ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Als neurowetenschappen onderzoek wordt meer geavanceerde, het onderzoek van de hersenen structuren en circuits vereist verbeterde niveaus van nauwkeurigheid en hogere resolutie. We hebben een methode ontwikkeld voor de voorbereiding en de implantatie van een chronische infusie-systeem in de hersenen met behulp van een borosilicate microcannula met een tip diameter van 50 micron.
Abstract
Experimentele protocollen die worden gebruikt voor chronische infusie van neuroactive agenten in de regio's van de hersenen vaak gebruik van een mini-osmotische pomp systeem. Agenten worden meestal geleverd via een roestvrij stalen canule met een diameter van 0,30 mm of meer. Systemen gebruik te maken van een canule van dit kaliber kunnen opleggen trauma aan het gebied van interesse resulteert in architectonische schade, waardoor afbreuk te doen aan de structurele integriteit en de normale werking. Als neurowetenschappen onderzoek wordt meer geavanceerde, het onderzoek van de hersenen structuren en circuits vereist verbeterde niveaus van nauwkeurigheid en hogere resolutie. We hebben een methode ontwikkeld voor de voorbereiding en de implantatie van een chronische infusie-systeem in de hersenen met behulp van een borosilicate microcannula met een tip diameter van 50 micron. Deze techniek vermindert de schade aan de omgeving en vermindert reactief gliosis op de plaats van infusie. De configuratie van Het micro-systeem is ook in staat om te voldoen aan de oppervlakte van de schedel van het dier, zich verzet tegen de noodzaak voor grote craniale sokkels, waardoor het gemakkelijker de sluiting van de hoofdhuid incisie en het verminderen van het risico van infectie. We zien een betrouwbare duurzame levering van een kleurstof met een vertegenwoordiger van moleculair gewicht met behulp van een in vitro model en in vivo studies bij ratten.
Protocol
Introductie
Directe infusie van neuroactive agenten kunnen specifieke hersengebieden te bestuderen, terwijl het omzeilen van de bloed-hersen barrière. De toepassingen van deze benadering in de neurowetenschappen zijn divers en omvatten het veranderen van de mate van hersenactiviteit in discrete subregio's (Berretta et al., 2004;. Gliddon et al., 2005;.. Kim et al., 2000), onderzoek naar het handelen van psychotrope stoffen ( clinton et al., 2006;.. Di Benedetto et al., 2004), een gecontroleerde modellen van ontsteking van de hersenen (Hauss-Wegrzyniak et al., 1998;. Marchalant et al., 2007;.. Rosi et al., 2004), het bestuderen van de mechanismen van verslaving (Kim et al., 2005;. Lockman et al., 2005;. Zhang et al., 2006.), en het mogelijk maken op lange termijn toediening van trofische factoren (Naert et al., 2006;.. Radecki et al., 2005; Takahashi et al., 2006)..
Standaard methoden voor chronische levering van agenten vaak gebruik van een mini-osmotische pomp (bijv. Alzet Osmotische Pompen, Cupertino, CA), geladen met een neuroactive agent, die is in de hersenen geleverd via een roestvrij stalen canule met een diameter die kan variëren van 0,25 mm (Williams et al., 1987.) tot 0,5 mm, maar meestal is ongeveer 0,3 mm (Plastics One, Roanoke, VA, zie figuur 6A). Terwijl de levering canules van deze omvang kan worden geschikt voor vele toepassingen waarbij een hoge mate van nauwkeurigheid niet vereist zijn en trauma aan de micro-omgeving is niet een groot probleem, zijn deze canules zijn suboptimaal voor het leveren van agenten om kleine, gevoelige sites waarin de canule is vergelijkbaar in grootte (of groter dan) de beoogde structuur zelf, of waar de functie mag niet worden aangetast door traumatische belediging.
Hier wordt gepresenteerd is een werkwijze voor de bereiding en de implantatie van een chronische infuus systeem voor de levering van neuroactive agenten in de hersenen met behulp van een "microcannula" met een veel lagere tip diameter. Deze techniek maakt het mogelijk kleine substructuren worden gericht en vermindert trauma aan de van de ruimte van belang. De huidige procedure is dan ook onderwezen als een alternatief voor de conventionele methoden voor onderzoekers die willen verstoring te minimaliseren naar de hersenen regio in onderzoek.
Materialen en methoden
Dieren en het ontwerp
Achttien volwassene (400-450 g) mannelijke Sprague-Dawley ratten werden gebruikt om de procedure aan te tonen en de functie van de huidige werkwijze te testen. Twaalf dieren werden geïmplanteerd microinfusion systemen en heeft bijgedragen aan een tijdsverloop evaluatie van aanhoudende functie over 4 dagen. Zes dieren werden gebruikt voor het niveau van trauma en reactieve gliosis 5 dagen na implantatie van een standaard 28 ga levering canule (N = 3) of een microcannula (N = 3) te vergelijken bevestigd aan een zoutoplossing gevulde mini-osmotische pomp. De dieren werden ondergebracht in doorzichtige plastic kooien, en onderhouden van een 12-uurs licht / donker schema, met voedsel en water ad libitum verstrekt. Alle procedures werden goedgekeurd door de McLean Hospital Institutional Animal Care en gebruik Comite, in overeenstemming met de toepasselijke federale en lokale richtlijnen voor experimenteel gebruik van dieren.
Microinfusion systeem montage
Figuur 1 geeft de onderdelen en de montage van Het micro-systeem. Wij raden de aanleg en het implanteren van het systeem met behulp van steriele techniek. Daarnaast, om de introductie van lucht te voorkomen in het systeem, wordt het gemonteerd, terwijl ondergedompeld in een zoutoplossing bad. Voor de huidige tests, werden mini-osmotische pompen (MOP) in dienst (Alzet, model # 1002, Cupertino, CA) met een duur van 14 dagen, stroomsnelheid van 0,25 pL / uur, en een vulling capaciteit van 98,6 pi. Echter, omdat hoge debieten kunnen stortvloed kleinere gebieden van belang in de hersenen en veroorzaken structurele schade, het debiet voor deze studies was verminderd tot 0.125 pl / uur door het bekleden van een helft van het MOP met paraffine de instructies van de fabrikant. Voor de evaluatie van de lokale trauma, werden de MOP gevuld met een steriele zoutoplossing. Voor de beoordeling van duurzame functie van de microinfusion systemen, snel groen (1% in zoutoplossing, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) werd gekozen als een test-oplossing vanwege de lage toxiciteit, het vermogen om diffuse binnen levensvatbaar hersenweefsel, en omdat het heeft een moleculair gewicht (808,84) aan de bovenkant van de range voor de "kleine moleculen" (<1000) die vaak van belang zijn voor chronische infusie (bijvoorbeeld muscimol, picrotoxin, fluoxetine, etc.).
Figuur 1: AssemBly van Het micro-systeem. (A) De componenten van het systeem geplaatst in hun relatieve posities voor de montage. Let op de flens van de stroom modulater slang is weg geweest gebroken. Wij raden de uitlijning draad worden vastgezet vlak voor implantatie (zie tekst). (B) gemonteerd microinfusion systeem voorafgaand aan de bevestiging van de aanpassing draad en implantatie.
Microcannula voorbereiding
De microcannula kan worden gevormd met behulp van een standaard horizontale of verticale elektrode trekker (Stoelting Co, Wood Dale, IL) met instellingen voor het produceren van een glazen elektrode met een lange, licht taps toelopend schacht (fig. 2A). Borosilicaat buis is geschikt voor dit doel (deel 1B100F-6, 1,0 mm, 6 in; Wereld precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL), zoals zij heeft een relatief laag smeltpunt, waardoor de daaropvolgende buigen met gerichte warmte. Het distale meest gedeelte van een rechte microcannula kan worden gesneden met een dissectie schaar of een gecontroleerde breuk kan worden gemaakt met microforceps (World precisie-instrumenten, Inc, Sarasota, FL) om de gewenste laatste tip diameter (50 um te geven voor de huidige demonstraties ), en een microscoop objectmicrometer is nuttig te begeleiden en te bevestigen dat de gewenste diameter. De cut tip kan kort worden verwarmd, of "brand-gepolijst", op ruwe of scherpe randen te verwijderen. De verwarming spoel van de elektrode trekker of een bunsenbrander wordt vervolgens gebruikt om een rechte hoek op de microcannula te leggen op een vooraf bepaalde afstand van de punt van de microcannula (Fig 2B) door het plaatsen van de borosilicaat buis binnen de verwarmingsspiraal (of een Bunsen vlam ) en het toepassen van zachte kracht zijn op het distale deel met een tang als de slang wordt verwarmd. De vooraf bepaalde lengte van de microcannula distaal van de opgelegde rechte hoek is besloten op basis van de diepte van de hersenen regio worden gericht (bijv. 5 mm) en rekening houdend met de schedel dikte (~ 1 mm) en het werken op afstand boven de schedel ( bijvoorbeeld, 1-2 mm). Dus de vooraf bepaalde afstand van de punt van de microcannula van de opgelegde rechte hoek van de huidige demonstraties was 7-8 mm. Een diamant potlood wordt vervolgens gebruikt om de borosilicaat buis van ongeveer 8 mm proximaal van de rechte hoek te snijden.
Figuur 2: Bereiding van microcannula. (A) Een elektrode trekker (Stoelting Co Wood Dale, IL) wordt gebruikt om een microcannula met een lange, spits toelopende schacht te produceren. (B) De naverwarmer kan worden geheroriënteerd voor gebruiksgemak, en de microcannula wordt geplaatst binnen de spoel, waardoor een haakse bocht te worden gevormd met behulp van een tang als de glazen buizen wordt verwarmd.
Nadat het gewenste aantal microcannulas is gemaakt, raden wij u steriliseren met ethyleenoxide of met behulp van een autoclaaf. De distale meest 1-2 mm van de microcannula kan gekleurd worden met een steriele chirurgische marker (of permanente inkt vóór sterilisatie), zodat de microcannula tip om makkelijk kunnen worden gevisualiseerd tijdens de chirurgische ingreep.
MOP voorbereiding
MOP werden bereid volgens instructies van de fabrikant. In het kort, is de plastic flens van de RVS buis MOP ("flow modulator") eerst verwijderd met behulp van schaar of rongeurs. Een lengte van polyethyleen buis (plastic One, Roanoke, VA, # C312 VT, OD, 1,22 mm; ID: 0,72 mm) is aangesloten op het gebied van roestvast stalen buizen die eerder bezet door de flens (~ 4 mm) door het invoegen van de roestvast stalen buizen in het lumen van de polyethyleen buis en het veiligstellen van met een aangepaste lijm rond de buitenste omtrek van de verbinding. LumaBond (myNeuroLab, Inc, St. Louis, MO) is met name handig als het geneest binnen enkele seconden bij blootstelling aan gericht licht (bijvoorbeeld van een glasvezel lamp). De lengte van de buis moet ongeveer de afstand tussen de onderkant van de schedel van het dier en de rostrale meest aspect van de scapulae (bijvoorbeeld, ongeveer 1,5-3,0 cm voor laboratorium-ratten). De pomp is gevuld volgens de instructies, en de roestvrij stalen Alzet buis, met de lengte van polyethyleen buis aan het einde, wordt ingevoegd in de gevulde pomp. Een klein volume van de oplossing van de pomp gedwongen zal worden om de buitenkant van de pomp-buis-interface (en moet weg gedept) en ook in het proximale gebied van de polyethyleen buis. De gevulde pomp met slang aangesloten wordt dan geïncubeerd in steriele zoutoplossing gedurende 12 uur bij 37 ° C. Als de pomp goed functioneert, na deze incubatieperiode, zal vloeistof worden gezien hebben gereisd een paar millimeter binnen de polyethyleen buis.
Construeren ion van microinfusion systeem
De pomp met haar verbonden slang is ondergedompeld in een 10 cm petrischaal met steriele zoutoplossing, en de resterende lucht in de polyethyleen slang is verwijderd met behulp van een injectiespuit gevuld met dezelfde oplossing in de pomp en die is uitgerust met een kleine diameter buis die kunnen worden ingevoegd in het polyethyleen buis. Oplossing kan dus worden geïnjecteerd in de polyethyleen slang aan de lucht te vervangen. Ook de microcannula ondergedompeld in de zoute bad en de lucht wordt verwijderd door het injecteren met de oplossing. Dit is gemakkelijk bereikt met een tweede oplossing spuit uitgerust met flexibele (bijv. siliconen) slang die past op de grote (proximale) uiteinde van de microcannula.
Het proximale uiteinde van borosilicaat buis wordt vervolgens ingebracht in de polyethyleen buis. Merk op dat dit kan verwijding van de polyethyleen buis nodig door stevig te drukken op de gesloten uiteinden van microforceps in het lumen waardoor affakkelen de opening voor het eenvoudig inbrengen van de borosilicaat buis. De lucht-infusie-systeem wordt vervolgens verwijderd uit het zoute bad en geplaatst op een steriel oppervlak en voorzichtig gedroogd met een gaasje of een wattenstaafje. De microcannula-polyethyleen buis verbinding is beveiligd met een omtrek laag lijm (bijv. LumaBond).
Als het systeem goed is gemonteerd, en als het MOP blijft functioneren zoals het zou moeten, tijdens de laatste stap van deze procedure een druppel van de oplossing zal verschijnen meestal aan het uiteinde van de microcannula als de osmotische mechanisme binnen de pomp blijft tijdens de bereiding. MOP debiet kan proportioneel worden verminderd door het bekleden van het oppervlak op juiste gebied met paraffine de instructies van de fabrikant. Voor het huidige demonstraties, was 50% van elke MOP gecoat door kort dunking het in gesmolten paraffine en waardoor het afkoelen, waardoor het debiet met de helft tot 0.125 pi / uur. Het ingevulde microinfusion systeem wordt vervolgens ondergedompeld in steriele zoutoplossing en bewaard bij 37 ° C tot implantatie.
Implantatie van microinfusion systeem
Het micro-systeem is geïmplanteerd met behulp van standaard stereotaxische methoden zoals eerder beschreven (Cooley, 1990). Na de bereiding van de chirurgische veld, is een braam gat geboord voor de binnenkomst van de microcannula. Indien gewenst kan de schedel schroeven ook worden geplaatst om de hechting verbinding die gebruikt wordt om de microcannula veilig te stabiliseren. De verbinding die in dit laboratorium (Geribond, Den-Mat Inc, Santa Maria, CA) vereist geen extra verankering, maar de schedel ondergrond moet worden voorbereid door reiniging met een acetonedampened wattenstaafje. Een 1-2 mm diameter "haak" is gemaakt aan het distale uiteinde van de uitlijning draad (zie figuur 1.), Zodat deze de bocht omcirkelen in de borosilicaat buis. Het is dan beveiligd (met behulp van LumaBond), in een richting langs dezelfde as als het distale gedeelte van de microcannula (dat moet worden gevorderd in de hersenen, zie Fig. 3B). Het infuus systeem wordt dan gemonteerd op de stereotaxische drager (afb. 3), klemmen de uitlijning draad op de houder. Steriel hechtdraad en wordt gebruikt om de ketting infusiepomp naar de top van de stereotaxische manipulator, dus te schorten en het voorkomen van het verlies van oriëntatie tijdens de procedure te wijten aan het gewicht (en het koppel) van de pomp (Fig. 3B). De microcannula kan vervolgens worden geplaatst in de gewenste richting (bijv. precies verticaal) met behulp van een tang om voorzichtig buigen de uitlijning draad distaal van de vervoerder klem. De microcannula tip is gepositioneerd boven een referentiepunt (bijv. bregma of lambda) en vervolgens gemanoeuvreerd tot het punt van binnenkomst in de hersenen. De coördinaten worden gebruikt voor de dieren in deze experimenten waren: Bregma +0.2 mm, zijdelings 3,2 mm, en ventrale 5,0 mm onder dura met het hoofd van het dier in een schedel-vlakke positie.
Nadat de microcannula is gevorderd om de juiste diepte in de hersenen, is het systeem vast in positie, met een voetstuk verbinding (bijv. Geribond). De sokkel kan dicht bij de oppervlakte van de schedel om de wondsluiting te bevorderen worden gebeeldhouwd. Na het voetstuk verbinding is uitgehard (~ 2 min), is de uitlijning draad gesneden gelijk met de sokkel met behulp van de boor van de slijpschijf. Een kleine hoeveelheid van de verbinding kan worden gebruikt ter dekking en glad de resterende weerhaak van de doorgesneden draad. Het MOP is dan subcutaan ingebracht, gepositioneerd tussen de scapulae van het dier. Ten slotte wordt de wond lavaged met een steriele zoutoplossing, en de incisie gesloten met hechtdraad of wond clips (afb. 3, panel D).
croinfusion systeem is gepositioneerd voor plaatsing en bevestiging in een dier. (D) Het ontwerp van Het micro-systeem maakt een eenvoudige sluiting van de incisie over een low-profile voetstuk, waardoor de kans op besmetting en het minimaliseren van ongemak voor het dier. "Width =" 511 "height =" 381 "/>
Figuur 3: Implantatie van microinfusion systeem. (A) Plaatsing van microinfusion systeem op stereotaxische instrument. (B) De MOP is vastgemaakt met behulp van steriele hechtdraad om het gewicht te voorkomen dat het verstoren van de oriëntatie van de microcannula. De microcannula is gepositioneerd voor een nauwkeurige verticale toegang tot de hersenen met behulp van de uitlijning draad. (C) Een microinfusion systeem is gepositioneerd voor plaatsing en bevestiging in een dier. (D) Het ontwerp van Het micro-systeem maakt een eenvoudige sluiting van de incisie over een low-profile voetstuk, waardoor de kans op besmetting en het minimaliseren van ongemak voor het dier.
De voorbereiding en de implantatie van standaard infuus systeem
De procedure voor de voorbereiding van het standaard infuussysteem is identiek aan dat voor Het micro-systeem, behalve de microcannula wordt vervangen door een 'osmotische pomp aansluiting canule "met een diameter van 300 micrometer (28 GA, Kunststoffen One, Roanoke, VA, # 3300PM / SPC, zie figuur 5a). Implantatie van het standaard systeem is ook identiek aan die van Het micro-systeem, inclusief de bevestiging van een alignment draad om precies verticale positionering van de canule van de toe te laten in de hersenen.
Histologie en Analyse
Om Het micro-systeem in staat is om duurzame levering van snel groen te bieden te onderzoeken, werden groepen van drie dieren opgeofferd om 12 uur, 1 dag, 2 dagen en 4 dagen na de operatie. Onderwerpen waren diep verdoofd met natriumpentobarbital (120 mg / kg, ip) en transcardially geperfuseerd met 200 ml van 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door 400 ml van 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaat buffer. Perfusie-oplossingen werden bewaard bij 4 ° C, met een pH van 7,4 en geperfuseerd met een snelheid van 50 ml per minuut met behulp van een peristaltische pomp. Om de canules te verwijderen zonder beschadiging van de post-mortem weefsel, de perfusie dier werd vastgesteld in een stereotaxisch frame, was de sokkel bevestigd met lijm een stijve draad aan de manipulator arm klem, en de schedel werd zorgvuldig verwijderd uit de hele sokkel met behulp van een tandheelkundige braam. Het voetstuk en de onderliggende canule waren daarbij verwijderd, samen hetzelfde traject in waarin de canule was gevorderd voor plaatsing. Hersenen werden vervolgens uit de Calvaria en ondergedompeld gedurende 12 uur in dezelfde fixeermiddel.
Voor de beoordeling van duurzame infusie van Fast Green, secties met een dikte van 200 urn werden gesneden met behulp van een Vibratome (myNeuroLab, St. Louis, MO) en nat gemonteerd op glasplaatjes. Representatief secties werden afgebeeld met een Canon CanoScan LiDE 600F scanner. Voor de evaluatie van de lokale trauma en reactieve gliosis, 70μm Vibratome secties werden voor het eerst nat gemonteerd en gefotografeerd onbesmet aan het weefsel vervorming die kan optreden met histologische processen, zoals drogen, vlekken, en uitdroging te voorkomen. Deze zelfde secties werden daarna laten drogen op hun gelatine-gecoat glas dia's, en ze werden gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E), gedehydrateerd met getrapte alcoholen, en de cover-gleed met Permount.
Aangrenzende 70 micrometer secties onderging een standaard procedure om immunofluorescentie gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP), die door astrocyten tijdens het proces van reactieve gliosis uitgedrukt in reactie op de trauma (Ding et al., 2000.., Ma et al., 1991) te detecteren. In het kort werden vrij zwevende delen gespoeld met PBS en geblokkeerd met 10% normaal ezel serum (NDS) en 3% bovine serum albumine in 0,1 M PBS met 0,3% Triton X-100 (PBS / Triton) gedurende een uur en daarna geïncubeerd in konijn anti-GFAP antilichaam (1:500; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) in PBS / Triton met 1% NDS gedurende 12 uur bij 4 ° C. Secties werden vervolgens gespoeld met PBS en geïncubeerd met Alexa Fluor ® 594 donkey-antirabbit secundair antilichaam (1:500, Molecular Probes, Inc, Eugene, OR) in PBS met 5% NDS gedurende een uur bij kamertemperatuur. De secties werden grondig opnieuw gespoeld met PBS en tegengekleurd met NeuroTrace ® groen fluorescerend Nissl vlek (1:500 in PBS gedurende 5 minuten, Molecular Probes, Inc, Eugene, OR). Na een laatste spoelen met PBS, werden delen gemonteerd op gelatine gecoate dia's en afgedekt met Slow-Fade (Molecular Probes). Alle microfoto's werden verworven met behulp van een Zeiss Axioskop microscoop met AxioVision software (Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY).
Resultaten
In vitro testen
Voorafgaand aan de evaluatie bij dieren werden drie microinfusion systemen voorbereid door het plaatsen van hun snel groen gevulde MOP tot in een compartiment (15 ml conische buis) en het plaatsen van hun microcannulas in een tweede compartiment (1 ml Epp Endorf tube), beide met steriele zoutoplossing bij 37 ° C. Elk systeem aangetoond continue stroom van kleurstof meer dan 12 uur van de waarneming. Figuur 4 illustreert de functie van een typisch systeem meer dan 3 uur.
Figuur 4: In vitro demonstratie van microinfusion systeem functie. (A) Flow van Fast Green kleurstof wordt gemakkelijk gezien ongehinderd vanaf de microcannula aan het begin van een in vitro test periode. (B) De stroom gaat verder, het reservoir oplossing verzadigd raakt (B), en uiteindelijk dekkend is met kleur (C).
Evaluatie van de in vivo microinfusion systeem
Na perfusie, werden de verwijderde microcannulas en hun verbindingen zorgvuldig gecontroleerd, en alle bleken te zijn helemaal intact. Zo vond er geen breuk van de borosilicaatglas in weefsel, noch waren er gebreken in de aansluitingen van systeemcomponenten. A 10. L zoutoplossing gevulde Hamilton spuit met een korte lengte van silicium slang aangesloten op de naald werd gebruikt om de zachte stromen van toepassing zijn op het afgesneden uiteinde van het polyethyleen buis aan de microcannula. Alle twaalf van de microcannulas toegestane continuïteit en bleek niet te zijn belemmerd. Bovendien, na het verwijderen van elke MOP vanaf de dieren, werd het volume van de resterende oplossing gemeten en geschikt zijn voor doorstroming het MOP-tarief van (0,125 pL / uur) en de hoeveelheid tijd die het werd toegestaan om te functioneren.
In vivo aflevering
Evaluatie van de coronale secties van weefsel doordrenkt met Fast Green aangetoond weinig variatie in de verdeling tussen dieren binnen groepen op een bepaald tijdstip (12 uur, 1 dag, 2 dagen en 4 dagen). Figuur 5 illustreert representatieve gebieden van Fast Green diffusie op deze tijdstippen met een progressieve stijging van de kleurstof infiltratie over vier dagen. Merk op dat eerdere experimenten met hogere concentraties van Fast Green (bijv. 5 - 15%) resulteerde in een snelle vertroebeling van de parenchym, zo verduistert nauwkeurige evaluatie van de functie Het micro systeem in de tijd. Terwijl de volle omvang van 1% kleurstofdiffusie kan moeilijk zijn om nauwkeurig te bepalen over de bruto-inspectie, de gebieden van infiltratie waren gemakkelijk te onderscheiden op 2,5 maal vergroting, en worden aangeduid met stippellijnen in figuur 5.
Figuur 5: In vivo Demonstratie van duurzame microinfusion van Fast Green. (A) Twaalf uur na intrastriatal plaatsing van een snel groen-loaded microinfusion systeem wordt gezien kleurstof verspreiden in het parenchym rond de microcannula site. Waarnemingen op een dag (B), 2 dagen (C), en 4 dagen (D) geven voortdurende levering van Fast 'groene oplossing' met toenemende gebieden van de kleurstof infiltratie. De buitenste grens van diffusie werd waargenomen onder low-power microscopie en wordt hier aangeduid met stippellijnen. Schaal bar, 2 mm.
Evaluatie van trauma en reactieve gliosis
Bruto observatie van vers gemaaid, onbesmet weefselcoupes bleek dat Het micro-systeem heeft geleid tot een vermindering van de gelokaliseerde trauma op de plaats van levering. De standaard canule werd altijd gezien te verstoren en een groter gebied van weefsel (Fig. 6B & C), die beter gewaardeerd wordt bij een hogere macht met H & E (Fig. 6D & E) verdringen. Bovendien werd het bloed vaak gezien opgebouwd op de standaard-infusie (Fig. 6D), hetgeen duidt op een grotere mate van compromis aan het vaatstelsel en impliceren verminderde integriteit van de bloed-hersen barrière.
Het micro-systeem heeft ook geleid tot sterk verminderde reactieve gliosis zoals wordt aangetoond door verminderde immunoreactiviteit voor GFAP in de omgeving van infusie via een microcannula (Fig. 6G) in vergelijking met een standaard canule (Fig. 6F). Terwijl microcannula-geïnduceerde GFAP kleuring werd verheven boven de normale niveaus (Fig. 6H), was de opvallende escalatie in reactieve gliosis met standaard canule plaatsing en infusie (6F) niet gezien als Het micro systeem werd toegepast.
Ivery canule na 5 dagen van zout infuus. (A) Een microcannula getrokken uit borosilicaat buis met een tip diameter van 50. M kunt u gratis, onbeperkte stroom van de meeste neuroactive agenten, maar toch is 6X kleiner dan een standaard levering canule (28 GA, 0,30 mm). (B, C) onbesmet, natte bergen van coronale secties (dikte, 70. M) illustreert een grotere lokale weefselbeschadiging (pijlen) wordt veroorzaakt door een standaard canule (B) in vergelijking met een microcannula (C). (D, E) Hogere kracht microfoto's van H & E gekleurde coupes getoond in B en C, respectievelijk. De standaard canule veroorzaakt meer uitgebreide traumatisch letsel zoals geïllustreerd in D, met ontheemden een groter gebied van weefsel en het veroorzaken van een grotere belediging voor het vaatstelsel, zoals blijkt uit de inzameling van bloed binnen de laesie holte (pijl). Het letsel veroorzaakt door de microcannula, is echter aanzienlijk kleiner en minder storend aan het weefsel op de plaats van infusie. (F, G, H) Immunofluorescentie tegen GFAP toont dramatisch toegenomen aantallen GFAP + astrocyten rond het letsel van de standaard canule (F) in vergelijking met die van de microcannula (G) en normale, unlesioned striatum (H). Schaal bars: A & B, 1 mm; D - H, 250 m. "/>.
Figuur 6: Gelokaliseerde trauma veroorzaakt door een microcannula ten opzichte van een standaard levering canule na 5 dagen van zout infuus. (A) Een microcannula getrokken uit borosilicaat buis met een tip diameter van 50 urn kunt u gratis, onbeperkte stroom van de meeste neuroactive agenten, maar toch is 6X kleiner dan een standaard levering canule (28 GA, 0,30 mm). (B, C) onbesmet, natte bergen van coronale secties (dikte, 70 pm) ter illustratie van een grotere lokale weefselbeschadiging (pijlen) wordt veroorzaakt door een standaard canule (B) in vergelijking met een microcannula (C). (D, E) Hogere kracht microfoto's van H & E gekleurde coupes getoond in B en C, respectievelijk. De standaard canule veroorzaakt meer uitgebreide traumatisch letsel zoals geïllustreerd in D, met ontheemden een groter gebied van weefsel en het veroorzaken van een grotere belediging voor het vaatstelsel, zoals blijkt uit de inzameling van bloed binnen de laesie holte (pijl). Het letsel veroorzaakt door de microcannula, is echter aanzienlijk kleiner en minder storend aan het weefsel op de plaats van infusie. (F, G, H) Immunofluorescentie tegen GFAP toont dramatisch toegenomen aantallen GFAP + astrocyten rond het letsel van de standaard canule (F) in vergelijking met die van de microcannula (G) en normale, unlesioned striatum (H). Schaal bars: A & B, 1 mm; D - H, 250 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende studies hebben aangetoond dat door het verminderen van de grootte van de levering canule voor intracerebrale infusies, weefsel trauma en belediging van de bloed-hersen barrière wordt verminderd (Perry et al.., 1993), is een ontsteking verminderd en het immuun-respons verzwakte (Finsen et al. ., 1991), en reactieve gliosis is verminderd (Nikkhah et al., 1994).. We presenteren hier een methode voor de chronische levering van neuroactive agenten in de hersenen via een microcannula met een diameter die is verminderd met een factor 6 in vergelijking met die van conventioneel gebruikte levering canules. We hebben aangetoond dat dit systeem reliably een representatieve oplossing in de tijd en het niveau van de gelokaliseerde trauma en reactieve gliosis is drastisch verminderd levert. Deze studies dienst een levering canule met een laatste tip diameter van 50 m, maar kleiner tip diameters kunnen worden gebruikt. Het primaire deugd van dergelijke microinfusion systemen is hun vermogen om agenten te leveren aan zeer kleine, discrete doelstellingen, terwijl aangaan van een minimale trauma in de nabijheid van de infusie.
De microcannulas gebruikt bij de bouw van het infuus systeem beschrijven we kunnen gemakkelijk op maat gebouwd met vooraf bepaalde lengtes en diameters tip. Het micro systeem is ontworpen om te voldoen aan de oppervlakte van de schedel van het dier waardoor veilige, low-profile fixatie en zich verzet tegen de noodzaak van een grote schedel voetstuk. De operatiewond kan daarom gemakkelijk worden gehecht over de gestroomlijnde microinfusion voetstuk, waardoor zowel het ongemak voor het dier en het risico van infectie. Daarnaast, het veiligstellen van de systeem om de schedel vereist minder schedel oppervlakte, daarom aanvullende of latere procedures kunnen worden uitgevoerd zonder tussenkomst van een groter voetstuk.
Men moet echter rekening houden met bepaalde technische overwegingen bij gebruik van de methodiek hier beschreven. Een hoger niveau van vaardigheid is vereist, en de productie en de implantatie procedure is minder tijd-efficiënt zijn dan kan het voor standaard infuus-systemen. Aan de andere kant, kan dit worden gecompenseerd, of op zijn minst gecompenseerd, door de tijd (en dieren) gespaard door het beoefenen van hoge precisie techniek. Een andere moeilijkheid is dat, terwijl de microcannula kan worden aangepast met vrijwel iedere diameter, een microcannula met een zeer klein lumen kan worden belemmerd, hetzij door onderdelen van de infusaat of door het weefsel aangetroffen tijdens de implantatie (bv. bloed, hersenweefsel). Dit risico wordt verminderd door het houden van de microcannula tip vochtige (bijvoorbeeld met behulp van een water-of zoutoplossing verzadigde wattenstaafje om uitdroging te voorkomen van infusaat opgeloste stoffen) tijdens de implantatie procedure en door het uitvoeren van schoon "bloed-vrij" chirurgie.
Wij raden aan dat de onderzoeker stelt een microcannula tip diameter die geschikt is voor de bijzondere samenstelling en / of viscositeit van de oplossing die zal worden geladen in het MOP. Dit is eenvoudig te bereiken met behulp van een in vitro test systeem vergelijkbaar is met die beschreven in het protocol (afb. 4), of door simpelweg onder te dompelen het gemonteerde systeem in een 37 ° C zout bad en het toezicht op de bad samenstelling en / of het meten van het volume van het MOP inhoud na verloop van tijd. Een nadeel is dat de microcannula is relatief kwetsbaar, vooral als de tip diameter is zeer klein (bijvoorbeeld ~ 10 tot 50 micron). Per ongeluk breken van de microcannula tijdens de operatie meestal vereist dat het gehele systeem vervangen worden, zoals reparatie of wederopbouw van die eenheid zou een operatie tijd aanzienlijk uit te breiden. Wetenschappers vaardig in deze technieken en die de praktijk veeleisende methode zelden ervaring breuk, echter.
Aan het einde van het experiment, kan Het micro-systeem worden geïnspecteerd om te verzekeren dat de microcannula niet is beschadigd en dat het is gebleven octrooi. Het volume van de mini-osmotische pomp kan ook worden gemeten om ervoor te zorgen dat de juiste hoeveelheid van neuroactive agent heeft geleverd, dat wij niet aanbevelen recyclage of hergebruik van de pompen, echter. Terwijl de huidige methoden werden aangetoond bij volwassen ratten, het gebruik van een systeem dat trauma vermindert en vereist minder schedel oppervlakte voor de fixatie kan het zelfs beter beschouwd ten opzichte van conventionele methoden voor experimenten met kleinere dieren, zoals muizen of jonge ratten.
Hoewel de huidige methode vereist een iets hoger niveau van bekwaamheid en vaardigheden door de experimentator, die het biedt aan eventueel te verhogen precisie door een orde van grootte, en om experimentele verwart geassocieerd met trauma aan de regio van belang te minimaliseren. In ons laboratorium hebben we gevonden dat dit zich vertaalt in meer betrouwbare en robuuste effecten van de experimentele interventie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
Tags
Neurowetenschappen nummer 13 mini-osmotische pomp chronische infusie microcannula snel groenErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
