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Summary
Comme neurosciences enquête devient plus sophistiquée, l'enquête sur les structures du cerveau et des circuits exige des niveaux améliorés de précision et une résolution plus élevée. Nous avons développé une méthode pour la préparation et l'implantation d'un système de perfusion chronique dans le cerveau en utilisant un microcanule borosilicate avec un diamètre de pointe de 50 microns.
Abstract
Les protocoles expérimentaux utilisés pour perfusion chronique d'agents neuro au sein des régions du cerveau utilisent souvent un système de pompe mini-osmotique. Les agents sont généralement livrés par une canule en acier inoxydable d'un diamètre de 0,30 mm ou plus. Systèmes utilisant une canule de ce calibre peut imposer un traumatisme à la zone d'intérêt résultant des dommages architecturaux, compromettant ainsi l'intégrité structurelle et le fonctionnement normal. Comme neurosciences enquête devient plus sophistiquée, l'enquête sur les structures du cerveau et des circuits exige des niveaux améliorés de précision et une résolution plus élevée. Nous avons développé une méthode pour la préparation et l'implantation d'un système de perfusion chronique dans le cerveau en utilisant un microcanule borosilicate avec un diamètre de pointe de 50 microns. Cette technique réduit les dommages à l'environnement local et diminue gliose réactive sur le site de perfusion. La configuration du système de microperfusion est aussi capable de s'adapter à la surface du crâne de l'animal, écartant la nécessité pour les grands socles crânienne, facilitant ainsi la fermeture de l'incision du cuir chevelu et de réduire le risque d'infection. Nous démontrons fiabilité de livraison soutenue d'un colorant ayant un poids moléculaire en utilisant représentant un modèle in vitro et in vivo chez le rat.
Protocol
Présentation
Perfusion directe d'agents neuro permet régions spécifiques du cerveau à étudier tout en contournant la barrière hémato-encéphalique. Les applications de cette approche dans les neurosciences sont diverses et comprennent la modification du niveau d'activité du cerveau dans les sous-régions distinctes (Berretta et al, 2004;. Gliddon et al, 2005;.. Kim et al, 2000), d'enquêter sur les actes des agents psychotropes ( Clinton et al, 2006;.. Di Benedetto et al, 2004), fournissant des modèles contrôlée de l'inflammation du cerveau (Hauss-Wegrzyniak et al, 1998;. Marchalant et al, 2007;.. Rosi et al, 2004), l'étude des mécanismes de la dépendance (Kim et al, 2005;. Lockman et al, 2005;. Zhang et al, 2006.), et permettant l'administration à long terme de facteurs trophiques (Naert et al, 2006;.. Radecki et al, 2005; Takahashi et al., 2006).
Les méthodes standard pour la livraison chronique d'agents utilisent souvent une mini-pompe osmotique (par exemple, les pompes osmotiques ALZET, Cupertino, CA) avec un agent chargé neuroactifs, qui est livré dans le cerveau à travers une canule en acier inoxydable avec un diamètre qui peut varier de 0,25 mm (Williams et al, 1987.) à 0,5 mm, mais le plus souvent est d'environ 0,3 mm (Plastics One, Roanoke, en Virginie, voir Fig 6A). Alors que les canules de livraison de cette taille peut être adaptée pour de nombreuses applications dans lesquelles des niveaux élevés de précision ne sont pas nécessaires et les traumatismes au microenvironnement n'est pas une préoccupation majeure, ces canules sont sous-optimaux pour délivrer des agents aux petits sites délicate dans laquelle la canule est comparable dans la taille (ou plus grand que) la structure ciblée lui-même, ou lorsque la fonction ne doit pas être compromise par l'insulte traumatique.
Présentée ici est une méthode pour la préparation et l'implantation d'un système de perfusion chronique pour la livraison d'agents neuro dans le cerveau en utilisant un "microcanule" avec un diamètre de l'extrémité très réduite. Cette technique permet de sous-structures petites pour être ciblée et réduit le traumatisme de la de la zone d'intérêt. La procédure actuelle est donc enseigné comme une alternative aux méthodes conventionnelles pour les chercheurs qui désirent minimiser les perturbations pour la région du cerveau à l'étude.
Matériel et méthodes
Les animaux et la conception
Dix-huit adultes (400-450 g) des rats Sprague-Dawley ont été utilisés pour démontrer la procédure et de tester la fonction de la méthode actuelle. Douze animaux ont été implantés avec des systèmes de microperfusion et contribué à une évaluation en temps-courant de la fonction soutenue sur 4 jours. Six animaux ont été utilisés pour comparer le niveau de traumatisme et une gliose réactive 5 jours après l'implantation d'une norme de livraison 28 ga canule (n = 3) ou un microcanule (n = 3) attaché à une solution saline mini-osmotique pompe. Les animaux ont été logés dans des cages en plastique clair, et maintenue sur une lumière de 12 heures / calendrier sombre, avec de la nourriture et l'eau fournie ad libitum. Toutes les procédures ont été approuvées par les soins de l'hôpital McLean animaux institutionnelles et Use Committee, en conformité avec les directives applicables du gouvernement fédéral et local pour une utilisation expérimentale des animaux.
L'assemblage du système microperfusion
La figure 1 illustre les composants et l'assemblage du système de microperfusion. Nous vous recommandons de construire et d'implanter le système en utilisant une technique stérile. En outre, afin d'empêcher l'introduction d'air dans le système, il est monté tout immergé dans un bain salin. Pour les tests actuels, mini-osmotique pompes (MOP) étaient employées (ALZET, modèle # 1002, Cupertino, CA) avec une durée de 14 jours, débit de 0,25 ul / h, et une capacité de remplissage de 98,6 uL. Cependant, puisque les taux d'écoulement excessif peut déluge petites zones d'intérêt dans le cerveau et causer des dommages structurels, le débit de ces études a été baissé à 0,125 ul / h par revêtement de la moitié des MOP avec de la paraffine selon les instructions du fabricant. Pour l'évaluation des traumatismes locaux, les MOP ont été remplis de solution saline stérile. Pour l'évaluation de la fonction soutenue des systèmes de microperfusion, Fast Green (1% dans une solution saline, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) a été choisi comme une solution de test en raison de sa faible toxicité, sa capacité à diffuser dans le tissu cérébral viable, et parce qu'il a un poids moléculaire (808,84) à l'extrémité supérieure de la gamme de "petites molécules" (<1000) qui sont couramment de l'intérêt pour perfusion chroniques (p. ex muscimol, picrotoxine, la fluoxétine, etc.)
Figure 1: AssembléeBly du système de microperfusion. (A) Les composants du système placés dans leurs positions relatives à l'assemblage. Notez la bride du tuyau d'écoulement modulater a été rompu. Nous recommandons le fil d'alignement être assurée juste avant l'implantation (voir texte). (B) du système assemblé microperfusion avant la fixation de fil de l'alignement et l'implantation.
Microcanule préparation
Le microcanule peut être façonné à l'aide d'un tire-électrode standard horizontale ou verticale (Stoelting Co., Wood Dale, IL) avec réglages pour produire une électrode de verre avec un long manche en douceur effilée (figure 2A). Tube borosilicaté est adapté à cet effet (partie 1B100F-6, 1,0 mm, 6 en; Instruments de précision World, Inc, Sarasota, Floride), car il a un point de fusion relativement bas, ce qui permet la flexion subséquente avec la chaleur concentrée. La partie plus distale d'un microcanule droite peut être coupé avec des ciseaux de dissection ou une rupture contrôlée peut être faite avec microforceps (instruments de précision World, Inc, Sarasota, Floride) pour donner le diamètre de la pointe finale désirée (50 um pour les manifestations actuelles ), et un micromètre microscope est utile pour guider et confirmer le diamètre désiré. La pointe de coupe peut être chauffée brièvement, ou «polies au feu», pour éliminer les bords rugueux ou tranchants. La bobine de chauffage de l'extracteur d'électrode ou un bec Bunsen est ensuite utilisée pour imposer un angle droit sur le microcanule à une distance prédéterminée de la pointe de l'microcanule (figure 2B) en plaçant le tube borosilicaté dans la bobine de chauffage (ou d'un bec Bunsen ) et en appliquant la force douce à la partie distale avec une pince que le tube est chauffé. La longueur prédéterminée de la microcanule distale à l'angle droit est imposé décidé en fonction de la profondeur de la région du cerveau à cibler (par exemple, 5 mm) et en tenant compte de l'épaisseur du crâne (~ 1 mm) et de travailler à distance au-dessus du crâne ( par exemple, 1-2 mm). Ainsi, la distance prédéterminée de la pointe de l'microcanule à l'angle droit imposées pour les démonstrations actuelle a été 7-8 mm. Un crayon diamant est ensuite utilisé pour couper le tube borosilicaté environ 8 mm en amont de l'angle droit.
Figure 2: Préparation des microcanule. (A) Un extracteur d'électrode (Stoelting Co. Wood Dale, IL) est utilisé pour produire un microcanule avec une longue, tige effilée. (B) La bobine de chauffage peut être réorientée pour la facilité d'utilisation, et le microcanule est placé dans la bobine, ce qui permet un virage à angle droit à être formés en utilisant une pince que le tube de verre est chauffée.
Après que le nombre souhaité de Microcanules a été faite, nous vous recommandons de stérilisation à l'oxyde d'éthylène ou de l'utilisation d'un autoclave. Le mm plus distale 1-2 de la microcanule peut être coloré avec un marqueur stérile chirurgicale (ou à l'encre permanente avant la stérilisation) pour permettre à la pointe microcanule pour être facilement visualisés pendant la procédure chirurgicale.
Préparation de la RdP
MOP ont été préparés selon les instructions du fabricant. En bref, la bride en plastique du tube en acier inoxydable MOP («flux modulateur") est d'abord retiré à l'aide de ciseaux ou rongeurs. Une longueur de tuyaux en polyéthylène (plastique One, Roanoke, VA, VT # C312; DO, 1,22 mm; ID: 0,72 mm) est attaché à la région de tubes en acier inoxydable précédemment occupé par la bride (~ 4 mm) en insérant l'inox tubes en acier dans le lumen du tube en polyéthylène et la sécurisation d'un adhésif approprié autour de la circonférence externe de la connexion. LumaBond (myNeuroLab, Inc, St Louis, MO) est particulièrement utile car elle guérit en quelques secondes par exposition à la lumière focalisée (par exemple, d'une lampe à fibres optiques). La longueur du tube doit être approximativement la distance entre la base du crâne de l'animal et l'aspect plus rostrale de l'omoplate (par exemple, environ de 1,5 à 3,0 cm pour les rats de laboratoire). La pompe est rempli selon les instructions, et les tubes en acier inoxydable ALZET, avec la longueur de tuyaux en polyéthylène attachés à sa fin, est inséré dans la pompe remplie. Un petit volume de solution de la pompe sera forcée à l'extérieur de l'interface de la pompe-tube (et doit être tamponné loin) et aussi dans la région proximale du tube en polyéthylène. La pompe remplie de tubes de joint est ensuite incubée dans une solution saline stérile pendant 12 heures à 37 ° C. Si la pompe fonctionne correctement, après cette période d'incubation, le liquide sera considéré comme ayant voyagé quelques millimètres dans le tube de polyéthylène.
Construire des ion de système de microperfusion
La pompe avec son tube fixé est immergé dans un plat de 10 cm de Pétri contenant une solution saline stérile, et l'air restant dans les tuyaux en polyéthylène est enlevée à l'aide d'une seringue remplie avec la même solution contenue dans la pompe et qui a été munie d'un petit-diamètre du tube qui peuvent être insérés dans le tuyau de polyéthylène. La solution peut ainsi être injecté dans le tube en polyéthylène pour remplacer l'air. De même, le microcanule est immergé dans le bain d'air salin et est éliminé par injection d'une solution. Ceci est facilement réalisé avec une solution rempli seconde seringue munie d'flexibles (par exemple, silicone) tuyau qui s'adapte sur la grande (proximale) fin de l'microcanule.
L'extrémité proximale du tube borosilicaté est ensuite insérée dans le tube en polyéthylène. Notez que cela peut nécessiter la dilatation des tuyaux en polyéthylène en appuyant fermement sur les conseils fermé de microforceps dans la lumière de ce fait l'ouverture du torchage pour faciliter l'insertion du tube borosilicaté. Le système de perfusion air libre est ensuite retiré du bain d'une solution saline et placé sur une surface stérile et séchée doucement avec une gaze ou un coton-tige. La connexion des tubes en polyéthylène microcanule-est sécurisé avec une couche de colle circonférentielle (par exemple, LumaBond).
Si le système a été monté correctement, et si le MOP continue à fonctionner comme il se doit, au cours de la dernière étape de cette procédure une gouttelette de solution apparaissent habituellement au bout de la microcanule que le mécanisme osmotique dans la pompe continue pendant la préparation. Débit MOP peut être diminué proportionnellement par revêtement de la surface appropriée à la paraffine selon les instructions du fabricant. Pour les manifestations actuelles, 50% de chaque MOP a été enrobé par brièvement tremper dans de la paraffine fondue et laisser refroidir, ce qui réduit le débit en 1 / 2-0.125 pl / hr. Le système est alors complété microperfusion immergé dans une solution saline stérile et stocké à 37 ° C jusqu'à l'implantation.
Implantation de système de microperfusion
Le système est implanté microperfusion utilisant des méthodes stéréotaxiques comme décrit précédemment (Cooley, 1990). Après la préparation du champ opératoire, un trou de trépan est foré pour l'entrée de l'microcanule. Si désiré, vis crâne peut également être positionné afin de stabiliser le composé adhésif utilisé pour fixer le microcanule. Le composé utilisé dans ce laboratoire (Geribond, Den-Mat inc, Santa Maria, Californie) ne nécessite pas d'ancrage supplémentaires, mais la surface du crâne doit être préparé par un nettoyage avec un coton-tige acetonedampened. Un diamètre de 1-2 mm "crochet" est faite à l'extrémité distale du fil d'alignement (voir fig. 1), lui permettant d'encercler la courbure dans le tube borosilicaté. Il est alors sécurisé (utilisant LumaBond), dans une orientation sur le même axe que la partie distale du microcanule (qui est avancé dans le cerveau, voir Fig. 3B). Le système de perfusion est alors monté sur le support stéréotaxique (fig. 3), le fil de l'alignement de serrage sur le support. De suture stérile est utilisé pour attacher la pompe à perfusion au sommet du manipulateur stéréotaxique, donc il suspendre et prévenir la perte d'orientation lors de la procédure en raison du poids (et couple) de la pompe (figure 3B). Le microcanule peut alors être positionnée dans l'orientation désirée (par exemple justement verticale) en utilisant une pince doucement plier le fil d'alignement distal à la pince porte. La pointe microcanule est positionné sur un point de référence (par exemple, bregma ou lambda) et ensuite manœuvré au point d'entrée dans le cerveau. Les coordonnées utilisées pour les animaux dans ces expériences ont été: 0,2 mm Bregma, latéral de 3,2 mm et 5,0 mm en dessous ventrale durée avec la tête de l'animal dans une position crâne plat.
Après la microcanule est avancé à la profondeur appropriée dans le cerveau, le système est fixe en position avec un composé piédestal (par exemple, Geribond). Le socle peut être sculpté à proximité de la surface du crâne afin de faciliter la fermeture des plaies. Après le composé a durci piédestal (~ 2 min), le fil de l'alignement est coupée au ras du piédestal en utilisant la roue de coupe de la foreuse. Une petite quantité de composé peut être utilisé pour couvrir et lisse la barbe reste du fil rompu. La MOP est ensuite insérée sous la peau, placé entre les omoplates de l'animal. Enfin, la plaie est un lavage avec une solution saline stérile, et l'incision fermée à l'aide de suture ou des clips plaie (fig. 3, partie D).
système de croinfusion est positionné pour le placement et la fixation à l'intérieur d'un animal. (D) La conception du système permet microperfusion fermeture facile de l'incision sur un piédestal à profil bas, réduisant ainsi le risque d'infection et de minimiser l'inconfort à l'animal. "Width =" 511 "height =" 381 "/>
Figure 3: Implantation d'un système microperfusion. (A) de positionnement du système de microperfusion sur l'instrument stéréotaxique. (B) La MOP est attaché à l'aide de suture stérile pour empêcher son poids de perturber l'orientation de la microcanule. Le microcanule est positionné à l'entrée vertical précis dans le cerveau en utilisant le fil d'alignement. (C) Un système de microperfusion est positionné pour le placement et la fixation à l'intérieur d'un animal. (D) La conception du système permet microperfusion fermeture facile de l'incision sur un piédestal à profil bas, réduisant ainsi le risque d'infection et de minimiser l'inconfort à l'animal.
Préparation et implantation de système de perfusion standard
La procédure de préparation du système de perfusion standard est identique à celle pour le système de microperfusion sauf le microcanule est remplacé par un "connecteur de pompe osmotique canule" avec un diamètre de 300 um (28 ga; Plastics One, Roanoke, en Virginie, # 3300PM / CPS, voir fig 5a). Implantation du système standard est également identique à celle du système de microperfusion, y compris la fixation d'un fil d'alignement pour permettre précise le positionnement vertical de la canule d'entrée dans le cerveau.
Histologie et analyse
Afin d'examiner la capacité du système à fournir microperfusion prestation soutenue de Green rapide, des groupes de trois animaux ont été sacrifiés à 12 h, 1 jour, 2 jours et 4 jours après la chirurgie. Les sujets ont été profondément anesthésiés avec du pentobarbital sodique (120 mg / kg, ip) et transcardiaque perfusés avec 200 ml de 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS), suivi par 400 ml de paraformaldéhyde 4% dans 0,1 M de phosphate tampon. Solutions de perfusion ont été conservés à 4 ° C, avec un pH de 7,4 et perfusé à un débit de 50 ml par minute en utilisant une pompe péristaltique. Afin d'enlever les canules sans endommager les tissus post-mortem, l'animal perfusé a été fixé dans un cadre stéréotaxique, le piédestal a été obtenu avec de l'adhésif à un fil rigide attaché à la pince le bras manipulateur, et le crâne a été soigneusement retiré de autour du socle à l'aide une fraise dentaire. Le piédestal et la canule sous-jacentes étaient donc enlevé le long de la même trajectoire dans laquelle la canule a été avancée pour le placement. Les cerveaux ont été ensuite retiré de la calvaria et immergé pendant 12 heures dans le fixateur mêmes.
Pour l'évaluation de la perfusion prolongée de vert rapide, les sections d'une épaisseur de 200 um ont été coupés en utilisant une Vibratome (myNeuroLab, St. Louis, MO) et montés sur lames de verre mouillée. Sections représentatives ont été imagées en utilisant un Canon CanoScan LiDE 600F scanner. Pour l'évaluation d'un traumatisme local et gliose réactive, 70μm sections Vibratome ont d'abord été humide monté et photographié sans tache pour éviter la distorsion des tissus qui peuvent se produire avec des processus histologiques, comme le séchage, coloration, et la déshydratation. Ces mêmes articles ont ensuite été mis à sécher sur leurs lames de verre enduit de gélatine, et ils ont été colorées à l'hématoxyline et l'éosine (H & E), déshydratées avec des alcools classés, et la couverture-glissé avec Permount.
Adjacent 70 sections um a subi une procédure standard d'immunofluorescence pour détecter la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), ce qui est exprimé par les astrocytes au cours du processus de gliose réactive en réponse à un traumatisme (Ding et al, 2000;.. Ma et al, 1991). En bref, flottant sections ont été rincées avec du PBS et bloquées avec 10% sérum normal âne (PDN) et 3% de sérum albumine bovine dans 0,1 M PBS avec 0,3% de Triton X-100 (PBS / Triton) pendant une heure puis incubés en le lapin d'anticorps anti-GFAP (1:500; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) dans du PBS / Triton avec 1% NDS pendant 12 heures à 4 ° C. Les sections ont ensuite été rincés avec du PBS et incubées avec Alexa Fluor ® 594 ânes antirabbit anticorps secondaire (1:500; Molecular Probes, Inc, Eugene, OR) dans du PBS avec 5% de NDS pour une heure à température ambiante. Les sections ont été soigneusement rincées à nouveau avec du PBS et de contraste avec NeuroTrace ® vert fluorescent Nissl tache (1:500 dans du PBS pendant 5 minutes; Molecular Probes, Inc, Eugene, OR). Après un dernier rinçage avec du PBS, les sections ont été montées sur des lames recouvertes de gélatine et de lamelle en Slow-Fondu (Molecular Probes). Toutes les microphotographies ont été acquises en utilisant un microscope Axioskop Zeiss avec AxioVision logiciels (Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY).
Résultats
In vitro, les tests
Avant d'évaluation chez l'animal, trois systèmes ont été préparés par microperfusion plaçant leurs Fast Green-remplie MOP dans un compartiment (15 ml tube conique) et de placer leurs Microcanules dans un second compartiment (1 ml Epp Endorf tube), à la fois une solution saline contenant stérile à 37 ° C. Chaque système a démontré flux continu de teinture plus de 12 heures d'observation. La figure 4 illustre la fonction d'un système typique de plus de 3 heures.
Figure 4: Dans la démonstration in vitro de la fonction du système microperfusion. (A) Flux de colorant vert rapide est facilement visible sans entraves de la microcanule au début d'une période d'essai de vitro. (B) Comme écoulement continue, la solution retenue est saturé (B), et finalement opaque avec coloration (C).
Evaluation de microperfusion vivo dans le système
Après la perfusion, la Microcanules enlevés et leurs connexions ont été soigneusement inspectés, et tous ont été trouvés à être entièrement intacte. Ainsi, il s'est produit aucune rupture du verre borosilicate au sein du tissu, et il n'y avait aucun des défauts dans les connexions des composants du système. A 10. L remplis de solution saline seringue Hamilton avec une courte longueur de tube silicone attachée à son aiguille a été utilisée pour appliquer léger flux à l'extrémité coupée du tuyau en polyéthylène attachés à la microcanule. Tous les douze de la Microcanules autorisé flux continu et ne semble pas être obstruées. Par ailleurs, après la suppression de chaque MOP de l'animal, le volume de la solution restante a été mesurée et jugée appropriée pour le débit de la MOP (0,125 ul / hr) et la quantité de temps qu'il a été autorisé à fonctionner.
Dans la livraison vivo
Évaluation des coupes coronales de tissu imprégné de vert rapide a démontré peu de variabilité dans la répartition entre les animaux au sein des groupes à un point quelconque moment donné (12 heures, 1 jour, 2 jours et 4 jours). La figure 5 illustre les zones représentatives de la diffusion rapide vert à ces points de temps, montrant une augmentation progressive de l'infiltration de teinture sur quatre jours. Notez que les expériences antérieures utilisant des concentrations plus élevées du vert rapide (par exemple, 5 - 15%) ont abouti à une opacification rapide du parenchyme, occultant ainsi une évaluation précise de la fonction du système de microperfusion au fil du temps. Alors que toute l'étendue de diffusion du colorant à 1% peut être difficile de déterminer avec précision sur l'inspection brut, les zones d'infiltration ont été facilement discernable à un grossissement de 2.5X, et sont indiqués par des lignes en pointillés dans la Figure 5.
Figure 5: Dans demonstation in vivo de microperfusion soutenue de vert rapide. (A) Douze heures après le placement d'un système de intrastriatale microperfusion vert-chargé rapide, colorant est visible en diffusant dans le parenchyme environnant le site microcanule. Observations à 1 jour (B), 2 jours (C), et 4 jours (D) indiquent la prestation continue de la solution de vert rapide avec les zones d'infiltration croissante de teinture. La limite extérieure de la diffusion a été observée sous microscope à faible grossissement et est indiqué ici en pointillés. La barre d'échelle, de 2 mm.
Évaluation d'un traumatisme et une gliose réactive
L'observation du brut fraîchement coupés, des coupes de tissus non colorés ont montré que le système de microperfusion a entraîné une réduction des traumatismes localisés sur le site de livraison. La canule standard a été invariablement vu de perturber et de déplacer une plus grande surface de tissu (fig. 6B et C), ce qui est mieux apprécié à une puissance plus élevée avec H & E (Fig. 6D & E). Par ailleurs, le sang a été fréquemment vu s'accumuler au site de perfusion standard (Fig. 6D), suggérant un plus grand degré de compromis pour la vascularisation et l'intégrité impliquant une diminution de la barrière hémato-encéphalique.
Le système de microperfusion également abouti à une gliose réactive fortement réduite comme démontré par immunoréactivité a diminué pour la GFAP dans le voisinage de perfusion via un microcanule (Fig. 6G) par rapport à une canule standard (Fig. 6F). Bien microcanule coloration induite GFAP a été élevée au-dessus des niveaux normaux (Fig. 6H), l'escalade frappant dans gliose réactive avec canule placement standard et de perfusion (6F) n'a pas été observé lorsque le système de microperfusion a été employée.
canule Ivery après 5 jours de perfusion de solution saline. (A) Une microcanule tiré à partir de tubes en borosilicate avec un diamètre de pointe de 50. M permet gratuitement, sans restriction de débit de la plupart des agents neuroactifs, encore 6X est plus petit qu'une livraison standard canule (28 ga, 0,30 mm). (B, C) non colorées, des montages humides de coupes coronales (épaisseur, 70. M) illustrant une plus grande lésion tissulaire locale (flèches) causée par une canule standard (B) par rapport à un microcanule (C). (D, E) microphotographies de puissance supérieur des sections H & E teinté montré en B et C, respectivement. La canule standard causé plus étendue des lésions traumatiques, comme illustré en D, avoir déplacé une plus grande surface de tissu et de causer une plus grande insulte à la vascularisation comme démontré par la collecte de sang dans la cavité lésion (flèche). La lésion causée par la microcanule, cependant, est beaucoup plus petit et moins perturbateur pour les tissus au site de perfusion. (F, G, H) Immunofluorescence contre GFAP démontre de façon spectaculaire augmentation du nombre d'astrocytes GFAP + autour de la lésion de la canule standard (F) par rapport à celui de la microcanule (G) et normale, le striatum unlesioned (H). Barres d'échelle: A & B, 1 mm; D - H, 250 m "/>.
Figure 6: un traumatisme localisé causé par une microcanule par rapport à une canule de livraison standard après 5 jours de perfusion de solution saline. (A) Une microcanule tiré à partir de tubes en borosilicate avec un diamètre de 50 microns astuce permet gratuitement, sans restriction de débit de la plupart des agents neuroactifs, encore 6X est plus petit qu'une livraison standard canule (28 ga, 0,30 mm). (B, C) non colorées, des montages humides de coupes coronales (épaisseur, 70 microns), illustrant une plus grande lésion tissulaire locale (flèches) causée par une canule standard (B) par rapport à un microcanule (C). (D, E) microphotographies de puissance supérieur des sections H & E teinté montré en B et C, respectivement. La canule standard causé plus étendue des lésions traumatiques, comme illustré en D, avoir déplacé une plus grande surface de tissu et de causer une plus grande insulte à la vascularisation comme démontré par la collecte de sang dans la cavité lésion (flèche). La lésion causée par la microcanule, cependant, est beaucoup plus petit et moins perturbateur pour les tissus au site de perfusion. (F, G, H) Immunofluorescence contre GFAP démontre de façon spectaculaire augmentation du nombre d'astrocytes GFAP + autour de la lésion de la canule standard (F) par rapport à celui de la microcanule (G) et normale, le striatum unlesioned (H). Barres d'échelle: A & B, 1 mm; D - H, 250 um.
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Discussion
Diverses études ont démontré qu'en diminuant la taille de la canule de livraison pour les perfusions intracérébrales, d'un traumatisme tissulaire et insulte à la barrière hémato-encéphalique sont réduits (Perry et al., 1993), l'inflammation est diminuée et la réponse immunitaire atténuée (Finsen et al gliose., 1991), et réactive est diminuée (Nikkhah et al., 1994). Nous présentons ici une méthode pour la livraison d'agents neuro chroniques dans le cerveau via un microcanule avec un diamètre qui est réduit à 6 fois par rapport à celle des canules de livraison conventionnelle utilisée. Nous avons démontré que ce système offre une solution fiable représentatives dans le temps et le niveau de traumatisme localisé et une gliose réactive est considérablement réduite. Ces études ont utilisé une canule de livraison avec un diamètre de l'extrémité finale du 50 m, mais les diamètres plus petits astuce peut être utilisée. La première vertu de systèmes de microperfusion telle est leur capacité à délivrer des agents à très petites cibles discrets, tout en encourant un traumatisme minime dans le voisinage de la perfusion.
Le Microcanules utilisés dans la construction du système de perfusion, nous décrivons peuvent être facilement personnalisés construits avec des longueurs et des diamètres prédéterminés pointe. Le système est conçu pour microperfusion conformer à la surface du crâne de l'animal permettant sécurisé, à profil bas de fixation et excluant la nécessité d'un grand piédestal crânienne. La plaie chirurgicale peut donc être facilement suturée sur le piédestal microperfusion simplifié, réduisant ainsi à la fois l'inconfort à l'animal et le risque d'infection. En outre, la sécurisation du système sur le crâne nécessite moins de surface du crâne, par conséquent, des procédures supplémentaires ou ultérieurs peuvent être effectués sans interférence d'un plus grand piédestal.
On devrait, cependant, tenir compte de certaines considérations techniques lors de l'utilisation de la méthode décrite ici. Un haut niveau d'habileté est nécessaire, et la procédure de production et d'implantation est moins efficace que du temps, il peut être pour les systèmes de perfusion standard. D'un autre côté, cela peut être compensé, ou tout au moins contrebalancé par le temps (et animaux) épargné par la pratique de haute précision technique. Une autre difficulté est que, si le microcanule peuvent être personnalisées avec pratiquement n'importe quel diamètre, un microcanule avec une lumière très faible peut être obstrué, soit par des composants de la solution intraveineuse ou par des tissus rencontrés lors de l'implantation (par exemple, le tissu cérébral de sang,). Ce risque est réduit en gardant la pointe microcanule humidifié (par exemple, en utilisant une eau salée ou un coton tige saturé pour éviter le dessèchement des solutés soluté) pendant la procédure d'implantation et en effectuant propre », le sang-libres" chirurgie.
Nous recommandons que le chercheur d'établir un diamètre de l'extrémité microcanule qui est appropriée pour la composition particulière et / ou la viscosité de la solution qui sera chargé dans la RdP. Ceci est facilement réalisé en utilisant un système de test in vitro similaire à celle décrite dans le protocole (Fig. 4), ou tout simplement en plongeant le système assemblé dans un bain à 37 ° C une solution saline et le suivi de la composition de bain et / ou en mesurant le volume du contenu MOP au fil du temps. Un inconvénient est que l'microcanule est relativement fragile, surtout si son diamètre de la pointe est très faible (par exemple, ~ 10-50 microns). Briser accidentellement l'microcanule pendant la chirurgie exige habituellement que le système soit remplacé, comme la réparation ou la reconstruction de cette unité serait d'étendre considérablement le temps la chirurgie. Les scientifiques spécialisés dans ces techniques et qui pratique la méthode exigeante que rarement la rupture expérience, cependant.
A l'issue de l'expérimentation, le système de microperfusion peut être inspecté pour s'assurer que les microcanule n'a pas été endommagé et qu'il est resté brevet. Le volume de la pompe mini-osmotique peut aussi être mesuré afin de s'assurer que la quantité appropriée d'agent neuroactives a été livré, nous ne recommandons pas le recyclage ou la réutilisation des pompes, cependant. Alors que les méthodes actuelles ont démontré chez des rats adultes, l'utilisation d'un système qui réduit le traumatisme et nécessite moins de surface du crâne pour la fixation peut être jugée préférable par rapport aux méthodes conventionnelles pour des expériences avec des animaux plus petits, tels que les souris ou les rats jeunes.
Bien que la méthode actuelle nécessite un niveau un peu plus avancé de compétence et d'habileté par l'expérimentateur, il propose d'augmenter la précision peut-être par un ordre de grandeur, et de minimiser les confond expérimentale associée à un traumatisme à la région d'intérêt. Dans notre laboratoire, nous avons constaté que cela se traduit par des effets plus fiable et robuste de l'intervention expérimentale.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
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Neuroscience numéro 13 mini pompe osmotique la perfusion chronique microcanule vert rapideErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
