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Summary
Als neurowissenschaftliche Untersuchung wird immer anspruchsvoller, die Untersuchung von Hirnstrukturen und-Schaltung erfordert eine verbesserte Genauigkeit und eine höhere Auflösung. Wir haben ein Verfahren zur Herstellung und Implantation einer chronischen Infusion System im Gehirn unter Verwendung einer Borosilikat Mikrokanüle mit einer Spitze Durchmesser von 50 Mikrometer entwickelt.
Abstract
Experimental-Protokolle für die chronische Infusion von neuroaktiven Agenten in Regionen des Gehirns eingesetzt nutzen oft eine Mini-osmotischen Pumpe-System. Agents werden in der Regel über eine Kanüle aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 0,30 mm oder mehr geliefert. Systeme unter Verwendung einer Kanüle von diesem Kaliber kann Trauma im Bereich der Zinsen, die sich in Architektur Schaden zu verhängen, damit Kompromisse strukturelle Integrität und das normale Funktionieren. Als neurowissenschaftliche Untersuchung wird immer anspruchsvoller, die Untersuchung von Hirnstrukturen und-Schaltung erfordert eine verbesserte Genauigkeit und eine höhere Auflösung. Wir haben ein Verfahren zur Herstellung und Implantation einer chronischen Infusion System im Gehirn unter Verwendung einer Borosilikat Mikrokanüle mit einer Spitze Durchmesser von 50 Mikrometer entwickelt. Diese Technik reduziert den Schaden für die lokale Umwelt und verringert reaktive Gliose am Ort der Infusion. Die Konfiguration der Mikroinjektion ist auch in der Lage, auf der Oberfläche des Tieres Schädel entsprechen, unter Ausschluss der Bedarf an großen kranialen Sockeln und erleichtert so Schließung der Kopfhaut Schnitt und reduzieren das Risiko einer Infektion. Wir zeigen zuverlässig anhaltende Abgabe eines Farbstoffes mit einem Vertreter Molekulargewicht mit einem in vitro-Modell und in vivo Studien an Ratten.
Protocol
Einführung
Direkte Infusion von neuroaktiven Agenten können bestimmte Hirnregionen zu untersuchen unter Umgehung der Blut-Hirn-Schranke werden. Die Anwendungen dieses Ansatzes in den Neurowissenschaften sind vielfältig und beinhalten die Änderung der Ebene der Hirnaktivität in diskrete Teilbereiche (Berretta et al, 2004;. Gliddon et al, 2005;.. Kim et al, 2000), das Handeln von psychotropen Substanzen ( Clinton et al, 2006;.. Di Benedetto et al, 2004), eine kontrollierte Modelle der Entzündung des Gehirns (Hauss-Wegrzyniak et al, 1998;. Marchalant et al, 2007;.. Rosi et al, 2004), die Erforschung der Mechanismen der Sucht (Kim et al, 2005;. Lockman et al, 2005;. Zhang et al, 2006.), und ermöglicht eine langfristige Anwendung von trophischen Faktoren (Naert et al, 2006;.. Radecki et al, 2005; Takahashi et al., 2006).
Standard-Methoden für chronische Lieferung von Agenten verwenden oft eine Mini-osmotischen Pumpe (zB Alzet osmotische Pumpen, Cupertino, CA) mit einem neuroaktiven Agenten, die im Gehirn durch eine Kanüle aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser, der kann im Bereich geliefert geladen von 0,25 mm (Williams et al, 1987.) bis 0,5 mm, aber am häufigsten ist ca. 0,3 mm (Plastics One, Roanoke, VA, siehe Abb. 6A). Während Lieferung Kanülen dieser Größe kann für viele Anwendungen geeignet, in denen hohe Präzision nicht erforderlich sind und das Trauma der Mikroumgebung ist nicht ein großes Anliegen, sind diese Kanülen suboptimal für die Bereitstellung von Mitteln für kleine, zarte Standorte, an denen die Kanüle ist vergleichbar in der Größe (oder größer als) die gezielte Struktur selbst, oder wenn die Funktion darf nicht durch traumatische Beleidigung beeinträchtigt werden.
Präsentiert hier ist ein Verfahren zur Herstellung und Implantation einer chronischen Infusion System für die Lieferung von neuroaktiven Agenten innerhalb des Gehirns, der ein "Mikrokanüle" mit einer deutlich reduzierten Durchmesser. Diese Technik ermöglicht es kleinen Unterkonstruktionen ins Visier genommen werden und reduziert die Traumatisierung der der Bereich von Interesse. Das derzeitige Verfahren ist somit als Alternative zu herkömmlichen Methoden für Forscher, die Störung der Hirnregion zu minimieren untersuchten Wunsch vermittelt.
Material und Methoden
Tiere und Design
Achtzehn Erwachsenen (400-450 g) männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden verwendet, um das Verfahren zu demonstrieren und testen Sie die Funktion des vorliegenden Verfahrens. Zwölf Tiere wurden mit Mikroinjektion Systeme implantiert und trug zu einer zeitlichen Verlauf Auswertung der anhaltenden Funktion über 4 Tage. Sechs Tiere wurden verwendet, um Ebene von Trauma und reaktive Gliose 5 Tage nach der Implantation entweder ein Standard-28 ga Zuführungskanüle (N = 3) oder eine Mikrokanüle (N = 3) zu vergleichen an einem mit Kochsalzlösung gefüllte mini-osmotischen Pumpe. Die Tiere wurden in durchsichtigen Kunststoff Käfigen untergebracht und gepflegt auf einem 12-Stunden-Hell / Dunkel-Zeitplan, mit Futter und Wasser ad libitum. Alle Verfahren wurden vom McLean Hospital Institutional Animal Care und Verwenden gebilligten in Übereinstimmung mit den anwendbaren Bundes-und örtlichen Richtlinien für die experimentelle Verwendung von Tieren.
Mikroinfusion Systemmontage
Abbildung 1 zeigt die Komponenten und die Montage der Mikroinjektion System. Wir empfehlen den Bau und Implantation des Systems mit steriler Technik. Darüber hinaus, um Eindringen von Luft in das System zu verhindern, ist es zusammengebaut, während innerhalb einer Salzlösung getaucht. Für die vorliegenden Untersuchungen wurden mini-osmotischen Pumpen (MOP) eingesetzt (Alzet, Modell # 1002, Cupertino, CA) mit einer 14-tägigen Dauer, Durchfluss von 0,25 ul / h und einer Kapazität von 98,6 füllen ul. Da jedoch hohe Strömungsgeschwindigkeiten können Sintflut kleinere Bereiche von Interesse in das Gehirn und verursachen strukturelle Schäden, die Durchflussmenge für diese Studien auf 0,125 ul / h wurde durch die Beschichtung eine Hälfte des MOP mit Paraffin sank nach Angaben des Herstellers angewiesen. Für die Auswertung der lokalen Traumata, wurden MOPs mit einer sterilen Kochsalzlösung gefüllt. Zur Auswertung der nachhaltige Funktion Mikroinjektion Systeme, Fast Green (1% in Kochsalzlösung, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) wurde als Test-Lösung wegen ihrer geringen Toxizität, seine Fähigkeit, innerhalb von lebensfähigen Hirngewebe diffus, und weil es gewählt hat ein Molekulargewicht (808,84) am oberen Ende der Spanne für "small molecules" (<1000), die allgemein von Interesse sind für chronische Infusion (zB Muscimol, Pikrotoxin, Fluoxetin, etc.).
Abbildung 1: AssemBly der Mikroinjektion System. (A) Die Komponenten des Systems gelegt in ihre relativen Positionen für die Montage. Beachten Sie den Flansch von der Strömung modulater Schlauch wurde weggebrochen. Wir empfehlen die Ausrichtung Draht kurz vor der Implantation gesichert werden (siehe Text). (B) montiert Mikroinjektion System vor der Anbringung der Ausrichtung Draht und Implantation.
Mikrokanüle Vorbereitung
Die Mikrokanüle kann fashioned mit einem Standard-horizontale oder vertikale Elektrode Abzieher (Stölting Co., Wood Dale, IL) mit den Einstellungen für die Herstellung einer Glaselektrode mit einem langen, sanft zulaufenden Schaft (Abb. 2a). Borosilikat Schlauch ist für diesen Zweck geeignet (Teil 1B100F-6, 1,0 mm, 6 in, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL), da es einen relativ niedrigen Schmelzpunkt, so dass nachfolgende Biegung mit konzentrierte Hitze. Die am weitesten distal Teil einer geraden Mikrokanüle mit Dissektion Schere geschnitten werden oder eine kontrollierte brechen kann mit microforceps (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) vorgenommen werden, um die gewünschte endgültige Spitzendurchmesser (geben 50 um für die Gegenwart Demonstrationen ) und ein Mikroskop Objektmikrometer ist nützlich, zu leiten und zu bestätigen, den gewünschten Durchmesser. Der Cut-Spitze lässt sich kurz erwärmt werden, oder "Feuer-poliert", zu rau oder scharfe Kanten zu entfernen. Die Heizwendel der Elektrode Abzieher oder einem Bunsenbrenner wird dann verwendet, um einen rechten Winkel auf die Mikrokanüle in einem vorgegebenen Abstand von der Spitze des Mikrokanüle (Abb. 2B) zu verhängen, indem Sie die Borosilikat-Schlauch innerhalb der Heizwendel (oder einer Bunsenflamme ) und die Anwendung sanfter Gewalt auf den distalen Abschnitt mit einer Pinzette als der Schlauch erwärmt. Die vorgegebene Länge der Mikrokanüle distal der verhängten rechten Winkel auf die Tiefe des Gehirns Region beschlossen, gezielt (zB 5 mm) und unter Berücksichtigung der Schädel Dicke (~ 1 mm) und Arbeitsbedingungen Abstand über dem Schädel ( zB 1-2 mm). So ist die vorgegebenen Abstand von der Spitze des Mikrokanüle die verhängte rechten Winkel für die Gegenwart Demonstrationen war 7-8 mm. Ein Diamant Bleistift wird dann verwendet, um die Borosilikat-Schlauch ca. 8 mm proximal der rechten Winkel schneiden.
Abbildung 2: Herstellung von Mikrokanüle. (A) Eine Elektrode Abzieher (Stölting Co. Wood Dale, IL) wird verwendet, um eine Mikrokanüle mit einem langen, spitz zulaufenden Schaft zu produzieren. (B) Die Heizwendel kann für einfache Bedienung ausgerichtet sein, und die Mikrokanüle ist innerhalb der Spule platziert, so dass eine Kröpfung zu bilden mit einer Pinzette die Glasröhren erhitzt werden.
Nachdem die gewünschte Anzahl von Mikrokanülen gemacht worden ist, empfehlen wir eine Sterilisation mit Ethylenoxid oder mit einem Autoklaven. Die am weitesten distal 1-2 mm der Mikrokanüle kann mit einem sterilen OP-Marker (oder permanente Tinte vor der Sterilisation), damit die Mikrokanüle Spitze zu leicht visualisiert während des chirurgischen Eingriffs eingefärbt werden.
MOP Vorbereitung
MOPs wurden nach den Anweisungen des Herstellers zubereitet. Kurz gesagt, ist die Kunststoff-Flansch aus dem Edelstahl-MOP-Schlauch ("flow-Modulator") zuerst entfernt mit einer Schere oder Rongeure. Eine Länge von Polyethylen-Schlauch (Plastics One, Roanoke, VA, # C312 VT; OD, 1,22 mm; ID: 0,72 mm) ist auf den Bereich der Edelstahl-Rohre zuvor durch den Flansch (~ 4 mm), indem Sie die Edelstahl besetzt befestigt Stahlrohr in das Lumen des Polyethylen-Schlauch und die Sicherung mit einem geeigneten Kleber um den äußeren Umfang der Verbindung. Lumabond (myNeuroLab, Inc., St. Louis, MO) ist besonders nützlich, da sie härtet innerhalb von Sekunden durch Bestrahlung mit gebündeltem Licht (z. B. aus einem Glasfaser-Lampe). Die Länge der Schläuche sollte ungefähr dem Abstand zwischen der Basis des Tieres Schädel und rostral am weitesten Aspekt der Schulterblätter (zB ca. 1,5-3,0 cm für Labor-Ratten). Die Pumpe gefüllt ist, wie angewiesen, und die Edelstahl-Alzet Schlauch, mit einer Länge von Polyethylen-Schlauch an seinem Ende, wird in den gefüllten Pumpe eingesetzt. Ein kleines Volumen der Lösung von der Pumpe wird an der Außenseite der Pumpe-Schlauch-Schnittstelle (und sollte entfernt werden, getupft) und auch in den proximalen Bereich des Polyethylen-Rohr gezwungen werden. Die gefüllten Pumpe mit angebautem Schlauch wird dann in steriler Kochsalzlösung für 12 Stunden bei 37 ° C inkubiert Wenn die Pumpe richtig funktioniert, nach dieser Inkubationszeit wird Flüssigkeit gesehen, reisten ein paar Millimeter in der Polyethylen-Rohr haben.
Konstruieren ion der Mikroinjektion System
Die Pumpe mit angeschlossenem Schlauch ist in einer 10 cm Petrischale mit steriler Kochsalzlösung eingetaucht und die restliche Luft in der Polyethylen-Rohr wird unter Verwendung einer Spritze mit der gleichen Lösung in die Pumpe und die enthaltenen gefüllt mit kleinem Durchmesser ausgestattet dass innerhalb der PE-Rohre eingesetzt werden. Lösung kann so in die Polyethylen-Schlauch injiziert werden, um die Luft zu ersetzen. Ebenso ist die Mikrokanüle in die Salzlösung getaucht und die Luft wird durch die Injektion mit der Lösung entfernt. Dies ist leicht mit einer zweiten Lösung Fertigspritze mit flexiblen (zB Silikon)-Schlauch, der über den großen (proximalen) Ende des Mikrokanüle ausgestattet und paßt somit erreicht.
Das proximale Ende des Borosilikat Schlauch wird dann in die Polyethylen-Rohr eingesetzt. Beachten Sie, dass dies eine Erweiterung der Polyethylen-Rohr durch ein Andrücken der geschlossenen Spitzen microforceps in das Lumen dadurch Abfackeln der Öffnung für ein leichtes Einführen des Borosilikat Schlauch benötigen. Die Luft-free Infusion System wird dann aus dem Salzbad entfernt und auf einer sterilen Oberfläche und vorsichtig mit Gaze oder einem Wattestäbchen getrocknet. Die Mikrokanüle-Polyethylen-Rohr-Verbindung ist mit einem umlaufenden Mantel der Kleber (zB Lumabond) gesichert.
Wenn das System richtig, montiert und wenn die MOP weiterhin, wie es funktionieren sollte, während der letzte Schritt dieses Verfahrens ein Tropfen der Lösung wird in der Regel an der Spitze der Mikrokanüle als der osmotische Mechanismus innerhalb der Pumpe erscheinen weiterhin während der Zubereitung. MOP Flussrate kann anteilig durch eine Beschichtung der entsprechenden Fläche verringert werden mit Paraffin, wie vom Hersteller angewiesen. Für die vorliegende Demonstrationen wurden 50% der jeweils MOP durch kurzes Eintauchen es in geschmolzenem Paraffin und ermöglicht es abkühlen beschichtet, wodurch der Durchfluss um die Hälfte auf 0,125 ul / hr. Die ausgefüllten Mikroinjektion System ist dann in steriler Kochsalzlösung eingetaucht und gelagert bei 37 ° C bis zur Implantation.
Die Implantation von Mikroinjektion System
Die Mikroinjektion System implantiert wird unter Verwendung von Standard stereotaktischen Methoden wie zuvor beschrieben (Cooley, 1990). Nach der Vorbereitung des OP-Feldes wird ein Bohrloch für die Einreise des Mikrokanüle gebohrt. Falls gewünscht, können Schädel Schrauben auch positioniert, um die Klebemasse verwendet werden, um die Mikrokanüle sichern zu stabilisieren. Die Verbindung in diesem Labor eingesetzt (Geribond, Den-Mat Inc., Santa Maria, CA) erfordert keine zusätzliche Verankerung, aber der Schädel Oberfläche muss durch eine Reinigung mit einem acetonedampened Wattestäbchen vorbereitet werden. Ein 1-2 mm Durchmesser "Haken" ist am distalen Ende der Ausrichtung Draht (siehe Abb. 1). Gemacht, so dass er die Kurve in der Borosilikat Schlauch umschließen. Es ist dann gesichert (mit Lumabond), in einer Orientierung auf der gleichen Achse wie die distalen Teil des Mikrokanüle (das ist in das Gehirn vorgeschoben werden, siehe Bild. 3B). Die Infusion System wird dann auf der stereotaktischen Träger (Abb. 3) montiert, Klemm die Ausrichtung Draht auf den Halter. Sterile Naht wird verwendet, um tether der Infusionspumpe an die Spitze der stereotaktischen Manipulators, damit deren Aussetzung und verhindert Verlust der Orientierung während des Verfahrens durch das Gewicht (und Drehmoment) der Pumpe (Abb. 3B). Die Mikrokanüle können dann in die gewünschte Ausrichtung (zB exakt vertikal) mit einer Pinzette vorsichtig biegen Sie die Ausrichtung Draht distal der Träger Klammer positioniert werden. Die Mikrokanüle Spitze über einem Bezugspunkt (zB Bregma oder lambda) positioniert und dann manövriert, die für die Einreise in das Gehirn. Die Koordinaten für die Tiere in diesen Experimenten verwendet wurden: Bregma +0,2 mm, lateral 3,2 mm und 5,0 mm ventral unter Dura mit dem Kopf des Tieres in einem Schädel-flachen Position.
Nach dem Mikrokanüle bis zur gewünschten Tiefe innerhalb des Gehirns fortgeschritten ist, ist das System in die richtige Position mit einem Sockel Verbindung (z. B. Geribond) fixiert. Die Säule kann in der Nähe der Oberfläche des Schädels, um den Wundverschluss zu erleichtern geformt werden. Nach dem Podest Verbindung ausgehärtet ist (ca. 2 min), ist die Ausrichtung Draht bündig mit dem Sockel mit dem Bohrer ist Schneidrad. Eine kleine Menge der Verbindung kann zur Abdeckung von und glätten die restlichen Widerhaken aus den abgetrennten Draht. Die MOP wird dann subkutan eingesetzt positioniert zwischen dem Tier scapulae. Schließlich wird die Wunde mit einer sterilen Kochsalzlösung gespült, und der Schnitt geschlossen mit Naht oder Wundklammern (Abb. 3, Panel D).
croinfusion System ist für die Platzierung und Fixierung innerhalb eines Tieres positioniert. (D) Die Gestaltung der Mikroinjektion System ermöglicht den einfachen Verschluss der Inzision über eine Low-Profile-Sockel, wodurch das Risiko Infektionen und minimiert Schmerzen für das Tier. "Width =" 511 "height =" 381 "/>
Abbildung 3: Die Implantation von Mikroinjektion System. (A) Positionierung der Mikroinjektion System auf stereotaktischen Instrument. (B) Die MOP ist angebunden mit sterilen Nahtmaterials zu seinem Gewicht von der Störung der Orientierung des Mikrokanüle verhindern. Die Mikrokanüle ist für die präzise vertikale Eintrag in das Gehirn mit der Ausrichtung Draht positioniert. (C) A Mikroinjektion System ist für die Platzierung und Fixierung innerhalb eines Tieres positioniert. (D) Die Gestaltung der Mikroinjektion System ermöglicht den einfachen Verschluss der Inzision über eine Low-Profile-Sockel, wodurch das Risiko Infektionen und minimiert Schmerzen für das Tier.
Vorbereitung und Implantation von Standard Infusionssystem
Das Verfahren zur Herstellung der Standardlösungen Infusion System ist identisch mit dem für die Mikroinjektion System mit Ausnahme des Mikrokanüle wird durch eine "osmotische Pumpe Anschluss Kanüle" mit einem Durchmesser von 300 um (28 ga ersetzt Plastics One, Roanoke, VA, # 3300PM / SPC, siehe Abb. 5a). Implantation des Standard-Systems ist auch identisch mit der Mikroinjektion, einschließlich der Anbringung einer Ausrichtung Draht präzise vertikale Positionierung der Kanüle für die Einreise in das Gehirn zu ermöglichen.
Histologie und-analyse
Um die Mikroinjektion Fähigkeit des Systems, nachhaltige Bereitstellung von Fast Green bieten zu untersuchen, wurden Gruppen von je drei Tieren in 12 Stunden, 1 Tag, 2 Tage und 4 Tage nach der Operation geopfert. Die Probanden wurden tief narkotisiert mit Natrium-Pentobarbital (120 mg / kg, ip) und transkardial mit 200 ml 0,1 M Phosphat-perfundierten Kochsalzlösung (PBS) mit 400 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphat-Puffer. Perfusion Lösungen wurden bei 4 ° C gehalten, mit einem pH von 7,4 und perfundierten mit einer Rate von 50 ml pro Minute mit einer Schlauchpumpe. Um die Kanülen ohne Beschädigung der postmortalen Gewebe zu entfernen, die perfundierten Tier in einem stereotaktischen Rahmen befestigt war, wurde der Sockel mit Kleber zu einem starren Draht an den Manipulatorarm Klemme gesichert und der Schädel wurde sorgfältig aus der ganzen Sockel entfernt mit eine zahnärztliche Grat. Der Sockel und die zugrunde liegende Kanüle wurden dabei auf der gleichen Bahn, in der die Kanüle für die Platzierung fortgeschrittenen entfernt wurde. Die Gehirne wurden dann von der Schädeldecke entfernt und eingetaucht für 12 Stunden im gleichen Fixativ.
Zur Auswertung der anhaltenden Infusion von Fast Green, Abschnitte mit einer Dicke von 200 um geschnitten wurden mit Hilfe eines Vibratom (myNeuroLab, St. Louis, MO) und nass montiert auf Glasplättchen. Vertreter Schnitte wurden abgebildet mit einem Canon CanoScan LiDE 600F Scanner. Für die Auswertung der lokalen Trauma und reaktive Gliose wurden 70μm Vibratom Teile zuerst nass montiert und fotografiert ungefärbten, um Gewebe Verzerrung, die mit histologischen Vorgänge, wie das Trocknen, Färben, und Dehydratation auftreten können, zu verhindern. Die gleichen Abschnitte wurden dann auf ihre Gelatine beschichtete Objektträger trocken, und sie wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H & E), dehydrierte mit abgestuften Alkohole gefärbt, und mit Permount cover-gerutscht.
Angrenzend 70 um Abschnitte erlebte eine Standard-Immunfluoreszenz Verfahren zur sauren Gliafaserproteins (GFAP), das von Astrozyten während des Prozesses der reaktiven Gliose in Reaktion auf ein Trauma (Ding et al, 2000..; Ma et al, 1991) zum Ausdruck zu erkennen. Kurz gesagt, wurden frei schwebenden Abschnitte mit PBS gespült und blockiert mit 10% normalem Esel-Serum (NDS) und 3% Rinderserumalbumin in 0,1 M PBS mit 0,3% Triton X-100 (PBS / Triton) für eine Stunde und dann in inkubiert Kaninchen-Anti-GFAP Antikörper (1:500; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in PBS / Triton mit 1% NDS für 12 Stunden bei 4 ° C. Die Schnitte wurden dann mit PBS gespült und mit Alexa Fluor ® 594 Esel-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) in PBS mit 5% NDS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Schnitte wurden nochmals gründlich mit PBS gespült und gegengefärbt mit NeuroTrace ® grün fluoreszierenden Nissl-Färbung (1:500 in PBS für 5 Minuten; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Nach einer abschließenden Spülung mit PBS wurden die Schnitte auf Gelatine beschichtete Objektträger aufgebracht und mit einem Deckglas mit Slow-Fade (Molecular Probes). Alle Aufnahmen wurden mit einem Zeiss Axioskop Mikroskop mit AxioVision Software (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).
Ergebnisse
In-vitro-Tests
Vor der Auswertung in Tieren wurden drei Mikroinjektion Systeme, indem sie ihre Fast Green gefüllten MOPs in in einem Fach (15 ml konischen Rohr) und platzieren ihre Mikrokanülen in eine zweite Kammer (1 ml Epp vorbereitet Endorf Rohr), die beide mit steriler Kochsalzlösung bei 37 ° C. Jedes System demonstriert kontinuierlichen Farbstoff über 12 Stunden der Beobachtung. Abbildung 4 zeigt in Abhängigkeit von einem typischen System über 3 Stunden.
Abbildung 4: In-vitro-Demonstration der Mikroinjektion System funktionieren. (A) Flow of Fast Green Farbstoff ist leicht zu sehen ungehindert aus dem Mikrokanüle zu Beginn einer In-vitro-Testphase. (B) Wie weiter fließt, wird das Reservoir Lösung gesättigt (B), und schließlich undurchsichtig mit Färbung (C).
Evaluation der in vivo Mikroinjektion System
Nach Perfusion wurden die entfernt Mikrokanülen und ihre Verbindungen sorgfältig geprüft, und alle erwiesen sich als völlig intakt. So kam es nicht zum Bruch der Borosilikatglas im Gewebe, noch gab es Mängel in der Anbindung von Systemkomponenten. A 10. L Kochsalzlösung gefüllte Hamilton-Spritze mit einer kurzen Länge der Silikonschlauch an seiner Nadel wurde benutzt, um sanfte Strömung der abgeschnittenen Ende der Polyethylen-Schlauch an der Mikrokanüle gelten. Alle zwölf der Mikrokanülen erlaubt kontinuierlichen Fluss und schien nicht behindert werden. Weiterhin wird nach jeder Entnahme MOP von den Tieren wurde das Volumen der verbleibenden Lösung gemessen und festgestellt, dass für die MOP ist Durchflussmenge (0,125 ul / h) und der Höhe der Zeit, bis Funktion erlaubt war angemessen.
In-vivo-Lieferung
Evaluation der koronalen Abschnitte des Gewebes mit Fast Green infundiert demonstriert wenig Variabilität in der Verteilung zwischen den Tieren innerhalb von Gruppen zu einem bestimmten Zeitpunkt (12 Stunden, 1 Tag, 2 Tage und 4 Tage). Abbildung 5 zeigt repräsentative Bereiche der Fast Green Diffusion zu diesen Zeitpunkten zeigt eine progressive Zunahme der Farbstoff Infiltration über vier Tage. Beachten Sie, dass vor Experimenten mit höheren Konzentrationen von Fast Green (zB 5 bis 15%) in schnellen Trübung des Parenchyms geführt, was zu Unklarheit genaue Auswertung der Mikroinjektion System die Funktion im Laufe der Zeit. Während das volle Ausmaß von 1% Farbstoffdiffusion kann schwierig sein, genau auf grobe Inspektion zu bestimmen, wurden Bereiche der Infiltration leicht erkennbar bei 2,5-facher, und sind mit gestrichelten Linien in Abbildung 5 dargestellt.
Abbildung 5: In vivo Demonstration der anhaltenden Mikroinjektion von Fast Green. (A) Zwölf Stunden nach intrastriatal Platzierung einer Fast Green-geladen Mikroinjektion System wird Farbstoff gesehen diffundiert in das Parenchym um die Mikrokanüle Website. Beobachtungen am 1 Tag (B), 2 Tage (C) und 4 Tage (D) zeigen weiterhin Lieferung von Fast Green-Lösung mit zunehmender Bereichen Farbstoff Infiltration. Die äußere Begrenzung der Diffusion wurde unter Low-Power-Mikroskopie beobachtet und wird hier mit gestrichelten Linien angedeutet. Scale-bar, 2 mm.
Evaluation von Trauma und reaktive Gliose
Gross Beobachtung von frisch geschnittenem, ungefärbte Gewebeschnitte zeigten, dass die Mikroinjektion System in einer Verringerung der lokalisierten Trauma an der Stelle der Lieferung geführt. Die Standard-Kanüle wurde immer gesehen zu stören und zu verdrängen, eine größere Fläche des Gewebes (Abb. 6B & C), die besser auf höhere Leistung mit H & E (Abb. 6D & E) geschätzt wird. Darüber hinaus wurde Blut häufig an den Standard Infusionsstelle (Abb. 6D) gesehen angesammelt, was auf einen höheren Grad des Kompromisses zu den Gefäßen und impliziert verringerte Integrität der Blut-Hirn-Schranke.
Die Mikroinjektion System führte auch zu stark reduzierten reaktiven Gliose als durch eine verminderte Immunreaktivität für GFAP in der Nähe der Infusion über einen Mikrokanüle (Abb. 6G) zeigt sich, wenn ein Standard-Kanüle (Abb. 6F) verglichen. Während Mikrokanüle-induzierte GFAP-Färbung über das normale Niveau (Abb. 6H) erhoben wurde, war die auffällige Eskalation in reaktive Gliose mit Standard-Kanüle Platzierung und Infusion (6F) nicht gesehen, wenn die Mikroinjektion System eingesetzt wurde.
Ivery Kanüle nach 5 Tagen Kochsalzlösungsinfusion. (A) A Mikrokanüle zog aus Borosilikatglas Rohr mit einer Spitze Durchmesser von 50. M erlaubt die freie, uneingeschränkte Fluss der meisten neuroaktiven Agenten, noch ist 6X kleiner als ein Standard-Lieferumfang Kanüle (28 ga, 0,30 mm). (B, C) gefärbtes, Nasspräparat der koronalen Abschnitte (Dicke, 70. M), welches eine größere örtliche Gewebeschäden (Pfeile), verursacht durch eine Standard-Kanüle (B), wenn ein Mikrokanüle (C) verglichen. (D, E) Höhere Leistung Mikrofotografien von H & E gefärbten Schnitte in B und C gezeigt. Die Standard-Kanüle verursacht weitergehende traumatischen Verletzungen wie in D, mit Vertriebenen eine größere Fläche von Gewebe und verursachen größere Beleidigung für die Gefäße durch die Ansammlung von Blut innerhalb der Läsion Hohlraum (Pfeil) gezeigt. Die Läsion durch die Mikrokanüle verursacht, ist jedoch wesentlich kleiner und weniger störend, um Gewebe am Ort der Infusion. (F, G, H) Immunfluoreszenz gegen GFAP zeigt drastisch Anzahl von GFAP + Astrozyten um die Läsion der Standard-Kanüle erhöht (F), wenn der des Mikrokanüle (G) und normal, unlesioned Striatum (H) verglichen. Maßstab: A & B, 1 mm; D - H, 250 m. "/>.
Abbildung 6: Lokalisierte Trauma durch einen Mikrokanüle verursacht eine Standard-Lieferumfang Kanüle nach 5 Tagen Kochsalzlösungsinfusion verglichen. (A) A Mikrokanüle aus Borosilikatglas Rohr mit einer Spitze Durchmesser von 50 um gezogen erlaubt die freie, uneingeschränkte Fluss der meisten neuroaktiven Agenten, noch ist 6X kleiner als ein Standard-Lieferumfang Kanüle (28 ga, 0,30 mm). (B, C) gefärbtes, Nasspräparat der koronalen Abschnitte (Dicke, 70 um), welches eine größere örtliche Gewebeschäden (Pfeile) mit einem Standard-Kanüle (B) im Vergleich zu einer Mikrokanüle (C) verursacht. (D, E) Höhere Leistung Mikrofotografien von H & E gefärbten Schnitte in B und C gezeigt. Die Standard-Kanüle verursacht weitergehende traumatischen Verletzungen wie in D, mit Vertriebenen eine größere Fläche von Gewebe und verursachen größere Beleidigung für die Gefäße durch die Ansammlung von Blut innerhalb der Läsion Hohlraum (Pfeil) gezeigt. Die Läsion durch die Mikrokanüle verursacht, ist jedoch wesentlich kleiner und weniger störend, um Gewebe am Ort der Infusion. (F, G, H) Immunfluoreszenz gegen GFAP zeigt drastisch Anzahl von GFAP + Astrozyten um die Läsion der Standard-Kanüle erhöht (F), wenn der des Mikrokanüle (G) und normal, unlesioned Striatum (H) verglichen. Maßstab: A & B, 1 mm; D - H, 250 pm.
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Discussion
Verschiedene Studien belegen, dass durch die Verringerung der Größe der Lieferung Kanüle für intrazerebrale Infusionen, Gewebetrauma und Beleidigung für die Blut-Hirn-Schranke reduziert werden (Perry et al., 1993), ist eine Entzündung verringert und die Immunantwort abgeschwächt (Finsen et al ., 1991) und reaktive Gliose ist vermindert (Nikkhah et al., 1994). Wir stellen hier ein Verfahren für die chronische Lieferung von neuroaktiven Agenten innerhalb des Gehirns über eine Mikrokanüle mit einem Durchmesser, 6-fach, um die von herkömmlich verwendeten Lieferung Kanülen im Vergleich reduziert wird. Wir haben gezeigt, dass dieses System liefert zuverlässig eine repräsentative Lösung im Laufe der Zeit und der Höhe der lokalisierten Trauma und reaktive Gliose ist drastisch reduziert. Diese Studien beschäftigten Zuführungskanüle mit einem letzten Tipp Durchmesser von 50 m, aber kleiner tip Durchmesser verwendet werden können. Der primäre Grund für solche Mikroinjektion Systeme ist ihre Fähigkeit, Agenten, um sehr kleine, diskrete Ziele zu erreichen, während anfallenden minimalen Trauma in der Nähe der Infusion.
Die Mikrokanülen in den Bau der Infusion System, das wir beschreiben können leicht custom-built mit vorgegebenen Längen und Durchmessern Spitze. Die Mikroinjektion System ist so konzipiert, um die Oberfläche des Tieres Schädel ermöglicht sicheren, Low-Profile-Fixierung und ausschließen, dass ein großer Schädel Sockel entsprechen. Die Operationswunde können daher leicht über dem stromlinienförmigen Mikroinjektion Sockel genäht werden, wodurch sowohl die Beschwerden des Tieres und das Risiko einer Infektion. Darüber hinaus sichern das System auf den Schädel erfordert weniger Schädel Fläche, daher zusätzliche oder nachfolgende Verfahren können ohne Einmischung von einer größeren Sockel durchgeführt werden.
Man sollte jedoch berücksichtigen, bestimmte technische Überlegungen nehmen beim Einsatz der Methodik beschrieben. Ein höheres Maß an Geschicklichkeit erforderlich ist, sowie die Herstellung und Implantation ist weniger Zeit-effizienter als es für Standard-Infusionssysteme werden. Auf der anderen Seite, kann dies ausgeglichen werden, oder zumindest ausgeglichen, durch die Zeit (und Tieren) durch Üben hochpräzise Technik verschont. Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, dass während der Mikrokanüle mit nahezu jedem Durchmesser angepasst werden können, ein Mikrokanüle mit einem sehr kleinen Lumen kann blockiert werden, entweder durch Komponenten der Infusionslösung oder Gewebe während der Implantation (zB Blut, Hirngewebe) auftreten. Dieses Risiko wird, indem die Mikrokanüle Spitze befeuchtet (zB mit einem Wasser-oder Salzlösung gesättigt Wattestäbchen, um zu verhindern Trocknung der Infusionslösung Solute) während der Implantation und indem saubere, "Blut-free" Operation reduziert.
Wir empfehlen, dass der Forscher Schaffung eines Mikrokanüle Spitzendurchmesser, dass die für das jeweilige Zusammensetzung und / oder Viskosität der Lösung, die in die MOP geladen werden wird. Dies ist leicht mit Hilfe eines in vitro-Testsystem, ähnlich dem im Protokoll (Abb. 4) beschrieben ist, oder durch einfaches Eintauchen der versammelten System in einem 37 ° C Solebad und Überwachung der Badzusammensetzung und / oder die Messung des Volumens der MOP Inhalte im Laufe der Zeit. Ein Nachteil ist, dass die Mikrokanüle relativ zerbrechlich ist, insbesondere dann, wenn seine Spitze Durchmesser sehr klein (zB ~ 10-50 Mikrometer) ist. Versehentlich brechen Mikrokanüle während der Operation in der Regel voraus, dass das gesamte System ersetzt werden, da die Reparatur oder den Wiederaufbau, die Einheit würde Operationszeit erheblich zu erweitern. Wissenschaftler Fachmann auf solche Techniken und die Praxis anspruchsvolle Methode nur selten erleben Bruch jedoch.
Am Ende des Experiments kann die Mikroinjektion System überprüft, um sicherzustellen, dass die Mikrokanüle nicht beschädigt wurde und dass es geblieben Patent werden. Das Volumen des mini-osmotischen Pumpe kann auch gemessen werden, um sicherzustellen, dass die entsprechende Menge an neuroaktiven Agent wurde geliefert werden, wir empfehlen nicht das Recycling oder die Wiederverwendung der Pumpen, aber. Während die vorliegende Verfahren bei erwachsenen Ratten gezeigt wurden, von einem System, das Trauma verringert und benötigt weniger Schädel Fläche für die Fixierung als vielleicht besser werden im Vergleich zu herkömmlichen Methoden für Versuche mit kleineren Tieren wie Mäusen oder jungen Ratten verwenden.
Obwohl das vorliegende Verfahren erfordert eine etwas fortgeschrittenes Niveau und Können durch den Experimentator, bietet es auf Präzision vielleicht Anstieg um eine Größenordnung, und experimentelle verwechselt mit dem Trauma in die Region von Interesse zu minimieren. In unserem Labor haben wir festgestellt, dass dies übersetzt in mehr zuverlässige und robuste Effekte der experimentellen Intervention.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
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Neuroscience Ausgabe 13 Mini-osmotischen Pumpe chronische Infusion Mikrokanüle schnell grünErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
