ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Как неврологии запросу становится все более изощренными, исследование мозговых структур и схем требует улучшения уровня точности и высокое разрешение. Мы разработали метод получения и имплантация хронических системы вливания в мозг использованием боросиликатного microcannula с наконечником диаметром 50 микрон.
Abstract
Экспериментальные протоколы, используемые при хронических вливание средств нейроактивные в области мозга часто используют мини-осмотического насоса системы. Агенты, как правило, доставляется через канюлю нержавеющей стали с диаметром 0,30 мм или более. Системы использованием канюли такого калибра может наложить травмы область интересов в результате архитектурного повреждения, тем самым угрозу структурную целостность и нормальное функционирование. Как неврологии запросу становится все более изощренными, исследование мозговых структур и схем требует улучшения уровня точности и высокое разрешение. Мы разработали метод получения и имплантация хронических системы вливания в мозг использованием боросиликатного microcannula с наконечником диаметром 50 микрон. Этот метод уменьшает урон к местным условиям и уменьшается реактивная глиоз в месте инфузии. Конфигурация microinfusion системы также может соответствовать поверхности черепа животного, исключающее необходимость в больших черепных пьедесталы, способствуя тем самым закрытием головы разрез и снижения риска инфицирования. Мы демонстрируем надежный устойчивый доставки красителя с представителем молекулярной массой использования в модели пробирке и в естественных исследованиях на крысах.
Protocol
Введение
Прямое вливание нейроактивные агентов позволяет конкретных областей мозга для изучения в обход гематоэнцефалического барьера. Применения этого подхода в области неврологии, разнообразны и включают в себя изменение уровня активности мозга в дискретных субрегионов (Беретта и др., 2004;. Глиддон и др., 2005;.. Ким и др., 2000), исследуя действия психотропных препаратов ( Клинтон и др., 2006;.. Ди Бенедетто и др., 2004), обеспечивая контролируемое моделей воспаление мозга (Гаусса-Wegrzyniak и др., 1998;. Marchalant и др., 2007;.. Рози и др., 2004), изучая механизмы наркомании (Ким и др., 2005;. Локман и др., 2005;. Чжан и др., 2006.), и позволяет длительное применение трофических факторов (Naert и др., 2006;.. Radecki и др., 2005; Такахаши и соавт., 2006).
Стандартные методы для хронических доставки агентов часто используют мини-осмотического насоса (например, Alzet Осмотические Насосы, Купертино, штат Калифорния), загружаемые с агентом нейроактивные, которая поставляется в мозг через канюлю из нержавеющей стали с диаметром, который может находиться в диапазоне от 0,25 мм (Уильямс и др., 1987.) до 0,5 мм, но чаще всего составляет около 0,3 мм (пластмассы Один из них, Роанок, Вирджиния, см. рис 6А). Хотя доставка канюли такого размера могут быть пригодны для многих приложений, в которых высокий уровень точности не требуется, и травмы микроокружения не является основной проблемой, эти канюли неоптимальных для доставки агентов для малых, тонкий сайтов, в которых Канюля сопоставима по размеру (или больше) целевых сама структура, или там, где функция не должна быть скомпрометирована травматического оскорбление.
Представленный здесь метод подготовки и внедрения системы хронических настой для доставки агентов нейроактивные в мозге использованием "microcannula" со значительно уменьшается диаметр кончика. Эта техника позволяет малым подструктур быть направлены и снижает травмы из области интереса. Настоящая процедура, таким образом, научил, как альтернативу традиционным методам для исследователей, желающих свести к минимуму нарушения в области мозга, ведется расследование.
Материалы и методы
Животные и дизайн
Восемнадцать взрослых (400-450 г) мужчин Sprague-Dawley крыс были использованы для демонстрации процедуры и тестирования функции нынешнего метода. Двенадцать животных были имплантированы microinfusion системы и способствовало временной оценке курса устойчивого функции в течение 4 дней. Шесть животных были использованы для сравнения уровня травмы и реактивной глиоз 5 дней после имплантации либо стандартный 28 га доставки канюли (N = 3) или microcannula (N = 3), подключенных к заполненные физиологическим раствором мини-осмотического насоса. Животные были помещены в прозрачные пластиковые клетки, и поддерживается на 12-часовой светлый / темный графику, с пищей и водой при условии, вволю. Все процедуры были одобрены больнице Маклина Институциональные уходу и использованию животных комитета, в соответствии с действующими федеральными и местными руководящими принципами для экспериментального использования животных.
Microinfusion сборки системы
На рисунке 1 показаны компоненты и сборку microinfusion системы. Мы рекомендуем строительства и имплантации системы с использованием стерильной техники. Кроме того, в целях предотвращения введения воздуха в системе, он собирается при погружении в солевые ванны. Пока тестов, мини-осмотического насоса (СС) были заняты (Alzet модель № 1002, г. Купертино, штат Калифорния) с 14-дневный срок, расход 0,25 мкл / ч, и заполнить мощностью 98,6 мкл. Однако, так как чрезмерный расход может потоп меньших областях, представляющих интерес в мозг и вызвать структурные повреждения, скорость потока для этих исследований была снижена до 0,125 мкл / час, покрывая половину СС с парафином в соответствии с инструкциями производителя. Для оценки местной травмы, СС были заполнены стерильным физиологическим раствором. Для оценки устойчивого функции microinfusion системы, Fast Зеленый (1% в физиологическом растворе, Fisher Scientific, Park Lane Питтсбурге, штат Пенсильвания) была выбрана в качестве тест решение из-за его низкой токсичностью, его способность к диффузии в пределах жизнеспособных тканей головного мозга, и потому, что имеет молекулярную массу (808,84) в верхней части диапазона для "малых молекул" (<1000), которые обычно представляют интерес для хронических инфузии (например мусцимола, пикротоксина, флуоксетин и др.).
Рисунок 1: АсемБлай из microinfusion системы. (А) компоненты системы размещены в их относительные положения для сборки. Обратите внимание, фланец от трубки modulater поток был разбит прочь. Мы рекомендуем выравнивание проволоки быть обеспечены непосредственно перед имплантацией (см. текст). (B) Собранный microinfusion системе до крепления проволоки выравнивание и имплантации.
Microcannula подготовки
Microcannula моделируются с использованием стандартного горизонтального или вертикального электрода съемник (Stoelting Компания Wood Dale, Иллинойс) с настройками для производства стеклянного электрода с длинными, слегка сужающийся голени (рис. 2А). Боросиликатное трубка подходит для этой цели (часть 1B100F-6, 1,0 мм, 6 в; инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида), так как она имеет относительно низкую температуру плавления, что позволяет последующего изгиба с целенаправленным тепла. Дистальной-самые часть прямо microcannula можно разрезать ножницами или рассечение контролируемой перерыв может быть сделан с microforceps (инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида), чтобы дать желаемый конечный диаметр наконечника (50 мкм для настоящих демонстраций ), и микрометра микроскопа полезна для руководства и подтвердить желаемого диаметра. Вырезать наконечник может быть кратко подогревом, или "огневой полировкой", чтобы удалить грубые или острые края. Нагревательная спираль из съемника электрода или горелки Бунзена затем используется для наложить прямым углом на microcannula на определенном расстоянии от кончика microcannula (рис. 2B), поместив боросиликатного трубы в нагревательной спирали (или пламени Бунзена ) и применяя мягкой силы в дистальной части щипцами, как трубка нагревается. Предопределено длина microcannula дистальнее введенных прямым углом решается на основе глубины головного мозга оказываются мишенью (например, 5 мм) и с учетом толщины черепа (~ 1 мм) и рабочим расстоянием выше черепа ( например, 1-2 мм). Таким образом заданное расстояние от кончика microcannula к прямым углом, введенные для настоящего демонстраций было 7-8 мм. Карандаш алмазный затем используется, чтобы сократить боросиликатного трубки примерно 8 мм проксимальнее прямым углом.
Рисунок 2: Подготовка microcannula. (А), электрод съемник (Stoelting компания Wood Dale, Иллинойс) используется для производства microcannula с длинными, сужающийся голени. (B) нагревательная спираль может быть переориентированы для простоты использования, и microcannula помещается в катушку, позволяя правом угле изгиба, который будет сформирован использованием щипцов, как стеклянные трубки нагревается.
После необходимое количество микроканюли было сделано, мы рекомендуем стерилизацию окисью этилена или использование автоклава. Дистальной-самые 1-2 мм microcannula могут быть окрашены стерильных хирургических маркера (или постоянные чернила до стерилизации), чтобы кончик microcannula легко визуализируется во время хирургической операции.
СС подготовки
СС были подготовлены в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, пластиковый фланец из труб из нержавеющей стали СС ("поток модулятором") сначала удалить с помощью ножниц или rongeurs. Длина трубы из полиэтилена (пластмассы Один из них, Роанок, Вирджиния, # C312 VT; OD, 1,22 мм; ID: 0,72 мм) крепится к области трубки из нержавеющей стали, ранее занятые фланца (~ 4 мм), вставляя нержавеющей стальных труб в просвет трубы из полиэтилена и обеспечения с подходящим клеем вокруг внешней окружности соединения. LumaBond (myNeuroLab, Inc, Сент-Луис, Миссури) особенно полезен, поскольку он лечит в течение нескольких секунд под воздействием сфокусированный свет (например, от волоконно-оптических лампы). Длина труб должно быть приблизительно расстояние между основанием черепа животного и ростральной-самый аспект лопатки (например, примерно 1,5-3,0 см для лабораторных крыс). Насос заполняется в соответствии с инструкциями, а также труб из нержавеющей стали Alzet, при длине полиэтиленовой трубы прилагается к своему концу, вставляется в насос заполнен. Небольшой объем раствора от насоса будут вынуждены вокруг внешней насос-трубка интерфейс (и должны быть вонзилась в гостях), а также в проксимальной области полиэтиленовых труб. Заполненный насос с прикрепленными трубка затем инкубировали в стерильном физиологическом растворе в течение 12 часов при температуре 37 ° C. Если насос работает нормально, после этого инкубационного периода, жидкость будет видно, прошли несколько миллиметров в полиэтиленовых труб.
Строить ион microinfusion системы
Насос с приложением ее трубки погружают в 10 см, чашка Петри содержащие стерильный физиологический раствор, а оставшиеся воздуха внутри полиэтиленовой трубы удаляется с помощью шприца заполнить тем же раствором, содержащиеся в насос и который был оснащен малого диаметра трубы которые могут быть вставлены в полиэтиленовых труб. Решение может таким образом быть введен в полиэтиленовые трубы для замены воздуха. Точно так же microcannula погружается в солевой ванне и воздух удаляется путем инъекции раствора. Это легко достигается с Второе решение заполненный шприц снабжен гибким (например, силиконовые) трубки, который надевается на большой (проксимальный) конец microcannula.
Проксимальный конец трубки из боросиликатного затем вставляется в полиэтиленовую трубу. Обратите внимание, что для этого может потребоваться расширение полиэтиленовые трубы с усилием нажатия закрытыми кончиками microforceps в просвет тем самым сжигание открытия для простой вставки боросиликатного труб. Воздуха без инфузионной системы затем удаляются из солевых ванн и помещен на стерильной поверхности и мягко сухой марлей или ватным тампоном. Microcannula-полиэтиленовые трубы надежности соединения с окружной слой клея (например, LumaBond).
Если система собрана правильно, и если СС продолжает функционировать, как и положено, в течение последнего шага этой процедуры капли раствора, как правило, появляются на кончике microcannula как осмотического механизма в насос продолжает в процессе приготовления. СС расход может быть уменьшен пропорционально путем нанесения соответствующей площади поверхности с парафином в соответствии с инструкциями производителя. В настоящее демонстраций, 50% каждого СС была покрыта кратко Данкинг его в расплавленный парафин и позволяя ему остыть, тем самым уменьшая расход в два раза до 0,125 мкл / час. Завершено microinfusion система затем погружен в стерильного физиологического раствора и хранится при температуре 37 ° С до имплантации.
Имплантация microinfusion системы
Microinfusion система внедряется с использованием стандартных методов стереотаксической как описано ранее (Кули, 1990). После подготовки операционного поля, заусенцев отверстие сверлится для ввода microcannula. При желании, череп винты также могут быть расположены по стабилизации связи соединения, используемые для обеспечения microcannula. Соединения, используемые в этой лаборатории (Geribond, Den-Mat Inc, Санта-Мария, штат Калифорния) не требует дополнительного крепления, однако череп поверхность должна быть подготовлена путем очистки с acetonedampened ватным тампоном. 1-2 мм в диаметре "зацепить" производится на дистальном конце выравнивания проволоки (см. рис. 1), что позволяет ему окружить изгиб боросиликатного труб. Он затем фиксируется (с использованием LumaBond), в ориентации вдоль одной оси с дистальной части microcannula (то есть быть выдвинуты в мозг, см. рис. 3B). Инфузионной системы, затем монтируются на стереотаксической носителя (рис. 3), зажимая выравнивания проволоки в держатель. Стерильные шов используется для троса инфузионного насоса в начало стереотаксического манипулятора, таким образом, приостановление его и предотвращения потери ориентации во время процедуры из-за веса (и крутящего момента) насоса (рис. 3В). Microcannula могут быть расположены в требуемом направлении (например, именно вертикальный) с помощью щипцов, чтобы аккуратно согнуть проволоку выравнивание дистальнее перевозчика зажимом. Наконечник microcannula располагается над точкой (например, брегмы или лямбда), а затем маневрировать в точке входа в головной мозг. Координат, используемых для животных в этих экспериментах были: брегмы 0,2 мм, боковые 3,2 мм, и вентральной 5,0 мм под оболочки с головой животного в череп плоский позиции.
После microcannula выдвигается на соответствующей глубине в пределах мозга, система закреплена в правильном положении с пьедестала соединения (например, Geribond). Пьедестал может быть скульптурными близко к поверхности черепа для облегчения закрытия раны. После пьедестала соединения вылечил (~ 2 мин), выравнивание проволоки режется на одном уровне с пьедестала использованием режущего диска сверлить в. Небольшое количество соединение может быть использована для покрытия и гладкой оставшиеся шип из отрубленной проволоки. СС затем вставляется под кожу, расположенную между лопатками животного. Наконец, промывали рану стерильным физиологическим раствором, а разрез закрыт с помощью шва или рана клипов (рис. 3, панель D).
croinfusion Система позиционируется для размещения и фиксации в животное. (D) дизайн microinfusion система позволяет легко закрытия разреза более низкопрофильным пьедестал, что снижает риск заражения и минимизации неудобств для животных. "Ширина =" 511 "высота =" 381 "/>
Рисунок 3: Имплантация microinfusion системы. (А) Позиционирование microinfusion системы на стереотаксического прибора. (B) СС привязанный использованием стерильных шовных, чтобы предотвратить его веса от нарушения ориентации microcannula. Microcannula позиционируется для точного вертикального вступления в мозга с помощью выравнивания проволоки. (C) microinfusion система позиционируется для размещения и фиксации в животное. (D) дизайн microinfusion система позволяет легко закрытия разреза более низкопрофильным пьедестал, что снижает риск заражения и минимизации неудобств для животных.
Подготовка и внедрение стандартной системы инфузии
Порядок подготовки стандартной системы вливания идентична той, что для microinfusion системе, за исключением microcannula заменяется "осмотического насоса разъем канюли" с диаметром 300 мкм (28 га; пластмассы Один из них, Роанок, Вирджиния, # 3300PM / SPC, см. рис 5а). Имплантация стандартная система также идентична microinfusion системы, включая прикрепление выравнивания проволоки для точной вертикальное положение канюли вступления в мозг.
Гистологии и анализ
Изучить возможность microinfusion системы обеспечить устойчивый доставки Быстрый зеленый, группами по три животных забивали через 12 ч, 1 день, 2 дня, а через 4 дня после операции. Субъекты были глубоко под наркозом с фенобарбиталом натрия (120 мг / кг, внутрибрюшинно) и transcardially перфузии 200 мл 0,1 М фосфатным буферным раствором (PBS), затем 400 мл 4% параформальдегида в буфер 0,1 М фосфат. Перфузионные растворы хранились при температуре 4 ° С, при рН 7,4 и перфузии в размере 50 мл в минуту с использованием перистальтического насоса. Для удаления канюли, не повреждая посмертных тканях, перфузия животного был зафиксирован в стереотаксической рамы, пьедестал был обеспечен с клеем для жесткой проволокой к зажим манипулятора, а череп был тщательно удалить со всего пьедестал использованием стоматологических заусенцев. Пьедестал и основные канюли были удалены таким образом по той же траектории, в которой канюля была выдвинута на размещение. Мозги затем были удалены из черепа и погружают на 12 часов в том же фиксатора.
Для оценки устойчивого вливание Быстрый зеленый, участки с толщиной 200 мкм были вырезаны использованием Vibratome (myNeuroLab, Сент-Луис, Миссури) и мокрого установлены на стеклах. Представитель разделы были обследованы использованием Canon CanoScan LiDE 600F сканера. Для оценки местного травмы и реактивной глиоз, 70μm разделы Vibratome впервые были мокрые монтаж и сфотографировали неокрашенные ткани, чтобы предотвратить искажения, которые могут произойти с гистологическим процессы, такие как сушка, окрашивание, и обезвоживание. Эти же разделы были затем высушить на их желатин покрытием стеклянные пластинки, и они были окрашены гематоксилином и эозином (H & E), обезвоживали градуированных спирты, и кавер-замазали Permount.
Прилегающие 70 разделов мкм прошли стандартные процедуры иммунофлюоресценции для выявления глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP), которая выражается астроциты в процессе реактивной глиоз в ответ на травму (Дин и др., 2000;.. Ма и др., 1991). Одним словом, свободно плавающих разделы промывали PBS и блокировали с 10% нормальной сыворотки осла (НСР) и 3% бычьего сывороточного альбумина в 0,1 М PBS с 0,3% Тритон Х-100 (PBS / Тритон) в течение одного часа, а затем инкубировали в кролика против GFAP антител (1:500; Сигма Кемикал Ко, Сент-Луис, Миссури) в PBS / Triton с 1% НДС в течение 12 часов при температуре 4 ° C. Срезы затем промывали PBS и инкубировали с Alexa Fluor 594 ® осла antirabbit вторичных антител (1:500; Molecular Probes, Inc, Eugene, OR) в PBS с 5% НДС в течение одного часа при комнатной температуре. Срезы тщательно промыть снова PBS и контрастно с NeuroTrace ® зеленого флуоресцентного Нисслю пятно (1:500 в PBS в течение 5 минут; Molecular Probes, Inc, Юджин, OR). После окончательного полоскания с PBS, разделы были смонтированы на желатин покрытием слайды и coverslipped с медленной-Fade (Molecular Probes). Все микрофотографии были приобретены с помощью микроскопа Zeiss Axioskop с AxioVision программного обеспечения (Carl Zeiss, Inc Торнвуд, Нью-Йорк).
Результаты
В пробирке тестирования
До оценки у животных, три системы microinfusion были подготовлены, разместив свою Быстрый зеленый заполненные СС в в одном купе (15 мл коническую трубку) и размещение их в микроканюли второй отсек (1 мл Эпп Endorf труба), каждая из которых содержит стерильного физиологического раствора при температуре 37 ° C. Каждая система демонстрировала непрерывный поток красителя в течение 12 часов наблюдения. На рисунке 4 показана функция типичной системы в течение 3 часов.
Рисунок 4: В пробирке демонстрация microinfusion функции системы. (А) поток быстрых Зеленая краска легко видеть беспрепятственный от microcannula в начале в период испытаний пробирке. (Б) Как поток продолжается, резервуар раствор становится насыщенным (B), и в конечном счете непрозрачным с окраской (С).
Оценка в системе microinfusion естественных условиях
После перфузии, удалены микроканюли и их соединения были тщательно осмотрены, и все оказались совершенно нетронутыми. Таким образом, произошла поломка не боросиликатного стекла в тканях, не было никаких дефектов в связи компонентов системы. 10. L заполненные физиологическим раствором Гамильтон шприц с короткой длиной кремния трубки придает его иглы был использован для применения нежный поток обрезанный конец полиэтиленовой трубы прикреплены к microcannula. Все двенадцать микроканюли позволил продолжающийся поток и, казалось, не быть закрыты. Кроме того, после удаления каждого СС от животных, объем оставшийся раствор был измерен и признан подходящим для потока СС в скорости (0,125 мкл / ч) и количество времени, которое было разрешено функционировать.
В естественных условиях доставки
Оценка корональных участков ткани переплетаются с быстрой Зеленый проявляли большой изменчивости в распределении между животными внутри групп в любой данный момент времени (12 часов, 1 день, 2 дня, и 4 дня). Рисунок 5 иллюстрирует представитель областях Быстрый зеленый диффузии на этих временных точек показывает постепенное увеличение проникновения красителя в течение четырех дней. Обратите внимание, что до экспериментов с использованием более высоких концентраций Быстрый зеленый (например, 5 - 15%) привело к быстрому помутнение паренхимы, тем самым скрывая точной оценки функции microinfusion системы с течением времени. Хотя в полной мере на 1% красителя диффузии может быть трудно точно определить, на валовой инспекции, зоны проникновения были легко заметных на 2.5X увеличение, и обозначены пунктирными линиями на рисунке 5.
Рисунок 5: В естественных условиях demonstation устойчивого microinfusion быстрых Грин. () Двенадцать часов после intrastriatal размещения Быстрый зеленый загружены microinfusion системы, краситель видел диффундирующих в паренхиму окружающих сайта microcannula. Наблюдения на 1 день (B), 2 дня (C), и 4 дня (D) указывают на продолжающийся доставки Быстрый зеленый раствор с увеличением области проникновения красителя. Внешняя граница диффузии наблюдается при низких-силовой микроскопии и показан здесь с пунктирными линиями. Шкала бар, 2 мм.
Оценка травмы и реактивной глиоз
Валовой наблюдения свежесрезанных, неокрашенные срезах тканей показал, что microinfusion системы привело к сокращению в локализованных травм на месте доставки. Стандартные канюли неизменно видел, чтобы сорвать и заменить большую площадь ткани (рис. 6Б & C), что лучше оценены на высшие силы с H & E (рис. 6D & E). Более того, кровь часто видели, накопленных на стандартный сайт инфузии (рис. 6, г), что предполагает более высокую степень компромисса сосудистую и подразумевая снизилась целостности барьера головного мозга.
Microinfusion системы также привело к значительно уменьшается реактивная глиоз о чем свидетельствует снизилась иммунореактивности для GFAP в непосредственной близости от вливания через microcannula (рис. 6G) по сравнению с стандартной канюли (рис. 6F). Хотя microcannula вызванных GFAP окрашивания был возведен выше нормального уровня (рис. 6H), поразительное эскалации реактивной глиоз со стандартным размещением канюля и инфузионные (6F) не было видно, когда microinfusion система работала.
ivery канюлю после 5 дней солевой инфузии. (А) microcannula вытащил из боросиликатного труб с диаметром кончика 50. М позволяет бесплатно, неограниченный поток большинство агентов нейроактивные, все же 6X меньше, чем стандартный комплект поставки канюли (28 га, 0,30 мм). (В, С) Необработанный, мокрый монтирует корональных разделах (толщина, 70. М), иллюстрирующие больше местное повреждение тканей (стрелки), вызванные стандартной канюли (B) по сравнению с microcannula (С). (D, E) Повышенная мощность микрофотографии H & E окрашенных срезов показаны на В и С, соответственно. Стандартные канюли вызвано более обширные травмы, как показано на D, сместив большую площадь, ткани и вызывая большее оскорбление сосудистую о чем свидетельствует сбора крови в поражении полости (стрелка). Поражение вызвано microcannula, однако, значительно меньше и меньше вреда ткани в месте инфузии. (F, G, H) иммунофлуоресценции против GFAP демонстрирует резко возросло количество GFAP + астроцитов вокруг поражение стандартной канюли (F), когда по сравнению с microcannula (G) и нормально, unlesioned полосатого тела (H). Шкала бары: & B, 1 мм, D - H, 250 м "/>.
Рисунок 6: Локализованная травма вызвана microcannula по сравнению со стандартной канюли доставки после 5 дней солевой инфузии. () Microcannula вытащил из боросиликатного трубки с диаметром кончика 50 мкм дает возможность свободного, неограниченного потока большинство агентов нейроактивные, все же 6 раз меньше, чем стандартный комплект поставки канюли (28 га, 0,30 мм). (В, С) Необработанный, мокрый монтирует корональных секций (толщина 70 мкм), иллюстрирующие больше местное повреждение тканей (стрелки), вызванные стандартной канюли (B) по сравнению с microcannula (С). (D, E) Повышенная мощность микрофотографии H & E окрашенных срезов показаны на В и С, соответственно. Стандартные канюли вызвано более обширные травмы, как показано на D, сместив большую площадь, ткани и вызывая большее оскорбление сосудистую о чем свидетельствует сбора крови в поражении полости (стрелка). Поражение вызвано microcannula, однако, значительно меньше и меньше вреда ткани в месте инфузии. (F, G, H) иммунофлуоресценции против GFAP демонстрирует резко возросло количество GFAP + астроцитов вокруг поражение стандартной канюли (F), когда по сравнению с microcannula (G) и нормально, unlesioned полосатого тела (H). Шкала бары: & B, 1 мм, D - H, 250 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Различные исследования показали, что за счет уменьшения размера доставки канюли для внутримозговых настои, ткани травмы и оскорбление барьер мозга крови уменьшается (Perry и соавт., 1993), воспаление уменьшается, и иммунной ответ ослабленного (Finsen и др. ., 1991), и реактивной глиоз уменьшается (Nikkhah и соавт., 1994). Мы приведем здесь метод хронического доставки агентов нейроактивные в мозг через microcannula с диаметром, который уменьшается в 6 раз по сравнению с обычным используемым канюли доставки. Мы показали, что эта система надежно обеспечивает представителя решение с течением времени и уровень локализованной травмы и реактивной глиоз резко сокращается. Эти исследования занятых доставкой канюли с конечным диаметром кончика 50 м, но меньшего диаметра наконечника могут быть использованы. Первичного силу таких систем microinfusion является их способность доставлять агентов очень мало, дискретные цели, в то время как каких-минимальной травмы в непосредственной близости от вливания.
Микроканюли, используемые в строительстве инфузионной системы мы описываем может быть легко заказ с заданными длиной и наконечник диаметра. Microinfusion системы сконструированы в соответствии с поверхности черепа животного обеспечивая безопасный, низкопрофильный фиксацию и исключает необходимость большого черепа пьедестала. Хирургические раны поэтому может быть легко зашивается более обтекаемый пьедестал microinfusion, тем самым снижая как дискомфорт животных и риск инфицирования. Кроме того, обеспечение системы череп требует меньше площадь поверхности черепа, поэтому дополнительных или последующих процедур может быть выполнена без вмешательства со стороны больших пьедестала.
Следует, однако, принимать во внимание некоторые технические соображения при использовании методики, описанной здесь. Высокий уровень навыков, необходимых, а также производство и внедрение процедура менее эффективный по времени, чем это может быть для стандартных систем инфузии. С другой стороны, это может быть перевешивают, или по крайней мере уравновешен, к тому времени (и животных) пощадили, практикуя высокоточной техники. Другая трудность состоит в том, что в то время как microcannula могут быть настроены с практически любого диаметра, microcannula с очень небольшой просвет может стать затруднен, либо компоненты инфузата или тканей, возникшие в ходе имплантации (например, кровь, ткани мозга). Этот риск снижается, держа кончик microcannula влажной (например, с использованием воды или физиологического раствора насыщенного ватный тампон, чтобы предотвратить высыхание инфузата растворенных веществ) во время процедуры имплантации и выполняя чистые, "кровь без" хирургического вмешательства.
Мы рекомендуем, чтобы исследователь установить диаметр microcannula наконечник, который подходит для конкретного состава и / или вязкости раствора, который будет загружен в СС. Это легко достигается за счет использования в пробирке тест системы, аналогичной описанной в протокол (рис. 4), или просто погружение собранной системе в 37 ° C солевые ванны и мониторинг состава ванной и / или измерения объема СС содержания с течением времени. Недостатком является то, что microcannula сравнительно хрупкие, особенно, если ее диаметр кончика очень мала (например, ~ 10-50 мкм). Случайно нарушение microcannula во время операции обычно требуется, чтобы вся система будет заменена, как ремонт или восстановление, что подразделение будет продлить время операции значительно. Ученые специалистов в таких методов, и, кто практикует метод требовательный редко испытывают поломки, однако.
По завершении эксперимента, microinfusion система может быть проверено, что в microcannula не был поврежден и что он остался патент. Объем мини-осмотического насоса также может быть измерена, чтобы соответствующее количество агента нейроактивные был доставлен, мы не рекомендуем рециркуляции или повторного использования насосов, однако. Хотя современные методы были продемонстрированы у взрослых крыс, использование системы, которая сокращает травмы и требует меньше площадь поверхности черепа для фиксации может быть отдано предпочтение перед традиционными методами для экспериментов с более мелкими животными, такими как мыши или молодых крыс.
Хотя данный способ требует несколько более продвинутый уровень знания и навыки, экспериментатор, он предлагает увеличить точность возможно, на порядок, и свести к минимуму экспериментальных смешивает связанные с травмой области интереса. В нашей лаборатории, мы обнаружили, что это приводит к более надежной и прочной последствий экспериментального вмешательства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
Tags
Neuroscience выпуск 13 мини осмотического насоса хронический инфузии microcannula быстро зеленыйErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
