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Summary
신경 과학 메세지가되면서 더 정교, 뇌 구조의 조사 및 회로 정확성 및 높은 해상도의 향상된 수준을 필요로합니다. 우리는 50 미크론의 팁 직경 borosilicate microcannula을 이용하여 뇌 내에 만성 주입 시스템의 준비와 주입하는 방법을 개발했습니다.
Abstract
두뇌의 지역 내에서 neuroactive 요원의 만성 주입에 사용되는 실험 프로토콜들은 종종 미니 삼투 펌프 시스템을 사용합니다. 에이전트는 일반적으로 0.30 mm 이상의 직경을 가진 스테인레스 스틸 정맥을 통해 전달됩니다. 이 구경의 정맥을 이용한 시스템은이를 구조적 무결성 및 정상적인 기능을 손상, 건축 손상의 결과로 관심의 영역에 충격을 부과할 수 있습니다. 신경 과학 메세지가되면서 더 정교, 뇌 구조의 조사 및 회로 정확성 및 높은 해상도의 향상된 수준을 필요로합니다. 우리는 50 미크론의 팁 직경 borosilicate microcannula을 이용하여 뇌 내에 만성 주입 시스템의 준비와 주입하는 방법을 개발했습니다. 이 기술은 로컬 환경에 피해를 감소하고 주입의 사이트에서 반응 gliosis가 줄어들. microinfusion 시스템의 구성도 따라서 두피 절개의 폐쇄를 촉진하고 감염의 위험을 감소, 큰 두개골 받침대의 필요성을 precluding, 동물의 두개골의 표면에 부합 수 있습니다. 우리는 체외 모델에서 쥐의 생체내 연구에를 사용하는 대표적인 분자량을 가진 염료의 신뢰할 수있는 지속적인 배달을 보여줍니다.
Protocol
소개
neuroactive 요원의 직접 주입은 혈액 뇌 장벽을 우회하면서 특정 두뇌 영역이 공부 수 있습니다. 신경 과학이 접근 방식의 애플 리케이션은 다양하고 개별 subregions의 뇌 활동의 레벨 (Berretta 외, 2004 김 외, 2000.,, 글리든 외, 2005..) 변경 포함 (정신 대리인의 행동을 조사 클린턴 외, 2006;.. 메커니즘을 연구, Rosi 외, 2004). Marchalant 외, 2007;.. 디 Benedetto 외, 2004), 뇌 염증의 제어 모델 (Hauss - Wegrzyniak 외, 1998 제공 중독 (김 외, 2005;, 2006 장 외.; 로크먼 외, 2005..) 및 영양 요인 (Naert 외, 2006 수 있도록 장기적인 관리,.. Radecki 외, 2005; 다카하시 외., 2006).
대리인의 만성 제공을위한 표준 방법은 종종 범위 수있는 직경 스테인레스 스틸 정맥을 통해 뇌 내에 배달됩니다 neuroactive 에이전트와 로드된 미니 삼투 펌프 (예 : ALZET 삼투 펌프, 쿠퍼 티노, CA) 활용 0.25에서 mm (윌리엄스 외, 1987.) 0.5 mm지만, 가장 일반적으로 약 0.3 mm (플라스틱, 하나, 로어 노크, VA, 그림 6A 참조)입니다. 이 정도 크기의 배달 cannulas는 정밀도 높은 수준이 필요하고 microenvironment에 외상이없는있는 많은 애플 리케이션에 적합 중요한 문제가되지 않습니다 있지만, 이러한 cannulas는 정맥이 비교되는 작은, 섬세한 사이트에 에이전트를 전달하기위한 suboptimal 아르 크기 (또는보다 큰)를 대상으로 구조 자체, 또는 어디에 기능은 외상성 모욕에 의해 손상해서는 안됩니다.
여기에 제시하면 훨씬 감소 팁 직경과 "microcannula"을 이용하여 뇌 내에 neuroactive 요원의 전달 만성 주입 시스템의 준비 및 이식을위한 방법입니다. 이 기술은 작은 substructures가 타겟이 될 수 있으며 관심 분야의에 외상을 줄일 수 있습니다. 현재의 절차는 따라서 조사에서 뇌 영역에 방해를 최소화하고자 연구자를위한 기존의 방법의 대안으로 진행됩니다.
재료 및 방법
동물과 디자인
에이틴 어른 (400-450 GM) 남성 스프 라그 - 돌리 쥐이 절차를 설명하고 현재 메서드의 기능을 테스트하기 위해 사용되었습니다. 열두 동물 microinfusion 시스템과 이식과 4 일 동안 지속적인 기능의 시간 코스 평가에 기여했다. 여섯 동물 생리 - 채워진 미니 삼투 펌프에 부착된 오일 중 표준 28가 배달 정맥 (N = 3) 또는 microcannula (N = 3) 주입 후 정신적 충격과 반응 gliosis 수준을 비교하는 데 사용되었습니다. 동물은 투명한 플라스틱 새장 안에 보관되어 및 광고 libitum를 제공 음식과 물을 함께, 12 시간 조명 / 어두운 일정에 유지했다. 모든 절차가 동물 실험 사용을 위해 해당 연방 및 지방 지침을 준수, 맥린 병원 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
Microinfusion 시스템 조립
그림 1은 구성 요소와 microinfusion 시스템의 조립을 보여줍니다. 우리는 멸균 기술을 사용하여 시스템을 구축하고 이온 주입하는 것이 좋습니다. 생리 목욕 이내에 빠져들면서 또한, 시스템에 공기의 도입을 방지하기 위해, 그것은 조립입니다. 현재 테스트를 위해, 미니 삼투 펌프는 (걸레) 14 일간의 기간, 0.25 μL / HR의 유량 및 98.6 μL의 채우기 용량 (ALZET, 모델 # 1002, 쿠퍼 티노, CA) 고용했다. 그러나, 과도한 유량은 홍수 두뇌에 대한 관심의 작은 영역을 수 있으며, 구조적 손상, 제조 업체의 지시에 따라 이러한 연구는 파라핀과 청소 중 코팅 절반으로 0.125 μL / 시간으로 감소했습니다위한 유량의 원인이 있기 때문입니다. 지역 외상의 평가, 걸레는 무균 식염수에 가득 차 있었다. microinfusion 시스템, 빠른 그린 (식염 1 %, 피셔 과학, 파크 레인 피츠버그, PA)의 지속적인 기능 평가를위한 이유는 낮은 독성, 가능한 뇌 조직 내에 확산하기 위해 능력과 그것 때문에 테스트 솔루션으로 선정되었습니다 만성 주입 (예 : muscimol, picrotoxin, 플루옥세틴, 등)에 대한 관심이 일반적으로있는 "작은 분자 '(<1000)의 범위의 위쪽 끝에 분자량 (808.84)를했다.
그림 1 : Assem블라 microinfusion 시스템. (A) 시스템의 구성 요소는 어셈블리에 대한 그들의 상대적 위치에 배치. 흐름 modulater 관의 플랜지가 떨어져 깨진되었습니다 있습니다. 우리는 정렬 와이어가 (텍스트 참조) 바로 주입하기 전에 보안하는 것이 좋습니다. (B) 정렬 와이어 및 이식의 첨부 파일을 이전에 microinfusion 시스템을 조립.
Microcannula 준비
microcannula는 길고 부드럽게 나아지고 생크 (그림 2A)과 유리 전극 제작에 대한 설정을 표준 수평 또는 수직 전극 풀러 (스토엘팅 (주) 우드 데일, IL)를 사용하여 구식 수 있습니다. Borosilicate 관이 목적에 적합 (일부 1B100F - 6에서 1.0 mm, 6, 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다), 그것은 수 있도록 상대적으로 낮은 융점을 가지고 같은 초점을 열과 굽힘 이후. 직선 microcannula의 말초 최고의 부분은 해부 가위로 절단 될 수도 있고 아니면 제어 브레이크가 원하는 최종 팁 직경 (줄 microforceps (세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다)로 만들 수 현재 시위는 50 μm의 ), 그리고 현미경 스테이지 마이크로 미터 원하는 직경 가이드 및 확인하는 데 유용합니다. 절단 팁은 간략하게 가열, 또는 "화재 - 광택,"거칠게 또는 날카로운 모서리를 제거하실 수 있습니다. 전극 끌어당기는 또는 알콜 램프의 가열 코일은 다음 (또는 알콜 불꽃 가열 코일 내에서 borosilicate 튜브를 삽입하여 microcannula (그림 2B)의 끝에서 미리 정해진 거리에서 microcannula에 직각을 부과하는 데 사용됩니다 튜빙은 가열로)와 포셉와 말초 부분에 부드러운 힘을 적용. 부과 직각으로 말초 microcannula의 미리 정해진 길이 ((예 : 5mm) 타겟팅하는 뇌 영역의 깊이에 따라 결정하고 계정으로 두개골의 두께를 복용 (~ 1mm)과 두개골 위의 거리를하고있다 예, 1-2 ㎜). 따라서 microcannula의 끝에서 현재 시위에 대해 부과 직각으로 만들어진 거리 7-8mm되었습니다. 다이아몬드 연필은 다음 borosilicate 튜브 직각으로 근위 약 8mm를 잘라하는 데 사용됩니다.
그림 2 : microcannula의 작성. (A) 전극 풀러 (스토엘팅 (주) 우드 데일, IL)은 길고 끝이 가늘어진 칼을 들고 microcannula을 생산하는 데 사용됩니다. (B) 가열 코일은 사용의 용이성을 위해 reoriented 수 있으며, microcannula는 오른쪽 앵글 벤드는 유리 튜브를 가열로 집게를 사용하여 형성 수 있도록, 코일 내에 배치됩니다.
microcannulas의 원하는 번호가 만들어진 후에, 우리는 산화 에틸렌이나 압력솥을 이용하여 살균하는 것이 좋습니다. microcannula의 말초 - 가장 1-2mm은 microcannula 팁은 수술하는 동안 쉽게 시각 수 있도록 무균 수술 마커 (또는 이전 살균에 영구 잉크)와 색상 수 있습니다.
걸레 준비
걸레는 제조 업체의 지시에 따라 준비되었습니다. 간단히, 스테인리스 걸레 튜브 ( "흐름 변조기")에서 플라스틱 플랜지가 처음 가위 또는 rongeurs를 사용하여 제거됩니다. 폴리에틸렌 튜브 (; OD, 1.22 mm, 플라스틱, 하나, 로어 노크, VA, # C312 VT ID : 0.72 mm)의 길이는 이전에 다음 ID로 스테인리스를 삽입하여 플랜지 (~ 4 ㎜)에 의해 점유 스테인레스 스틸 튜브의 영역에 첨부되어 있습니다 폴리에틸렌 튜브와 연결의 바깥 둘레 주위에 적당한 접착제로 확보의 루멘에 강철 관. LumaBond (myNeuroLab (주), 세인트 루이스, MO)가 집중 조명에 노출 (예를 들어, 광섬유 램프에서)에 따라 초 이내에 그 치료로 특히 유용합니다. 튜브의 길이는 동물의 두개골의 기본과 scapulae의 주동이의 최고의 부분 (예를 들어, 실험실 쥐 약 1.5-3.0 cm) 사이의 대략적인 거리해야합니다. 펌프 지시 가득, 그 끝에 연결된 폴리에틸렌 튜브의 길이와 스테인리스 ALZET 관은, 가득한 펌프에 삽입됩니다. 펌프에서 솔루션의 작은 볼륨 펌프 튜브 인터페이스 (멀리 dabbed한다)의 외부 주위와도 폴리에틸렌 튜빙의 근위 지역으로 강제 것입니다. 첨부 튜브로 가득 차 펌프는 다음 37 ° C. 12 시간 동안 멸균 생리에 incubated입니다 펌프이 잠복기 후 제대로 작동하는 경우, 유체는 폴리에틸렌 튜브 내에 몇 mm를 여행해야 볼 수 있습니다.
구축 microinfusion 시스템의 이온
의 첨부 관과 펌프는 멸균 생리를 포함 10cm 페트리 접시에 포장되어 있으며, 폴리에틸렌 튜브 내에 남아있는 공기가 펌프와하는에 포함된 동일한 솔루션으로 가득한 주사기를 사용하여 제거 작은 직경 튜브가 장착되어있다 그것은 폴리에틸렌 튜브 내에 삽입할 수 있습니다. 솔루션은 따라서 공기를 대체하기 위해 폴리에틸렌 튜브에 주입 수 있습니다. 마찬가지로, microcannula는 생리 욕조에 포장되어 있으며 공기 솔루션으로 주사에 의해 제거됩니다. 이것은 쉽게 두 번째 솔루션 채워진 주사기 microcannula의 대형 (근위) 최종 통해 맞는 유연하고 (예를 들어, 실리콘) 튜브와 함께 장착되어 이루어진다.
borosilicate 관의 근위 끝은 다음 폴리에틸렌 튜브에 삽입됩니다. 이 단단히함으로써 borosilicate 튜브 쉽게 삽입에 대한 열기를 활활 타는 루멘에 microforceps의 폐쇄 도움말을 눌러 폴리에틸렌 튜빙의 지연을 필요로 할 수도 있습니다. 공기없는 주입 시스템은 다음 생리 목욕탕에서 제거하고 멸균 표면에 위치하고 부드럽게 거즈 또는 면봉로 건조됩니다. microcannula - 폴리에틸렌 튜브 연결 접착제의 원주 코트 (예 : LumaBond)와 보안이다.
시스템이 제대로 조립되어 있으며, 청소가이 절차 솔루션의 비말의 마지막 단계에서, 그것이 정상적으로 작동을 계속하는 경우 일반적으로 펌프 내의 삼투 메커니즘으로 microcannula의 끝에 나타납니다면 준비하는 동안 계속됩니다. 제조 업체의 지시에 따라 걸레 유량은 파라핀 코팅 적절한 표면적으로 비례 감소 수 있습니다. 현재 데모 각 청소의 50 %가되므로 0.125 μL / 시간의 절반에 의해 유속을 줄이고, 간단히 용융 파라핀에 그것을 그런 일은하고 냉각함으로써 코팅했다. 완료 microinfusion 시스템은 다음 멸균 생리에 빠져들 37 ° C까지 주입에 저장됩니다.
microinfusion 시스템의 주입
microinfusion 시스템으로 이전 (쿨리, 1990) 설명 표준 stereotaxic 방법을 사용하여 이식합니다. 수술 분야의 준비 후 버 구멍은 microcannula의 항목에 대해 곤란합니다. 원하는 경우, 두개골의 나사도 microcannula를 확보하는 데 사용되는 결합 화합물을 안정화시키기 위해 위치를하실 수 있습니다. 이 실험에서 사용되는 화합물 (Geribond, 덴 - 매트 주식 회사, 산타 마리아, CA)이 추가 고정을 필요로하지 않는다;하지만, 두개골 표면 acetonedampened 면봉과 청소에 의해 준비되어야합니다. 1~2mm 직경 "훅"은 그것이 borosilicate 튜브에 벤드 둘러싸자 수 있도록 정렬 와이어의 말초 끝 (그림을 참조하십시오. 1)에서 이루어집니다. 그것은 다음 microcannula의 말초 부분과 같은 축 (즉 두뇌에 고급되어야하는, 그림을 참조하십시오. 3B)를 따라 방향 (LumaBond를 사용하여) 보안입니다. 주입 시스템은 다음 보유자로 정렬 와이어를 클램핑, stereotaxic 캐리어 (그림 3)에 장착됩니다. 멸균 봉합사 따라서 그것을 정지하고 펌프의 무게 (및 토크) (그림 3B)에 의한 절차를 수행하는 동안 방향의 손실을 방지, 밧줄 stereotaxic 조작하는 사람의 상단에 주입 펌프를하는 데 사용됩니다. microcannula 그런 다음 부드럽게 캐리어 클램프에 말초 정렬 와이어를 구부 집게를 사용하여 원하는 방향 (예 : 정확히 수직)에 위치하실 수 있습니다. microcannula 팁은 참조 (예 : bregma 또는 람다)의 지점을 통해 위치하고 두뇌에 항목의 지점 였는데입니다. 이 실험에서 동물에 사용되는 좌표는있었습니다 Bregma 0.2 mm, 측면 3.2 mm 및 5.0 mm 두라 복부 아래에 두개골 - 플랫 위치에 동물의 머리.
microcannula이 두뇌 속에 적절한 깊이에 고급 후, 시스템은 페데 스탈 화합물 (예 : Geribond)와 위치에 고정됩니다. 받침대는 가까운 상처 폐쇄를 촉진하기 위해 두개골의 표면에 조각 수 있습니다. 페데 스탈 화합물이 (~ 2 분) 치료 후 정렬 와이어는 훈련의 절단 바퀴를 사용하여 받침대와 플러시 절단됩니다. 화합물의 소량이 커버와 절단 와이어에서 남은 바브를 부드럽게하는 데 사용할 수 있습니다. 걸레는 다음 subcutaneously 삽입된 동물 scapulae 사이에 위치합니다. 마지막으로, 상처는 멸균 식염수에 lavaged이며, 절개는 (그림 3, 패널 D) 봉합이나 상처 클립을 사용하여 마감했다.
croinfusion 시스템은 동물 내에 배치 및 고정을위한 위치이다. (D) microinfusion 시스템의 설계는 위험 감염을 줄이고 동물에 불편을 최소화, 낮은 프로파일 페데 스탈을 통해 절개 쉽게 종결 수 있습니다. "너비 ="511 "높이 ="381 "/>
그림 3 : microinfusion 시스템의 주입. stereotaxic 악기에 microinfusion 시스템 (A) 포지셔닝. (B) 청소는 microcannula의 방향을 방해로부터 무게를 방지하기 위해 멸균 봉합사를 사용하여 곁에 있습니다. microcannula은 정렬 와이어를 사용하여 두뇌에 정확한 수직 항목에 대한 위치입니다. (C) microinfusion 시스템은 동물 내에 배치 및 고정을위한 위치이다. (D) microinfusion 시스템의 설계는 위험 감염을 줄이고 동물에 불편을 최소화, 낮은 프로파일 페데 스탈을 통해 절개 쉽게 종결 수 있습니다.
표준 주입 시스템의 준비 및 주입
플라스틱 하나, 로어 노크, VA, # 3300PM /; 표준 주입 시스템의 준비 절차는 microcannula, 300 μm의의 직경이 "삼투 펌프 커넥터 정맥"(28 번출구로 대체됩니다 제외 microinfusion 시스템을 위해 동일합니다 SPC는;) 그림의 5A를 참조하십시오. 표준 시스템의 주입은 또한 두뇌에 항목의 정맥의 정확한 수직 위치를 허용하도록 정렬 와이어의 첨부 파일을 포함하여 microinfusion 시스템의 동일합니다.
조직학 및 분석
빠른 그린의 지속적인 공급을 제공하기 위해 microinfusion 시스템의 능력을 확인하려면 세 동물의 그룹은 수술 후 12 시간, 1 일, 2 일, 4 일 동안 희생되었다. 과목은 나트륨이 (120 MG / kg, IP)와 transcardially 0.1M phospate 버퍼의 4 % paraformaldehyde 400 ML 다음 생리 (PBS)를 버퍼 0.1M 인산 200 ML과 pentobarbital perfused와 깊이 anesthetized되었습니다. 재관류 솔루션은 7.4의 산도와 함께, 4 ° C에서 보관 및 연동 펌프를 사용하여 분당 50 ML의 비율로 perfused했다. 사후 조직을 손상하지 않고 cannulas를 제거하기 위해 perfused 동물 stereotaxic 프레임에 고정되었다, 받침대는 조작하는 사람의 팔 클램프에 부착된 단단한 철사에 접착제로 확보되었고, 두개골은 신중하게 사용하여 받침대 주변에서 제거되었습니다 치과 버. 페데 스탈과 기본 정맥은이를 정맥이 게재 위치에 대한 고급어진 동일한 궤도를 따라 제거되었습니다. 뇌는 그 다음 calvaria에서 제거하고 같은 정착액 12 시간 동안 열중했다.
빠른 그린의 지속 주입, 200 μm의의 두께 섹션의 평가는 Vibratome (myNeuroLab, 세인트 루이스, MO)와 유리 슬라이드에 서부 유럽 표준시 탑재된를 사용하여 절단 하였다. 대표 섹션은 캐논 CanoScan 라이드 600F 스캐너를 사용하여 몇 군데 있었다. 지역 외상과 반응 gliosis 평가 들면, 70μm Vibratome 섹션이 먼저 있었다 축축한 탑재 등, 건조 얼룩과 탈수로 histological 프로세스에서 발생할 수있는 조직 왜곡을 방지하기 위해 흠없는 사진. 이 같은 부분은 그들의 젤라틴 코팅 유리 슬라이드에 건조 허용했고, 그들은 등급 알콜로 탈수 hematoxylin 및 eosin (H & E)와 스테인드되었고, Permount로 커버 - 미끄러.
인접 70 μm의 섹션은 외상 (..; 마 외, 1991 딩 외, 2000)에 대한 응답으로 반응 gliosis의 과정 astrocytes에 의해 표현된다 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)를 감지하는 표준 immunofluorescence 절차를 받았습니다. 간단히, 자유 떠있는 부분은 PBS로 씻어서와 10 %의 정상 당나귀 혈청 (NDS)와 트리톤은 X - 100 한 시간 만이라도 (PBS / 트리톤)이 다음에 0.3 % incubated와 0.1 M PBS에서 알부민 3% 소 혈청로 차단되었습니다 토끼 안티 GFAP 항체 (1:500; 시그마 화학 (주), 세인트 루이스, MO) 4 12 시간 1퍼센트 NDS와 PBS / 트리톤의 ° C. 섹션은 다음 PBS로 씻어서 알렉사 플루어 ® 594 당나귀 antirabbit 차 항체와 incubated 있었다, 실온에서 한 시간 만이라도 5% NDS와 PBS에서 (1:500 분자 프로브 (주), 유진, OR). 섹션은 철저하게 PBS로 다시 씻어서 NeuroTrace와 counterstained되었습니다 ® 녹색 형광 Nissl은 얼룩 (5 분 PBS에서 1:500을, 분자 프로브 (주), 유진, OR). PBS와 린스 최종 후, 섹션은 젤라틴 코팅 슬라이드에 장착되었으며 느리게 - 페이드 (분자 프로브)과 coverslipped. 모든 photomicrographs는 AxioVision 소프트웨어 (칼 자이스 혈구, 주식 회사, 손우드, NY)와 자이스 혈구 Axioskop 현미경을 사용하여 인수했다.
검색 결과
시험 관내 시험에서
동물 평가하기 전에 세 microinfusion 시스템은 한 칸 (15 ML 원뿔 관)에에 그들의 빠른 그린 - 채워진 걸레를 삽입하고 두 번째 구획 (1 ML EPP에서 microcannulas을 배치 준비가되어있다 endorf 튜브), 37가 들어있는 멸균 생리 모두 ° C. 각 시스템은 관찰 12 시간 동안 염료의 지속적인 흐름을 보여주었다. 그림 4는 3 시간 동안 일반적인 시스템의 기능을 보여줍니다.
그림 4 : microinfusion 시스템 기능의 체외 데모에서. 빠른 그린 염료 (A) 흐름을 쉽게 체외 시험 기간의 시작 부분에 microcannula에서 unimpeded 볼 수 있습니다. 흐름이 지속적으로 (B), 저수지 솔루션은 (B) 포화 및 착색 (C)와 함께 궁극적으로 불투명하게된다.
생체내의 microinfusion 시스템의 평가
재관류 후, 삭제 microcannulas과 연결은 신중하게 검사했고, 모두 완전히 그대로 것으로 밝혀졌다. 따라서 조직 내에서 borosilicate 유리에 대한 파손이 발생하지 않으며,이 시스템 구성 요소의 연결에 결함 있었다. 그 바늘에 연결된 실리콘 튜브의 짧은 길이 10. L 호수 가득한 해밀턴 주사기는 microcannula에 연결된 폴리에틸렌 튜브의 절단 끝에 부드러운 흐름을 적용하기 위해 사용되었습니다. microcannulas의 모든 열두이 계속 흐름을 허용하고 막는 것으로 나타나지 않았다. 또한, 동물에서 각 걸레를 제거 후 남아있는 솔루션의 볼륨 측정 걸레의 흐름 속도 (0.125 μL / HR)과 그것이 작동하는 허용했습니다 시간의 금액에 대한 적절한 것을 알았습니다.
생체내 전달에
빠른 그린과 주입 조직의 코로나 부분의 평가는 특정 시점 (12 시간, 1 일, 2 일, 4 일)에서 그룹 내에서 동물 사이의 배포판에 약간의 변화를 보여주었다. 그림 5 나흘 동안 염료 침투에 진보적인 증가를 보여주는 이러한 시간 지점에서 빠른 그린 확산의 대표적인 영역을 보여줍니다. 따라서 시간이 지남에 따라 microinfusion 시스템의 기능의 정확한 평가를 왜곡, 실질의 급속한 opacification 결과 - 빠른 그린의 높은 농도 (15 % 예, 5)를 사용하기 전에 실험합니다. 1 % 염료 확산의 전체 범위를 정확하게 총 검사에서 확인하기 어려울 수 있지만, 침투 영역 2.5X 배율에서 쉽게 뚜렷한되었고, 그림 5의 점선 라인 표시됩니다.
그림 5 : 빠른 그린의 지속 microinfusion의 생체내 demonstation에서. (A) 열두 시간 빠른 그린 - 로드된 microinfusion 시스템의 intrastriatal 배치 후, 염료는 microcannula 사이트를 둘러싼 실질에 diffusing 볼 수 있습니다. 일일 (B) 2 일 (C), 4 일 (D)에서 관찰 염료의 침투의 증가 분야와 빠른 그린 솔루션의 지속적인 전송을 나타냅니다. 확산의 바깥쪽 한도는 저전력 현미경 하에서 관찰되었으며 점선 라인을 이곳에 표시됩니다. 스케일 바, 2mm.
외상과 반응 gliosis 평가
자른, 흠없는 조직 섹션의 총 관찰 microinfusion 시스템 납품 현장화된 외상의 감소 것으로 나타났다. 표준 정맥은 결국에 혼란과 더 나은 H & E (그림 6D & E)과 높은 전력 평가는 조직의 큰 영역 (그림 6B & C)을 치환을 보였다. 또한, 혈액 자주 vasculature에 손상의 큰 학위를 제안하고 혈액 뇌 장벽의 감소 무결성을 암시, 표준 주입 사이트 (그림 6D)에서 축적된 보였다.
표준 정맥 (그림 6 층)에 비해 microcannula (그림 6G)를 통해 주입의 주변에 GFAP immunoreactivity 감소에 의해 입증으로 microinfusion 시스템은 또한 크게 감소 반응 gliosis 결과. microcannula 유도된 GFAP의 얼룩이 정상 수준 (그림 6H) 이상의 고가 동안 microinfusion 시스템이 고용했을 때, 표준 정맥 배치 및 주입 (6 층)과 반응 gliosis의 인상적인 상승은 보지 않았습니다.
식염 주입 5 일 후에 ivery의 정맥. (A) microcannula는 M 가장 neuroactive 요원 무료, 무제한 흐름을하실 수 있습니다. 50 팁 직경 borosilicate 튜브에서 나온, 아직 일반배송 정맥 (28가, 0.30 ㎜)보다 작은 배의입니다. (B, C)에 의한 큰 지역 조직의 손상을 (화살표) 보여주는 코로나 섹션의 흠없는, 젖은 마운트 (두께 70. M) 표준 정맥 (B) microcannula (C)에 비해. (D, E) H & E 스테인드 섹션의 높은 전력 photomicrographs은 각각 B와 C에 표시됩니다. 표준 정맥은 조직의 큰 영역을 전이하고 같은 병변 구멍 (화살표) 이내에 혈액의 수집에 의해 입증 vasculature에 큰 모욕을 발생하는 데, D의 그림과 같이보다 광범위한 외상성 부상을 일으켰습니다. microcannula으로 인한 병변 그러나, 주입의 사이트에서 조직 상당히 작고 덜 파괴합니다. GFAP에 대해 (F, G, H) Immunofluorescence가 극적으로 표준 정맥의 병변 주위 GFAP + astrocytes의 숫자를 증가 보여줍니다 (F) microcannula (G) 및 일반 unlesioned striatum (H)의 비교. 스케일 바 : A & B, 1mm, D - H, 250 M. "/>.
그림 6 : microcannula에 의한 현지화된 외상은 생리 주입 5 일 후에 일반배송 정맥에 비해. (A) 50 μm의의 팁 직경 borosilicate 튜브에서 나온 microcannula은 일반배송 정맥 (28가, 0.30 ㎜)보다 작은 배의는 아직 대부분의 neuroactive 요원 무료, 무제한 흐름을 수 있습니다. (B) microcannula (C)에 비해 표준 정맥으로 인한 큰 지역 조직의 손상을 (화살표) 보여주는 코로나 섹션 (B, C) 흠없는, 젖은 마운트 (두께 70 μm의). (D, E) H & E 스테인드 섹션의 높은 전력 photomicrographs은 각각 B와 C에 표시됩니다. 표준 정맥은 조직의 큰 영역을 전이하고 같은 병변 구멍 (화살표) 이내에 혈액의 수집에 의해 입증 vasculature에 큰 모욕을 발생하는 데, D의 그림과 같이보다 광범위한 외상성 부상을 일으켰습니다. microcannula으로 인한 병변 그러나, 주입의 사이트에서 조직 상당히 작고 덜 파괴합니다. GFAP에 대해 (F, G, H) Immunofluorescence가 극적으로 표준 정맥의 병변 주위 GFAP + astrocytes의 숫자를 증가 보여줍니다 (F) microcannula (G) 및 일반 unlesioned striatum (H)의 비교. 스케일 바 : A & B, 1mm, D - H 250 μm의.
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Discussion
다양한 연구 했습니다만 혼합, 조직 외상과 혈액 뇌 장벽을 모욕에 대한 배달 정맥의 크기를 줄임으로써 (페리 외., 1993) 감소 것을 증명하고있다, 염증이 감소하고있는 면역 응답 감쇠 (Finsen 외 ., 1991), 그리고 반응 gliosis는 (Nikkhah 외., 1994) 감소됩니다. 우리는 여기서 6 배 통상 사용되는 배달 cannulas의에 비해 감소 직경 microcannula 통해 두뇌 속에 neuroactive 요원의 만성 전달 방법을 제시한다. 우리는이 시스템이 안정화된 시간과 외상과 반응 gliosis의 수준이 급격하게 감소를 통해 대표적인 솔루션을 제공하는 것을 증명하고있다. 이러한 연구는 50m의 최종 팁 직경 배달 정맥을 고용하지만, 작은 팁 지름이 활용 수 있습니다. 이러한 microinfusion 시스템의 기본 미덕은 주입의 주변에 최소한의 충격을 발생하면서, 아주 작은, 이산 대상으로 에이전트를 전달하는 능력이다.
우리가 설명하는 주입 시스템의 구축에 사용되는 microcannulas 쉽게 사용자 정의 - 건설 미리 정해진 길이와 팁 직경과 수 있습니다. microinfusion 시스템 보안, 낮은 프로파일 고정을 허용하고 큰 두개골 페데 스탈에 대한 필요성을 precluding 동물의 두개골의 표면을 준수하도록 설계되었습니다. 수술 상처 따라서 쉽게 따라서 동물에 대한 불편 및 감염의 위험을 모두 줄일 효율 microinfusion의 받침대 위에 봉합 수 있습니다. 또한, 두개골에 시스템을 확보하는 것은 적은 스컬 면적을 필요로하므로, 추가 또는 후속 절차는 큰 받침대의 간섭없이 수행할 수 있습니다.
여기에서 설명한 방법론을 채용하면 하나는, 그러나, 계정 일정한 기술적 고려 사항에 소요됩니다. 기술의 높은 수준이 필요하고, 생산 및 이식 절차는 적은 시간에 효율적으로 그것이 표준 주입 시스템 수 이상입니다. 반면에, 이것은 고정밀 기술을 연습 겪었던 시간 (동물)에 의해 훨씬 더 무거운, 또는 적어도 counterbalanced 수 있습니다. 또 다른 어려움은 microcannula가 거의 모든 직경 사용자 정의할 수 있지만, 매우 작은 루멘과 microcannula가 infusate의 구성 요소 또는 주입 (예, 혈액, 뇌 조직) 동안 발생한 조직을 통해, 방해가 될 수있다는 것입니다. 이 위험은 microcannula 팁이 주입 절차를 수행하는 동안 (infusate solutes의 건조 방지하기 위해 물 또는 식염수 - 포화 면봉을 사용 예) moistened함으로써, 그리고 '피없는 "수술 깨끗한 수행하여 줄어 듭니다.
우리는 것이 좋습니다 청소에로드 될 솔루션의 특정 구성 및 / 또는 점도에 적합한 microcannula 팁 직경 설립 연구원. 이것은 쉽게 프로토콜 (그림 4)에서 설명한 것과 유사한 체외 테스트 시스템을 사용하여 달성하거나, 37 ° C 호수 온천의 조립 시스템을 immersing 및 욕조 구성 및 / 모니터링이나 볼륨을 측정하는 것입니다 시간이 지남에 걸레 내용. 단점은 팁 직경 (예, ~ 10-50 미크론) 매우 작은 특히 경우 microcannula가 상대적으로 약해 때문입니다. 실수로 수술하는 동안 microcannula을 깨는 것은 일반적으로, 전체 시스템을 교체하는 것이 필요 장치를 수리 또는 재구성과 같은 상당히 수술 시간을 연장합니다. 이러한 기술에 숙련된 과학자와 사람하지만 좀처럼 실천 엄격한 방법을 체험 파손.
실험의 결론에서, microinfusion 시스템 microcannula가 손상하고 특허 유지했다는되지 않았음을 보장하기 위해 검사를하실 수 있습니다. 미니 삼투 펌프의 볼륨도 neuroactive 에이전트의 해당 금액이 전달되었음을 보장하기 위해 측정할 수있다, 우리는하지만, 펌프를 재활용하거나 재사용하지 않는 것이 좋습니다. 현재 방법이 성인 쥐에서 보여주는했지만, 충격을 줄이고 고정 이하 스컬 면적이 같은 마우스 또는 젊은 쥐 같은 작은 동물로 실험을 위해 기존의 방법을 통해 바람직 간주 수 있습니다 필요로하는 시스템을 사용합니다.
현재 방법은 실험자에 의해 능력과 기술을 좀 더 고급 수준을 요구하지만, 진도의 명령에 의해 아마 정밀도를 향상하고, 관심 지역에 외상과 관련된 실험 confounds을 최소화하기 위해 제공합니다. 저희 연구실에서는, 우리는 발견 그 실험 개입보다 안정적이고 강력한 효과에이 변환합니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
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신경 과학 문제 13 미니 삼투 펌프 만성 주입 microcannula 빠른 그린Erratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
