ההפגנות הנוכחי היה 7-8 מ"מ. עיפרון יהלום לאחר מכן נעשה שימוש כדי לחתוך את צינורות בורוסיליקט כ 8 מ"מ הפרוקסימלי לזווית הנכונה.
איור 2: הכנת microcannula. (א) חולץ אלקטרודה (Stoelting ושות' ווד דייל, אילינוי) משמש כדי לייצר microcannula עם שוק ארוכה, מתחדדת. (ב) סליל החימום ניתן להתמצא עבור קלות שימוש, ואת microcannula ממוקם בתוך הסליל, המאפשר להתכופף בזווית ישרה להיווצר באמצעות מלקחיים כמו צינורות זכוכית מחומם.
לאחר המספר הרצוי של microcannulas נעשה, אנחנו ממליצים עיקור עם אתילן אוקסיד או באמצעות החיטוי. מ"מ דיסטלי ביותר של 1-2 microcannula יכול להיות בצבע בטוש כירורגי סטרילי (או דיו קבע לפני עיקור) כדי לאפשר את קצה microcannula להיות דמיינו בקלות במהלך ההליך הכירורגי.
MOP הכנה
מגבים הוכנו על פי הוראות היצרן. בקצרה, מקורבות הפלסטיק מן MOP צינורות נירוסטה ("זרימה אפנן") מוסר הראשון באמצעות מספריים או rongeurs. אורכו של צינורות פוליאתילן (פלסטיק אחת, Roanoke, VA, # C312 VT, OD, 1.22 מ"מ; ID: 0.72 מ"מ) מחוברת בתחום צינורות נירוסטה הכבושה בעבר על ידי הוספת חלד על ידי אוגן (~ 4 מ"מ) צינורות פלדה לתוך לומן של צינורות פוליאתילן ואבטחת עם דבק מתאים סביב ההיקף החיצוני של החיבור. LumaBond (myNeuroLab, Inc, סנט לואיס, מיזורי) הוא שימושי במיוחד כפי שהוא מרפא בתוך שניות בחשיפה לאור ממוקדת (למשל, של מנורת סיבים אופטיים). אורכו של הצינור צריך המרחק המשוער בין בסיס הגולגולת של החיה ואת היבט מקורי ביותר של השכמות (למשל, כ 1.5-3.0 ס"מ על חולדות מעבדה). המשאבה היא מילאה הנחיות, ואת נירוסטה ALZET צינורות, עם אורך של צינורות פוליאתילן המצורפת סופו, מוכנס לתוך המשאבה מלא. נפח קטן של פתרון מהמשאבה ייאלצו סביב החלק החיצוני של ממשק משאבה בצינור (ויש וניגבה משם) וגם לאיזור הפרוקסימלי של צינורות פוליאתילן. המשאבה מלא צינורות מחוברים הוא מודגרות אז ב 37 ° C. בתוך תמיסת מלח סטרילית למשך 12 שעות אם המשאבה פועל כהלכה, לאחר תקופה הדגירה, נוזל שנראה כי נסע כמה מילימטרים בתוך צינורות פוליאתילן.
לבנות יון של מערכת microinfusion
המשאבה עם צינור המחובר שלה הוא שקוע בתוך צלחת פטרי 10 ס"מ המכיל תמיסת מלח סטרילית, והאוויר הנותר בתוך צינורות פוליאתילן מוסר באמצעות מזרק מלא פתרון זהה הכלול המשאבה ואת אשר כבר מצויד בצינור בקוטר קטן כי יכול להיות מוכנס בתוך צינורות פוליאתילן. הפתרון כך ניתן להזריק לתוך צינורות פוליאתילן כדי להחליף את האוויר. באופן דומה, microcannula הוא שקוע לאמבטיה מלוחים אוויר מוסר על ידי הזרקת פתרון. זו מושגת בקלות עם פתרון מלא שנייה מזרק מצויד בצינור (למשל, סיליקון) גמישה שמתאימה יותר בסופו של דבר (פרוקסימלי) גדול microcannula.
סוף הפרוקסימלי של צינורות בורוסיליקט מוכנס מכן לתוך צינורות פוליאתילן. שים לב כי זה עשוי לדרוש התרחבות של צינורות פוליאתילן על ידי לחיצה על בתקיפות טיפים סגור של microforceps לתוך לומן ובכך מתרחבים הפתיחה להכנסה קלה של צינורות בורוסיליקט. מערכת האוויר ללא עירוי מוסר אז מהאמבטיה מליחים מונח על משטח סטרילי מיובשים בעדינות עם גזה או מטלית כותנה. הקשר microcannula-צינורות פוליאתילן מאובטח עם מעיל ההיקפי של דבק (למשל, LumaBond).
אם המערכת כבר התאספו כראוי, ואם MOP ממשיך לתפקד כמו שצריך, במהלך השלב הסופי של הליך זה טיפה של הפתרון יהיה בדרך כלל מופיעים בקצה microcannula כמנגנון האוסמוטי בתוך המשאבה ממשיכה במהלך ההכנה. קצב זרימת MOP ניתן להפחיתן באופן יחסי עם פרפין ידי ציפוי פני השטח בהתאם הורה על ידי היצרן. לגבי ההפגנות הנוכחי, 50% MOP כל מטויח על ידי לחיצה קצרה טובל אותו פרפין מותך המאפשר לה להתקרר, ובכך להקטין את קצב הזרימה על ידי חצי μL 0.125 / hr. המערכת microinfusion השלים הוא שקוע אז סליין סטרילית המאוחסן ב 37 ° C עד ההשתלה.
השרשה של מערכת microinfusion
המערכת microinfusion הוא מושתל באמצעות שיטות stereotaxic תקן כפי שתואר קודם לכן (Cooley, 1990). לאחר הכנה של שדה כירורגי, חור קוץ הוא קדח עבור כניסת microcannula. אם תרצה, ברגים בגולגולת יכול להיות גם מיקומו על מנת לייצב את מתחם מליטה להשתמש כדי לאבטח את microcannula. המתחם נעשה שימוש במעבדה זו (Geribond, Den-Mat Inc, סנטה מריה, CA) אינו דורש עיגון נוספים, אולם על פני הגולגולת חייב להיות מוכן על ידי ניקוי עם מטלית כותנה acetonedampened. 1-2 מ"מ קוטר "וו" הוא עשה בסוף דיסטלי של התיל יישור (ראה איור. 1), שמאפשר לו להקיף את העיקול בצינור בורוסיליקט. זה מאובטח אז (באמצעות LumaBond), בכיוון לאורך ציר זהה בחלק דיסטלי של microcannula (כלומר להיות מתקדמים לתוך המוח, ראה איור. 3B). המערכת עירוי מותקן אז על המוביל stereotaxic (איור 3), מהדק את החוט יישור על המחזיק. תפר סטרילי משמש כדי לקשור את משאבת עירוי לחלק העליון של המניפולטור stereotaxic, ובכך השעיית זה ומניעת אובדן אוריינטציה במהלך ההליך בשל המשקל (וגם מומנט) של המשאבה (איור 3B). Microcannula אז יכול להיות מוצב בכיוון הרצוי (למשל אנכי בדיוק) באמצעות מלקחיים כדי לכופף בעדינות את החוט יישור דיסטלי כדי לצבוט המוביל. טיפ microcannula ממוקם מעל נקודת התייחסות (למשל, גבחת או למבדה) ולאחר מכן תמרן עד כדי כניסה לתוך המוח. מרכזת המשמשים את בעלי החיים בניסויים אלה היו: גבחת 0.2 מ"מ, 3.2 מ"מ לרוחב, ו - 5.0 מ"מ הגחון מתחת הדורה עם ראש של חיה במצב גולגולת שטוח.
לאחר microcannula מתקדמת לעומק המתאים בתוך המוח, המערכת היא קבועה למצב עם תרכובת הדום (למשל, Geribond). הדום ניתן מפוסלים קרוב לפני השטח של הגולגולת כדי להקל על סגירת הפצע. לאחר במתחם הדום ריפא (~ 2 דקות), חוטי היישור הוא חתך מיושר עם הכן בעזרת גלגל חיתוך של המקדחה. כמות קטנה של חומר ניתן להשתמש כדי לכסות את חלקה העקיצה הנותר מן החוט ניתק. MOP מוכנס אז תת עורי, ממוקם בין השכמות של החיה. לבסוף, הפצע הוא lavaged עם מי מלח סטרילי, החתך נסגר באמצעות תפרים או קליפים הפצע (איור 3, לוח ד).
מערכת croinfusion ממוקם על השמה קיבעון בתוך חיה. (ד) תכנון של מערכת microinfusion מאפשר סגירה נוחה של החתך על בסיס פרופיל נמוך, הפחתת זיהום הסיכון ומזעור אי נוחות לבעל החיים. "רוחב =" 511 "גובה =" 381 "/>
איור 3: השרשה של מערכת microinfusion. (א) מיקום של מערכת microinfusion על מכשיר stereotaxic. (ב) MOP הוא קשור באמצעות תפר סטרילי כדי למנוע את משקלו מ לשבש את הכיוון של microcannula. Microcannula ממוקמת לכניסה אנכי מדויק לתוך המוח באמצעות חוט יישור. (ג) מערכת microinfusion ממוקם על השמה קיבעון בתוך חיה. (ד) תכנון של מערכת microinfusion מאפשר סגירה נוחה של החתך על בסיס פרופיל נמוך, הפחתת זיהום הסיכון ומזעור אי נוחות לבעל החיים.
הכנה השתלת מערכת אינפוזיה רגילה
הליך ההכנה של מערכת העירוי הסטנדרטי הוא זהה לזה של מערכת microinfusion למעט microcannula מוחלפת "האוסמוטי מחבר משאבה צינורית" בקוטר של 300 מיקרומטר (28 ga; פלסטיקה אחת, Roanoke, VA, # 3300PM / SPC, ראה איור 5 א). השרשה של המערכת הסטנדרטי הוא גם זהה לזו של מערכת microinfusion, לרבות התקשרות של תיל יישור אנכי כדי לאפשר מיקום מדויק של צינורית כניסתו למוח.
היסטולוגיה וניתוח
כדי לבחון את היכולת של מערכת microinfusion לספק משלוח מתמשכת של גרין מהיר, בקבוצות של שלושה בעלי חיים הוקרבו על 12 שעות, 1 יום, 2 ימים, 4 ימים לאחר הניתוח. הנבדקים בהרדמה עמוקה עם pentobarbital נתרן (120 מ"ג / ק"ג, IP) perfused transcardially עם 200 מ"ל של 0.1M שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) ואחריו 400 מ"ל paraformaldehyde 4% חיץ phospate 0.1M. פתרונות זלוף הוחזקו על 4 ° C, עם pH של 7.4 ו perfused בשיעור של 50 מ"ל לדקה באמצעות משאבת peristaltic. על מנת להסיר את cannulas מבלי לפגוע ברקמות שלאחר המוות, החיה perfused נקבע במסגרת stereotaxic, הכן היה מאובטח עם דבק חוט קשיח המצורף מהדק את זרוע מניפולטור, ואת הגולגולת שהוסר בקפידה מרחבי הכן באמצעות שיניים בר. הכן את הצינורית הבסיסית הוסרו וכך לאורך מסלול זהה לזה שבו היתה צינורית מתקדמים עבור מיקום. המוח הוסרו אז מן מכסה הגולגולת ואת שקוע במשך 12 שעות מקבע אותו.
להערכת עירוי מתמשך של גרין מהיר, חלקים עם עובי של 200 מיקרומטר נחתכו באמצעות Vibratome (myNeuroLab, סנט לואיס, מיזורי) ועלה רטוב בשקופיות זכוכית. נציג קטעים היו הדמיה באמצעות סורק CANOSCAN Canon LiDE 600F. להערכת טראומה מקומית דבקת תגובתי, 70μm סעיפים Vibratome היו הראשונים רטוב רכוב וצילם בלא כתם כדי למנוע עיוות רקמות שעלולות להתרחש עם תהליכים היסטולוגית, כגון ייבוש, מכתים, והתייבשות. סעיפים אלה זהה הורשו אז לייבוש על גבי שקופיות ג'לטין מצופה זכוכית שלהם, והם היו מוכתמים hematoxylin ו eosin (H & E), מיובש עם כהלים מדורגים, ומכסים-החליק עם Permount.
סמוך סעיפים 70 מיקרומטר עבר הליך immunofluorescence תקן לזהות חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP), אשר באה לידי ביטוי על ידי האסטרוציטים בתהליך של דבקת תגובתי בתגובה טראומה (דינג et al, 2000;.. מא et al, 1991). בקצרה, ריחוף ללא סעיפים היו שטופים עם PBS וחסמו עם 10% נורמלי חמור בדם (NDS) ו בסרום שור 3% אלבומין 0.1 M-PBS עם 0.3% Triton X-100 (PBS / טריטון) במשך שעה אחת ו מודגרות מכן ארנב נגד GFAP נוגדן (1:500; סיגמא כימית ושות', סנט לואיס, מיזורי) ב-PBS / טריטון עם NDS 1% למשך 12 שעות 4 ° C. מדורים היו שטופים אז עם PBS ו מודגרות עם אלקסה פלואוריד ® 594 חמורים antirabbit נוגדנים משני (1:500, בדיקות מולקולריות, Inc, יוג'ין, OR) ב-PBS עם NDS 5% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הסעיפים היו השטיפה שוב עם PBS ו counterstained עם NeuroTrace ® ירוק ניאון Nissl כתם (ב PBS 1:500 במשך 5 דקות, בדיקות מולקולריות, Inc, יוג'ין, OR). לאחר השטיפה הסופית עם PBS, היו קטעים רכוב על ג'לטין מצופה שקופיות coverslipped עם איטי-Fade (בדיקות מולקולרית). Photomicrographs כל נרכשו באמצעות מיקרוסקופ Axioskop Zeiss עם AxioVision תוכנה (Carl Zeiss, Inc, Thornwood, ניו יורק).
תוצאות
במבחנה בדיקה
לפני הערכה בבעלי חיים, בשלוש מערכות microinfusion הוכנו על ידי הצבת הירוק מלא מהיר שלהם מגבים לתוך בתא אחד (15 מ"ל צינור חרוטי) ומיקום microcannulas שלהם בתא השני (1 מ"ל אפ Endorf צינור), שניהם מלוחים סטרילית המכילה בשעה 37 ° C. כל מערכת הפגינו זרימה רציפה של צבע על פני 12 שעות של התבוננות. איור 4 מדגים תפקוד מערכת טיפוסי מעל 3 שעות.
איור 4: בהפגנה במבחנה של תפקוד המערכת microinfusion. (א) זרימה של צבע ירוק מהיר נתפסת בקלות ללא הפרעה מן microcannula בתחילת בתקופת מבחן חוץ גופית. (ב) כפי ממשיך לזרום, הפתרון מאגר הופך רווי (ב), ו בסופו של דבר עם צבע אטום (C).
הערכת במערכת microinfusion vivo
לאחר זלוף, microcannulas הסיר והקשרים שלהם נבדקו בקפידה, וכל נמצאו שלמים לחלוטין. לפיכך, יש לא התרחשה שבירה של הזכוכית בורוסיליקט בתוך הרקמה, לא היו שום פגמים החיבורים של רכיבי המערכת. 10. L מלוחים מלאים מזרק המילטון עם אורך קצר של צינורות סיליקון מחוברת המחט שלו שימש כדי להחיל תזרים עדינות לסוף חתך של צינורות פוליאתילן המצורפת microcannula. כל שנים עשר microcannulas המותר המשיך לזרום ולא להיראות חסום. יתר על כן, לאחר הסרת כל MOP מן החיות, בנפח של הפתרון הנותרים נמדדה ונמצא כי הוא מתאים קצב הזרימה של MOP (0.125 μL / שעה) ואת משך הזמן הורשה לתפקד.
במשלוח vivo
הערכת סעיפים העטרה של רקמת רווי הירוק הפגינו השתנות מהירה מעט בחלוקת בין בעלי חיים בתוך קבוצות בכל נקודת זמן נתונה (12 שעות, 1 יום, 2 ימים, 4 ימים). איור 5 מדגים אזורים נציג של דיפוזיה מהירה של גרין אלה נקודות זמן מראה עלייה פרוגרסיבית חדירה לצבוע במשך ארבעה ימים. שים לב כי ניסויים לפני באמצעות ריכוזים גבוהים יותר של גרין מהיר (למשל, 5 - 15%) הביא opacification המהירה של parenchyma, ובכך מסתיר הערכה מדויקת של תפקוד של מערכת microinfusion לאורך זמן. למרות ההיקף המלא של דיפוזיה לצבוע 1% יכול להיות קשה לקבוע במדויק על בדיקה ברוטו, אזורים של חדירת היו להבחין בקלות בהגדלה 2.5x, והם הצביעו עם קווים מקווקווים באיור 5.
איור 5: ב demonstation vivo של microinfusion מתמשכת של גרין מהיר. (א) שתים עשרה שעות לאחר הצבת intrastriatal של מערכת גרין טעון מהיר microinfusion, לצבוע נתפסת לשדר לתוך parenchyma המקיפה את אתר microcannula. תצפיות ביום 1 (ב), 2 ימים (ג), ו - 4 ימים (ד ') מצביעים על המשך אספקת פתרון ירוק מהיר עם אזורים הגוברת של חדירת צבע. המגבלה החיצונית של דיפוזיה נצפתה תחת מיקרוסקופ כוח נמוך, והוא עולה כאן עם קווים מקווקווים. סרגל קנה מידה, 2 מ"מ.
הערכה של טראומה דבקת תגובתי
תצפית של גרוס, קטעי תספורת רקמה בלא כתם הראו כי מערכת microinfusion הביא לירידה טראומה נקודתיים באתר המסירה. צינורית תקן נתפסה תמיד לשבש את מקומו שטח גדול יותר של רקמה (איור 6B & C), אשר מוערכת יותר בהספק גבוה עם H & E (איור 6 ד & E). יתר על כן, לעתים קרובות לראות דם שהצטבר באתר עירוי סטנדרטית (איור 6 ד), דבר המצביע על מידה רבה יותר של פשרה כדי vasculature ו רומז שלמות ירידה של מחסום דם מוח.
מערכת microinfusion גם הביא דבקת תגובתי הקטינה באופן משמעותי כפי שהפגינו immunoreactivity ירד עבור GFAP באזור עירוי דרך microcannula (איור 6 גרם) בהשוואה צינורית רגילה (איור 6F). בעוד microcannula-Induced מכתים GFAP היה מוגבה מעל רמות נורמליות (איור 6 שעות), ההסלמה מרשימה דבקת תגובתי עם מיקום צינורית אינפוזיה רגילה (6F) היה לא לראות כאשר מערכת microinfusion הועסק.
ivery צינורית לאחר 5 ימים של עירוי תמיסת מלח. (א) microcannula משך מן בורוסיליקט צינורות בקוטר טיפ של 50. מ מאפשר זרימה חופשית, בלתי מוגבלת של רוב סוכני neuroactive, אך הוא קטן יותר מאשר 6X מסירה צינורית סטנדרטי (28 ga, 0.30 מ"מ). (B, C) בלא כתם, עולה רטוב סעיפים העטרה (עובי, 70. מ ') הממחישות יותר נזק לרקמות מקומיות (חיצים) הנגרמת על ידי תקן צינורית (ב) בהשוואה microcannula (C). (D, E) photomicrographs כוח גבוהה סעיפים H & E מוכתם שמוצג B ו-C, בהתאמה. צינורית רגילה גרם פציעה טראומטית נרחב יותר כפי שמודגם ברה, לאחר שנעקרו שטח גדול יותר של רקמות וגרימת עלבון גדול יותר vasculature הפגינו כמו בתוך חלל הנגע (חץ) על ידי איסוף של דם. פצע שנגרם על ידי microcannula, לעומת זאת, קטן בצורה משמעותית ומפריעים פחות רקמת באתר של אינפוזיה. (F, G, H) immunofluorescence נגד GFAP מדגים עלה באופן דרמטי מספר GFAP + האסטרוציטים מסביב לפצע של צינורית רגילה (F) בהשוואה לזה של microcannula (G) בסטריאטום נורמלי, unlesioned (H). סולם ברים: A ו-B, 1 מ"מ; ד '- ח', 250 מ' "/>.
איור 6: טראומה הנגרמת על ידי microcannula לוקליזציה לעומת צינורית במשלוח רגיל לאחר 5 ימים של עירוי תמיסת מלח. (א) microcannula משך מן בורוסיליקט צינורות בקוטר של 50 מיקרומטר קצה מאפשר זרימה חופשית, בלתי מוגבלת של רוב סוכני neuroactive, אך הוא קטן יותר מאשר 6X מסירה צינורית סטנדרטי (28 ga, 0.30 מ"מ). (B, C) בלא כתם, עולה רטוב סעיפים העטרה (עובי, 70 מיקרומטר) הממחישות יותר נזק לרקמות מקומיות (חיצים) הנגרמת על ידי צינורית תקן (ב) בהשוואה microcannula (C). (D, E) photomicrographs כוח גבוהה סעיפים H & E מוכתם שמוצג B ו-C, בהתאמה. צינורית רגילה גרם פציעה טראומטית נרחב יותר כפי שמודגם ברה, לאחר שנעקרו שטח גדול יותר של רקמות וגרימת עלבון גדול יותר vasculature הפגינו כמו בתוך חלל הנגע (חץ) על ידי איסוף של דם. פצע שנגרם על ידי microcannula, לעומת זאת, קטן בצורה משמעותית ומפריעים פחות רקמת באתר של אינפוזיה. (F, G, H) immunofluorescence נגד GFAP מדגים עלה באופן דרמטי מספר GFAP + האסטרוציטים מסביב לפצע של צינורית רגילה (F) בהשוואה לזה של microcannula (G) בסטריאטום נורמלי, unlesioned (H). סולם ברים: A ו-B, 1 מ"מ; ד - ח, 250 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים שונים הוכיחו כי באמצעות הפחתת גודל הצינורית המסירה עבור חליטות intracerebral, טראומה רקמות עלבון מחסום דם מוח מופחתים (פרי et al., 1993), דלקת הוא ירד ואת המערכת החיסונית בתגובה נחלש (Finsen ואח' דבקת., 1991), תגובתי היא פחתה (Nikkhah et al. 1994). אנו מציגים כאן שיטה להעברת כרונית של סוכני neuroactive בתוך המוח באמצעות microcannula בקוטר כי הוא מופחת של פי 6 בהשוואה לזו של cannulas מסירה כמקובל בשימוש. אנחנו הוכיחו כי מערכת זו מספקת פתרון אמין נציג לאורך זמן את רמת טראומה מקומיים דבקת תגובתי מצטמצם באופן דרמטי. מחקרים אלה המועסקים צינורית משלוח בקוטר קצה הסופי של 50 מ ', אך בקטרים טיפ קטן עשוי להיות מנוצל. המעלה העיקרית של מערכות microinfusion כזה הוא היכולת שלהם לספק סוכנים, מטרות קטנות מאוד דיסקרטי, תוך גביית טראומה מינימלית בסביבה של העירוי.
Microcannulas המשמשים לבניית מערכת עירוי אנו מתארים ניתן בקלות שהותקן עם אורכי מראש בקטרים קצה. המערכת microinfusion נועד להתאים את פני השטח של הגולגולת של החיה המאפשר לאבטח, פרופיל נמוך קיבעון ואת מניעת הצורך הדום גולגולתי גדול. פצע כירורגי ולכן ניתן sutured בקלות על הכן microinfusion יעיל, ובכך להקטין הן נוחות החיה את הסיכון לזיהום. בנוסף, להבטחת מערכת הגולגולת דורש פחות שטח פני הגולגולת, ולכן נהלים נוספים או לאחר מכן ניתן לבצע ללא הפרעה מן הדום גדול יותר.
ראוי, עם זאת, לשקול שיקולים טכניים מסוימים כאשר העסקת את המתודולוגיה המתוארת כאן. רמה גבוהה יותר של מיומנות נדרשת, ועל הליך ייצור ההשתלה הוא פחות יעיל מאשר זמן זה עשוי להיות עבור מערכות עירוי סטנדרטי. מצד שני, זה עשוי להיות עולות, או counterbalanced לפחות, לפי הזמן (וחיות) ניצל על ידי תרגול דיוק גבוהה טכניקה. קושי נוסף הוא שבעוד microcannula יכול להיות מותאם אישית עם כמעט כל קוטר, microcannula עם לומן קטן מאוד יכול להיות חסום, או על ידי המרכיבים של infusate או על ידי רקמה נתקל במהלך ההשתלה (למשל, דם, רקמת מוח). סיכון זה מופחת על ידי שמירה על קצה microcannula לחלח (למשל, שימוש במים מליחים או רווי צמר גפן כדי למנוע התייבשות של מומסים infusate) במהלך הליך ההשתלה על ידי ביצוע נקי, "דם נקי" הניתוח.
אנו ממליצים כי החוקר להקים בקוטר טיפ microcannula המתאימה להרכב מסוים ו / או צמיגות של פתרון זה יהיה טעון לתוך MOP. זו מושגת בקלות על ידי שימוש במערכת בדיקה חוץ גופית דומה לזה המתואר בפרוטוקול (איור 4), או פשוט על ידי טבילה מערכת נאספו אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מלוחים ניטור הרכב אמבטיה ו / או מדידת נפח התכנים MOP לאורך זמן. החיסרון הוא כי microcannula הוא שברירי יחסית, במיוחד אם בקוטר קצהו הוא קטן מאוד (למשל, ~ 10-50 מיקרון). בטעות לשבור את microcannula במהלך הניתוח מחייב בדרך כלל את המערכת כולה יוחלף, כמו תיקון או שיקום כי יחידת יאריך זמן הניתוח באופן משמעותי. מדענים מיומנים בטכניקות כגון ומי שיטת תרגול מחמיר לעתים נדירות שבר ניסיון, עם זאת.
בתום הניסוי, המערכת microinfusion יכול להיבדק על מנת להבטיח כי microcannula לא נפגעה וכי היא נותרה פטנט. היקף משאבת מיני האוסמוטי יכולה גם להימדד על מנת להבטיח את הכמות המתאימה של סוכן neuroactive נמסרה; אנחנו לא ממליצים למיחזור או שימוש חוזר משאבות, עם זאת. בעוד שיטות נכחו הפגינו חולדות מבוגרים, השימוש במערכת המפחיתה הטראומה דורש פחות שטח פני הגולגולת קיבעון יכולה להיחשב עדיפה על פני שיטות קונבנציונליות עבור ניסויים עם בעלי חיים קטנים, כגון עכברים או חולדות צעירות.
אף על פי השיטה הנוכחית דורשת רמה מסוימת מתקדמים יותר של מיומנות וכישורים על ידי הנסיין, הוא מציע להגדיל את דיוק אולי סדר גודל, כדי למזער מקעקעת את הניסוי קשור טראומה לאזור של עניין. במעבדה שלנו, מצאנו כי זה מיתרגם תופעות אמין ויציב יותר של התערבות הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
Tags
Neuroscience בגיליון 13 משאבת האוסמוטי מיני עירוי כרונית microcannula מהיר ירוקErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
