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Summary
के रूप में तंत्रिका विज्ञान जांच हो जाता है और अधिक परिष्कृत मस्तिष्क संरचना की जांच, और circuitry सटीकता और उच्च संकल्प के स्तर में सुधार की आवश्यकता है. हम तैयारी और मस्तिष्क के भीतर एक पुरानी जलसेक प्रणाली 50 microns के एक टिप व्यास के साथ एक borosilicate microcannula उपयोग के आरोपण के लिए एक तरीका विकसित किया है.
Abstract
प्रयोगात्मक मस्तिष्क के क्षेत्रों के भीतर neuroactive एजेंटों की पुरानी प्रेरणा के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल अक्सर एक मिनी आसमाटिक पंप प्रणाली का उपयोग. एजेंटों आमतौर पर 0.30 मिमी या अधिक की एक व्यास के साथ एक स्टेनलेस स्टील प्रवेशनी के माध्यम से वितरित कर रहे हैं. इस क्षमता का एक प्रवेशनी उपयोग सिस्टम आघात वास्तु नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप ब्याज के क्षेत्र थोपना, जिससे संरचनात्मक अखंडता और सामान्य कामकाज समझौता हो सकता है. के रूप में तंत्रिका विज्ञान जांच हो जाता है और अधिक परिष्कृत मस्तिष्क संरचना की जांच, और circuitry सटीकता और उच्च संकल्प के स्तर में सुधार की आवश्यकता है. हम तैयारी और मस्तिष्क के भीतर एक पुरानी जलसेक प्रणाली 50 microns के एक टिप व्यास के साथ एक borosilicate microcannula उपयोग के आरोपण के लिए एक तरीका विकसित किया है. इस तकनीक को स्थानीय पर्यावरण को नुकसान कम कर देता है और लगाने की साइट पर प्रतिक्रियाशील gliosis घटता है. microinfusion प्रणाली के विन्यास भी जानवर की खोपड़ी की सतह के अनुरूप, बड़ी कपाल pedestals के लिए की जरूरत precluding है, इस तरह खोपड़ी चीरा को बंद करने की सुविधा और संक्रमण के जोखिम को कम करने में सक्षम है. हम एक प्रतिनिधि आणविक इन विट्रो मॉडल में और चूहों में vivo अध्ययन में एक का उपयोग कर वजन होने डाई के विश्वसनीय निरंतर डिलीवरी प्रदर्शित करता है.
Protocol
परिचय
Neuroactive एजेंट के प्रत्यक्ष जलसेक जबकि रक्त मस्तिष्क बाधा को दरकिनार विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. तंत्रिका विज्ञान में इस दृष्टिकोण के आवेदन में विविध रहे हैं और असतत उपक्षेत्र में मस्तिष्क गतिविधि के स्तर (Berretta एट अल, 2004; Gliddon एट अल, 2005;. किम एट अल, 2000) में फेरबदल, मादक एजेंट की कार्रवाई की जांच ( . क्लिंटन एट अल, 2006;. Marchalant एट अल, 2007;. डि Benedetto एट अल, 2004), मस्तिष्क में सूजन (Hauss Wegrzyniak एट अल, 1998 नियंत्रित मॉडल प्रदान Rosi एट अल, 2004), तंत्र का अध्ययन लत के (किम एट अल, 2005; Lockman एट अल, 2005, झांग एट अल, 2006), और पौष्टिकता संबंधी कारकों (Naert एट अल, 2006 के प्रशासन को सक्षम करने के लंबी अवधि;. Radecki एट अल, 2005; Takahashi अल एट, 2006).
एजेंटों की पुरानी वितरण के लिए मानक तरीकों अक्सर एक मिनी आसमाटिक पंप (जैसे, ALZET आसमाटिक पंप्स, Cupertino, CA) neuroactive एजेंट, जो मस्तिष्क के भीतर एक व्यास है कि सीमा सकता है के साथ एक स्टेनलेस स्टील प्रवेशनी के माध्यम से वितरित किया जाता है के साथ लोड का उपयोग 0.25 से (विलियम्स एट अल, 1987) मिमी 0.5 मिमी है, लेकिन सबसे अधिक लगभग 0.3 मिमी (एक प्लास्टिक, Roanoke, VA, 6A चित्र देखें). जबकि इस आकार के वितरण cannulas में जो परिशुद्धता के उच्च स्तर की आवश्यकता है और microenvironment को आघात नहीं कर रहे हैं कई अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है एक प्रमुख चिंता का विषय नहीं है, इन cannulas छोटे, नाजुक साइटों जिसमें प्रवेशनी तुलनीय है के लिए एजेंट को देने के लिए suboptimal कर रहे हैं आकार में (या से बड़ा) लक्षित संरचना ही है, या जहां समारोह दर्दनाक अपमान से समझौता नहीं किया जाना चाहिए.
यहाँ प्रस्तुत तैयारी और neuroactive एजेंटों के मस्तिष्क के भीतर एक बहुत कम टिप व्यास के साथ एक microcannula "का उपयोग वितरण के लिए एक पुरानी प्रेरणा प्रणाली के आरोपण के लिए एक विधि है. इस तकनीक छोटे substructures को लक्षित किया जा अनुमति देता है और हित के क्षेत्र के लिए आघात को कम कर देता है. वर्तमान प्रक्रिया इस प्रकार शोधकर्ताओं ने जांच के तहत मस्तिष्क क्षेत्र में व्यवधान कम से कम इच्छा के लिए पारंपरिक तरीकों के लिए एक विकल्प के रूप में सिखाया जाता है.
सामग्री और विधियों
पशु और डिजाइन
अठारह (400-450 ग्राम) वयस्क नर चूहों Sprague-Dawley प्रक्रिया प्रदर्शन और वर्तमान पद्धति का समारोह का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. बारह जानवरों microinfusion प्रणाली के साथ प्रत्यारोपित किया गया और 4 दिनों में निरंतर कार्य समय पाठ्यक्रम के एक मूल्यांकन करने के लिए योगदान. छह जानवरों के लिए और 5 दिन या तो एक मानक 28 गा वितरण (3 = एन) प्रवेशनी या एक microcannula (3 = एन) के आरोपण के बाद प्रतिक्रियाशील gliosis आघात के स्तर की तुलना इस्तेमाल किया गया एक नमकीन से भरे मिनी आसमाटिक पंप से जुड़ी है. पशु स्पष्ट प्लास्टिक पिंजरों में रखे जाते थे, और 12 घंटे एक प्रकाश / अंधेरे अनुसूची पर भोजन और पानी विज्ञापन libitum प्रदान के साथ बनाए रखा. सभी प्रक्रियाओं मैकलीन अस्पताल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया पशुओं के प्रायोगिक उपयोग के लिए लागू संघीय और स्थानीय दिशा निर्देशों के साथ अनुपालन में.
Microinfusion प्रणाली विधानसभा
चित्रा 1 microinfusion प्रणाली के घटकों और विधानसभा दिखाता है. हम निर्माण और बाँझ तकनीक का उपयोग कर प्रणाली को दाखिल करने की सलाह देते हैं. इसके अलावा, आदेश में इस प्रणाली में हवा की शुरूआत को रोकने के लिए, जबकि एक नमकीन स्नान के भीतर डूबे हुए इकट्ठा किया है. वर्तमान परीक्षण के लिए, मिनी आसमाटिक पंप (MOPS) (ALZET 1002 # मॉडल, Cupertino, CA) एक 14 दिन की अवधि के प्रवाह की दर 0.25 μL / घंटा, और 98.6 μL के भरण क्षमता के साथ कार्यरत थे. हालांकि, मस्तिष्क में रुचि के छोटे क्षेत्रों में जल - प्रलय के बाद से अत्यधिक प्रवाह दरों और संरचनात्मक क्षति, प्रवाह दर के लिए इन अध्ययनों μL .125 / घंटा कोटिंग एमओपी का एक आधा द्वारा कम था आयल के साथ निर्माता द्वारा निर्देश के रूप में पैदा कर सकता है. स्थानीय आघात के मूल्यांकन के लिए, mops बाँझ खारा से भर गया. Microinfusion सिस्टम, फास्ट ग्रीन (खारा में 1%, फिशर साइंटिफिक, पार्क लेन पिट्सबर्ग, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के निरंतर समारोह के मूल्यांकन के लिए की वजह से अपनी कम विषाक्तता, इसके लिए व्यवहार्य मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर फैलाना की क्षमता, और ऐसा इसलिए है क्योंकि एक परीक्षण समाधान के रूप में चुना गया था श्रेणी के ऊपरी अंत में "छोटे अणुओं" (1000 <) है कि आमतौर पर ब्याज की पुरानी जलसेक (जैसे muscimol, picrotoxin, Fluoxetine, आदि) के लिए कर रहे हैं के लिए एक आण्विक वजन (808.84) है.
चित्रा 1: विधानसभाBly microinfusion प्रणाली की. (ए) प्रणाली के घटकों विधानसभा के लिए उनके रिश्तेदार स्थिति में रखा. नोट प्रवाह modulater टयूबिंग से निकला हुआ किनारा दूर टूट गई है. हम अनुशंसा करते संरेखण तार आरोपण पहले ही सुरक्षित (पाठ देखें). (बी) microinfusion प्रणाली पहले संरेखण तार और आरोपण की कुर्की के लिए इकट्ठे.
Microcannula तैयारी
microcannula सेटिंग्स के साथ एक लंबे, धीरे गावदुम टांग (चित्र 2A) के साथ एक गिलास इलेक्ट्रोड उत्पादन के लिए एक मानक क्षैतिज या अनुलंब इलेक्ट्रोड खींचने (Stoelting कं, लकड़ी डेल, आईएल) का उपयोग ढंग से किया जा सकता है. Borosilicate टयूबिंग इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त है (1B100F 6 हिस्सा है, 1.0 मिमी, में 6, विश्व परिशुद्धता उपकरण, Inc, Sarasota, FL), के रूप में यह एक अपेक्षाकृत कम पिघलने बिंदु है, की अनुमति ध्यान केंद्रित गर्मी के साथ झुकने के बाद. एक सीधे microcannula के बाहर का सबसे भाग विच्छेदन कैंची के साथ काटा जा सकता है या एक नियंत्रित तोड़ microforceps (विश्व परिशुद्धता उपकरण, Inc, Sarasota, FL) के साथ बनाया जा सकता है वांछित अंतिम टिप (व्यास दे है वर्तमान प्रदर्शनों के लिए 50 सुक्ष्ममापी ), और एक खुर्दबीन मंच सुक्ष्ममापी के लिए गाइड और वांछित व्यास की पुष्टि करने के लिए उपयोगी है. कटौती टिप संक्षिप्त हो सकता है, गर्म कर सकते हैं या "आग पॉलिश" किसी न किसी या तेज किनारों को हटाने. इलेक्ट्रोड खींचने या एक Bunsen बर्नर के हीटिंग का तार तो microcannula (चित्र 2B) की नोक से एक पूर्व निर्धारित दूरी पर हीटिंग का तार के भीतर borosilicate टयूबिंग रखने (या एक लेम्प लौ microcannula पर एक सही कोण लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है ) और बाहर का भाग संदंश के साथ कोमल बल के रूप में टयूबिंग गरम किया जाता है आवेदन. लगाया सही कोण करने के लिए बाहर का microcannula के पूर्व निर्धारित लंबाई मस्तिष्क क्षेत्र की गहराई के आधार पर फैसला किया है (उदाहरण के लिए, 5 मिमी) लक्षित किया जा खाते में खोपड़ी मोटाई ले (~ 1 मिमी) और खोपड़ी ऊपर दूरी काम ( उदाहरण के लिए, 1-2 मिमी). इस प्रकार पूर्व निर्धारित microcannula की नोक से वर्तमान प्रदर्शनों के लिए लगाया सही कोण दूरी 7-8 मिमी था. एक हीरे पेंसिल तो borosilicate लगभग 8 मिमी सही कोण प्रॉक्सिमल टयूबिंग में कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 2: microcannula की तैयारी. (ए) एक इलेक्ट्रोड खींचने (Stoelting कं लकड़ी डेल, आईएल) के लिए एक लंबे, गावदुम टांग के साथ एक microcannula उत्पादन किया जाता है. (बी) के उपयोग में आसानी के लिए हीटिंग का तार पुनर्भिविन्यासित किया जा सकता है, और microcannula कुंडल के भीतर रखा जाता है, एक सही कोण मोड़ का गठन किया जा संदंश का उपयोग कर के रूप में ग्लास टयूबिंग गरम किया जाता है की अनुमति.
Microcannulas की वांछित संख्या के बाद किया गया है, हम ethylene ऑक्साइड या एक autoclave का उपयोग कर के साथ नसबंदी की सलाह देते हैं. microcannula के बाहर का सबसे 1-2 मिमी एक बाँझ शल्य मार्कर (या स्थायी बंध्याकरण के लिए पहले स्याही) microcannula टिप शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान करने के लिए आसानी से कल्पना की अनुमति के साथ रंग का हो सकता है.
एमओपी की तैयारी
MOPS निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किए गए. संक्षेप में, स्टेनलेस स्टील एमओपी टयूबिंग ("प्रवाह न्यूनाधिक") से प्लास्टिक निकला हुआ किनारा पहले कैंची या rongeurs का उपयोग करने के लिए निकाल दिया जाता है. पॉलीथीन टयूबिंग (;, 1.22 मिमी आयुध डिपो, एक प्लास्टिक, Roanoke, VA, # VT C312 आईडी: 0.72 मिमी) की लंबाई स्टेनलेस स्टील टयूबिंग पहले स्टेनलेस डालने से निकला हुआ किनारा (~ 4 मिमी) द्वारा कब्जा के क्षेत्र से जुड़ा हुआ है polyethylene टयूबिंग और कनेक्शन के बाहरी परिधि के चारों ओर एक उपयुक्त चिपकने के साथ हासिल की लुमेन में स्टील टयूबिंग. LumaBond (myNeuroLab, इंक, सेंट लुइस, MO) यह सेकंड के भीतर इलाज पर ध्यान केंद्रित प्रकाश के लिए जोखिम (जैसे, एक फाइबर ऑप्टिक दीपक से) के रूप में विशेष रूप से उपयोगी है. टयूबिंग की लंबाई जानवर खोपड़ी का आधार है और scapulae पहलू व्याख्यान चबूतरे वाला अधिकांश (जैसे, प्रयोगशाला चूहों के लिए लगभग 1.5-3.0 सेमी) के बीच लगभग दूरी चाहिए. पंप भरा है के रूप में निर्देश है, और उसके अंत से जुड़ी पॉलीथीन टयूबिंग की लंबाई के साथ स्टेनलेस स्टील ALZET टयूबिंग, भरा पंप में डाला जाता है. पंप से एक समाधान की छोटी मात्रा पंप टयूबिंग इंटरफ़ेस (और दूर dabbed होना चाहिए) के बाहर चारों ओर और भी polyethylene टयूबिंग की समीपस्थ क्षेत्र में मजबूर हो जाएगा. संलग्न पंप टयूबिंग से भरा तो 37 सी. सेंटीग्रेड पर 12 घंटे के लिए बाँझ खारा में incubated यदि पंप ठीक से कार्य कर रहा है इस ऊष्मायन अवधि के बाद, तरल पदार्थ के लिए polyethylene टयूबिंग के भीतर कुछ मिलीमीटर कूच किया है देखा जाएगा.
निर्माण microinfusion प्रणाली के आयन
इसके संलग्न टयूबिंग के साथ पंप एक 10 सेमी पेट्री बाँझ खारा युक्त पकवान में डूब जाता है, और polyethylene टयूबिंग के भीतर शेष हवा निकाल दिया जाता है एक ही पंप और जो में निहित समाधान के साथ भरा सिरिंज का उपयोग कर छोटे व्यास टयूबिंग के साथ फिट किया गया है कि पॉलीथीन टयूबिंग के भीतर डाला जा सकता है है. समाधान इस प्रकार पॉलीथीन टयूबिंग में इंजेक्शन जा सकता है हवा की जगह है. इसी तरह, microcannula नमकीन स्नान में डूब जाता है और हवा के समाधान के साथ इंजेक्शन लगाने के द्वारा हटा दिया जाता है. यह आसानी से एक दूसरे समाधान भरा सिरिंज लचीला (जैसे, सिलिकॉन) टयूबिंग कि microcannula के बड़े अंत (प्रॉक्सिमल) पर फिट बैठता है के साथ फिट के साथ हासिल की है.
borosilicate टयूबिंग की प्रॉक्सिमल अंत तो पॉलीथीन टयूबिंग में डाला जाता है. ध्यान दें कि यह मजबूती जिससे borosilicate टयूबिंग की आसान प्रविष्टि के लिए खोलने का जगमगाता हुआ लुमेन में microforceps के बंद सुझावों को दबाकर polyethylene टयूबिंग फैलाव की आवश्यकता हो सकती है. हवा मुक्त जलसेक प्रणाली तो खारा स्नान से हटा दिया है और एक बाँझ सतह पर रखा और धीरे धुंध या एक कपास झाड़ू के साथ सूख. टयूबिंग microcannula पॉलीथीन कनेक्शन चिपकने के एक परिधीय कोट (जैसे, LumaBond) के साथ सुरक्षित है.
यदि यह प्रणाली ठीक से इकट्ठा किया है, और अगर एमओपी के रूप में यह चाहिए इस समाधान की एक छोटी बूंद प्रक्रिया के अंतिम चरण के दौरान, समारोह के लिए जारी आम तौर पर पंप के भीतर आसमाटिक तंत्र के रूप में microcannula की नोक पर दिखाई देगा तैयारी के दौरान जारी है. एमओपी प्रवाह दर उपयुक्त सतह क्षेत्र कोटिंग द्वारा अनुपात में कमी आई कर सकते हैं आयल के साथ निर्माता द्वारा निर्देश के रूप में. वर्तमान प्रदर्शनों के लिए, 50% प्रत्येक एमओपी की संक्षेप में यह पिघला हुआ आयल में dunking और इसे शांत करने के लिए अनुमति देता है लेपित किया गया था, इस प्रकार के आधे से 0.125 μL / घंटा प्रवाह दर को कम करने. पूरा microinfusion व्यवस्था तो बाँझ खारा में डूबे हुए है और 37 ° आरोपण जब तक सी पर संग्रहीत है.
Microinfusion प्रणाली के आरोपण
microinfusion प्रणाली मानक stereotaxic के रूप में पहले वर्णित (Cooley, 1990) तरीकों का उपयोग कर प्रत्यारोपित किया जाता है. शल्य चिकित्सा क्षेत्र की तैयारी के बाद, एक गड़गड़ाहट छेद microcannula के प्रवेश के लिए drilled है. अगर वांछित, खोपड़ी शिकंजा भी संबंध microcannula सुरक्षित किया यौगिक स्थिर तैनात किया जा सकता है. इस प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया यौगिक (Geribond, Den-Mat, Inc, सांता मारिया, CA) के लिए अतिरिक्त प्रस्तोता की आवश्यकता नहीं है, तथापि, खोपड़ी की सतह एक acetonedampened कपास झाड़ू के साथ सफाई से तैयार किया जाना चाहिए. एक 1-2 मिमी व्यास "हुक" संरेखण तार के बाहर का अंत (चित्र देखें 1.) में किया जाता है है, यह borosilicate टयूबिंग में मोड़ घेरना अनुमति देता है. यह तो (LumaBond का उपयोग) सुरक्षित है, microcannula के बाहर का भाग के रूप में एक ही अक्ष (है कि मस्तिष्क में उन्नत किया जा रहा है, चित्र देखें 3B.) के साथ एक अभिविन्यास में. जलसेक प्रणाली तो stereotaxic वाहक (3 छवि) पर मुहिम शुरू की है, धारक पर संरेखण तार clamping. बाँझ सीवन जलसेक stereotaxic जोड़तोड़ के शीर्ष करने के लिए पंप पगहा के लिए प्रयोग किया जाता है, इस प्रकार यह निलंबित है और पंप के वजन (और टोक़) (3B छवि) के कारण प्रक्रिया के दौरान उन्मुखीकरण के नुकसान को रोकने. microcannula तो संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे संरेखण वाहक दबाना करने के लिए बाहर का तार मोड़ द्वारा वांछित अभिविन्यास (उदाहरण के ठीक ऊर्ध्वाधर) में कर सकते हैं तैनात किया है. microcannula टिप संदर्भ का एक बिंदु (जैसे, bregma या लैम्ब्डा) पर तैनात है और फिर मस्तिष्क में प्रवेश के बिंदु को चतुराई. Bregma 0.2 मिमी, पार्श्व 3.2 मिमी, और उदर 5.0 मिमी dura के नीचे एक खोपड़ी फ्लैट स्थिति में पशु के सिर के साथ: इन प्रयोगों में पशुओं के लिए इस्तेमाल किया निर्देशांक थे.
बाद मस्तिष्क के भीतर उचित गहराई microcannula के लिए उन्नत है, प्रणाली एक कुरसी यौगिक (जैसे, Geribond) के साथ स्थिति में तय हो गई है. कुरसी घाव बंद की सुविधा की खोपड़ी की सतह के करीब मूर्ति किया जा सकता है. कुरसी यौगिक के बाद ठीक हो गया है (~ 2 मिनट), संरेखण ड्रिल काटने पहिया का उपयोग कुरसी के साथ फ्लश तार काट रहा है. परिसर के एक छोटी राशि को कवर करने के लिए और कटे तार से शेष कंटिया चिकनी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एमओपी तो subcutaneously डाला जाता है, जानवर scapulae के बीच स्थिति. अंत में, घाव बाँझ खारा के साथ lavaged है, और चीरा सीवन या घाव क्लिप का उपयोग कर बंद (3 छवि, पैनल डी).
croinfusion प्रणाली और एक जानवर के भीतर नियुक्ति निर्धारण के लिए तैनात है. (डी) microinfusion प्रणाली के डिजाइन की अनुमति देता है एक कम प्रोफ़ाइल कुरसी पर चीरा के आसान बंद, जोखिम संक्रमण को कम करने और पशु के लिए बेचैनी कम से कम "चौड़ाई =" 511 "ऊंचाई =" 381 "/>
चित्रा 3: microinfusion प्रणाली के आरोपण. (ए) stereotaxic साधन पर microinfusion प्रणाली के पोजिशनिंग. (बी) एमओपी बाँझ सीवन का उपयोग करने के लिए microcannula के उन्मुखीकरण में खलल न डालें से अपने वजन को रोकने के सीमित है. microcannula संरेखण तार का उपयोग कर मस्तिष्क में सटीक ऊर्ध्वाधर प्रविष्टि के लिए तैनात है. (सी) एक microinfusion प्रणाली और एक जानवर के भीतर नियुक्ति निर्धारण के लिए तैनात है. (डी) microinfusion प्रणाली के डिजाइन की अनुमति देता है एक कम प्रोफ़ाइल कुरसी पर चीरा के आसान बंद है, जोखिम संक्रमण को कम करने और पशु के लिए बेचैनी कम से कम.
तैयारी और मानक जलसेक प्रणाली के आरोपण
एक प्लास्टिक, Roanoke, VA, # 3300PM /; microinfusion प्रणाली के लिए मानक जलसेक प्रणाली की तैयारी के लिए प्रक्रिया समान microcannula 300 सुक्ष्ममापी की एक व्यास के साथ एक "आसमाटिक पंप संबंधक प्रवेशनी" (28 गा द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है छोड़कर है छठे वेतन आयोग, चित्र देख 5a). मानक प्रणाली के आरोपण भी microinfusion प्रणाली, एक संरेखण तार के मस्तिष्क में प्रवेश की प्रवेशनी सटीक ऊर्ध्वाधर स्थिति की अनुमति अनुलग्नक सहित करने के लिए समान है.
प्रोटोकॉल और विश्लेषण
Microinfusion सिस्टम फास्ट ग्रीन के निरंतर वितरण प्रदान करने की क्षमता की जांच, तीन जानवरों के समूहों को 12 घंटा, 1 दिन, 2 दिन, और सर्जरी के बाद 4 दिन में बलिदान किया गया. विषय pentobarbital सोडियम (120 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) और transcardially 0.1M फॉस्फेट के 200 एमएल के साथ perfused (पीबीएस) buffered खारा 0.1M Phospate बफर में 4% paraformaldehyde की 400 एमएल के द्वारा पीछा के साथ गहरा anesthetized थे. छिड़काव समाधान 4 ° C पर रखा गया था, और 7.4 की एक pH के साथ एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर प्रति मिनट 50 एमएल की दर पर perfused. आदेश में शवपरीक्षा ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना cannulas को हटाने के लिए, perfused जानवर एक stereotaxic फ्रेम में तय किया गया था, कुरसी एक कठोर तार जोड़तोड़ हाथ दबाना करने के लिए संलग्न करने के लिए चिपकने के साथ सुरक्षित था, और खोपड़ी कुरसी के आसपास से ध्यान हटा दिया गया था का उपयोग एक दंत गड़गड़ाहट. कुरसी और अंतर्निहित प्रवेशनी जिससे एक ही प्रक्षेपवक्र जिसमें प्रवेशनी प्लेसमेंट के लिए उन्नत किया गया था के साथ हटा दिया गया. दिमाग फिर calvaria से हटा दिया गया और वही लगानेवाला में 12 घंटे के लिए डूब.
फास्ट ग्रीन की निरंतर प्रेरणा, 200 सुक्ष्ममापी की एक मोटाई के साथ वर्गों का मूल्यांकन एक Vibratome (myNeuroLab, सेंट लुइस, MO) और गिलास स्लाइड पर गीला घुड़सवार का उपयोग कर काट रहे थे. प्रतिनिधि वर्गों Canon CanoScan LiDE 600F स्कैनर का उपयोग imaged थे. स्थानीय आघात और प्रतिक्रियाशील gliosis के मूल्यांकन के लिए, 70μm Vibratome वर्गों पहले थे गीला घुड़सवार और कि सुखाने, धुंधला हो जाना, और निर्जलीकरण के रूप में histological प्रक्रियाओं, के साथ हो सकता है ऊतक विरूपण को रोकने के बेदाग फोटो खिंचवाने. ये वही वर्गों तो उनके जिलेटिन लेपित गिलास स्लाइड पर शुष्क करने की अनुमति रहे थे, और वे hematoxylin और eosin (एच एंड ई), वर्गीकृत एल्कोहल के साथ निर्जलित के साथ दाग थे, और Permount साथ कवर फिसल.
निकटस्थ 70 सुक्ष्ममापी वर्गों glial fibrillary अम्लीय (GFAP) प्रोटीन है, जो प्रतिक्रियाशील gliosis की प्रक्रिया के दौरान astrocytes द्वारा आघात (; मा एट अल, 1991 डिंग एट अल, 2000) के जवाब में व्यक्त किया जाता है का पता लगाने के लिए एक मानक immunofluorescence प्रक्रिया लिया. संक्षेप में, मुक्त अस्थायी वर्गों पीबीएस के साथ rinsed थे और 10% सामान्य गधा (एनडीएस) सीरम और 0.1 एम पीबीएस में 3% 0.3% Triton एक्स 100 एक घंटे के लिए (/ पीबीएस ट्राइटन) और फिर में incubated के साथ गोजातीय albumin सीरम के साथ अवरुद्ध खरगोश विरोधी GFAP एंटीबॉडी (1:500, सिग्मा रासायनिक कं, सेंट लुइस, MO) पीबीएस / ट्राइटन में 12 घंटे के लिए 1% एनडीएस के साथ 4 डिग्री सेल्सियस धारा तो पीबीएस के साथ rinsed थे और एलेक्सा ® 594 गधा - antirabbit माध्यमिक एंटीबॉडी Fluor के साथ incubated, कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 5% एनडीएस के साथ पीबीएस में (1:500 आण्विक जांच, इंक, यूजीन, या). वर्गों पीबीएस के साथ अच्छी तरह से फिर से rinsed और NeuroTrace साथ counterstained ® हरे रंग का फ्लोरोसेंट Nissl दाग (5 मिनट के लिए 1:500 पीबीएस में, आण्विक जांच, Inc, यूजीन, या). अंतिम पीबीएस के साथ कुल्ला के बाद, अनुभागों जिलेटिन लेपित स्लाइड्स पर घुड़सवार थे और धीरे फीका (आण्विक जांच) के साथ coverslipped. सभी photomicrographs AxioVision सॉफ्टवेयर (कार्ल Zeiss, Inc, Thornwood, NY) के साथ एक Zeiss Axioskop माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हासिल किया गया.
परिणाम
इन विट्रो में परीक्षण में
पशुओं में मूल्यांकन के लिए पहले, तीन microinfusion प्रणालियों में अपने फास्ट ग्रीन भरा MOPS एक डिब्बे में (15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब) और एक दूसरे डिब्बे (1 मिलीलीटर EPP में रखकर उनके microcannulas रखकर तैयार किए गए endorf) ट्यूब, दोनों 37 में युक्त बाँझ खारा डिग्री सेल्सियस प्रत्येक प्रणाली अवलोकन के 12 घंटे से अधिक डाई के सतत प्रवाह का प्रदर्शन किया. चित्रा 4 में 3 घंटे से अधिक एक विशिष्ट प्रणाली के समारोह में दिखाता है.
चित्रा 4: microinfusion प्रणाली समारोह के इन विट्रो प्रदर्शन में. (ए) फास्ट ग्रीन डाई के प्रवाह को आसानी से देखा है इन विट्रो में परीक्षण अवधि में एक की शुरुआत में microcannula से बेरोक. (बी) के रूप में प्रवाह जारी है, जलाशय समाधान (बी) संतृप्त है, और अंततः रंगाई (सी) के साथ अपारदर्शी हो जाता है.
Vivo microinfusion प्रणाली में मूल्यांकन
छिड़काव के बाद, हटा microcannulas और उनके कनेक्शन को ध्यान निरीक्षण किया गया और सभी के लिए पूरी तरह बरकरार पाए गए. इस प्रकार, वहाँ ऊतक के भीतर borosilicate ग्लास का कोई टूटना हुई, और न ही वहाँ प्रणाली घटकों के कनेक्शन में किसी भी दोष थे. एक 10 एल. खारा भर सिलिकॉन टयूबिंग की एक छोटी लंबाई इसकी सुई से जुड़ी के साथ हैमिल्टन सिरिंज पॉलीथीन microcannula करने के लिए जुड़ी टयूबिंग की कटौती समाप्त करने के लिए कोमल प्रवाह लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Microcannulas के बारह सभी जारी रखा प्रवाह की अनुमति दी है और था प्रदर्शित करने के लिए बाधित हो नहीं. इसके अलावा, पशुओं से प्रत्येक एमओपी हटाने के बाद शेष समाधान की मात्रा को मापा और एमओपी के प्रवाह की दर (0.125 μL / घंटा) और यह कार्य करने के लिए अनुमति दी गई थी समय की राशि के लिए उपयुक्त हो पाया था.
Vivo वितरण में
ऊतक के राज्याभिषेक वर्गों फास्ट ग्रीन के साथ संचार का मूल्यांकन समूहों के भीतर वितरण में पशुओं के बीच किसी भी समय बिंदु (12 घंटे, 1 दिन, 2 दिन, और 4 दिन) पर थोड़ा परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन किया. 5 चित्रा इन समय चार दिन में एक डाई घुसपैठ में प्रगतिशील वृद्धि दिखा बिंदुओं पर फास्ट ग्रीन प्रसार के प्रतिनिधि क्षेत्रों दिखाता है. ध्यान दें कि पूर्व फास्ट ग्रीन के उच्च सांद्रता (जैसे, 5 - 15%) का उपयोग कर प्रयोगों parenchyma की तेजी अपारदर्शन में परिणामस्वरूप, इस प्रकार समय पर microinfusion प्रणाली समारोह के सही मूल्यांकन obscuring. जबकि 1% डाई प्रसार की पूर्ण सीमा तक मुश्किल हो सकता है सही सकल निरीक्षण पर निर्धारित कर सकते हैं, घुसपैठ के क्षेत्रों 2.5X बढ़ाई पर आसानी से discernable थे, और चित्रा 5 में धराशायी लाइनों के साथ संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 5: फास्ट ग्रीन के निरंतर microinfusion के vivo demonstation में है . (ए) एक फास्ट microinfusion ग्रीन लोड प्रणाली के intrastriatal नियुक्ति के बारह घंटे बाद, डाई microcannula साइट parenchyma आसपास में diffusing में देखा जाता है. 1 (बी) के दिन, 2 दिन (सी), और 4 दिनों (डी) में प्रेक्षणों डाई घुसपैठ की बढ़ती क्षेत्रों के साथ फास्ट ग्रीन समाधान की निरंतर वितरण से संकेत मिलता है. प्रसार की बाहरी सीमा कम शक्ति माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया गया और धराशायी लाइनों के साथ यहाँ संकेत है. स्केल बार, 2 मिमी.
आघात और प्रतिक्रियाशील gliosis का मूल्यांकन
ताजा कटौती, बेदाग ऊतक वर्गों के सकल अवलोकन से पता चला है कि microinfusion प्रणाली प्रसव के स्थल पर स्थानीयकृत आघात में कमी के परिणामस्वरूप. मानक प्रवेशनी हमेशा के लिए बाधित और ऊतक का एक बड़ा क्षेत्र (छवि 6B एंड सी), जो बेहतर एच एंड ई (छवि 6D और ई) के साथ उच्च शक्ति की सराहना की है विस्थापित करने के लिए देखा था. इसके अलावा, रक्त अक्सर मानक जलसेक साइट (6D छवि) पर था संचित देखा, vasculature को समझौता का एक बड़ा डिग्री सुझाव और रक्त मस्तिष्क बाधा के कम अखंडता जिसका अर्थ.
microinfusion प्रणाली को भी बहुत कम प्रतिक्रियाशील gliosis में हुई के रूप में एक microcannula (6G छवि) के माध्यम से जलसेक के आसपास के क्षेत्र में GFAP के लिए कम immunoreactivity द्वारा दिखा दिया जब एक मानक प्रवेशनी (छवि 6f) की तुलना में. जबकि microcannula प्रेरित GFAP धुंधला सामान्य स्तर (छवि 6) ऊपर ऊंचा था, मानक प्रवेशनी प्लेसमेंट और जलसेक (6f) के साथ प्रतिक्रियाशील gliosis में हड़ताली वृद्धि नहीं देखा गया था जब microinfusion प्रणाली में नियुक्त किया गया था.
खारा जलसेक के 5 दिनों के बाद ivery प्रवेशनी. (ए) 50 के एक टिप व्यास के साथ एक microcannula borosilicate टयूबिंग से खींच लिया मीटर मुक्त, सबसे neuroactive एजेंटों के अप्रतिबंधित प्रवाह की अनुमति देता है, अभी तक एक मानक वितरण प्रवेशनी (28 गा, 0.30 मिमी) की तुलना में छोटे 6X है. (बी, सी) राज्याभिषेक वर्गों के बेदाग, गीला mounts (मोटाई, 70 मीटर.) अधिक से अधिक स्थानीय ऊतक (तीर) क्षति के कारण illustrating एक मानक प्रवेशनी (बी) जब एक microcannula (सी) की तुलना में. (डी, ई) एच एंड ई दाग वर्गों के उच्च शक्ति photomicrographs क्रमशः बी और सी में दिखाया गया है,. मानक प्रवेशनी डी में सचित्र के रूप में अधिक व्यापक अभिघातजन्य चोट के कारण, ऊतक के एक बड़े क्षेत्र विस्थापित और अधिक से अधिक के रूप में घाव गुहा (तीर) के भीतर रक्त का संग्रह द्वारा प्रदर्शन vasculature को अपमान के कारण. microcannula के कारण घाव, तथापि, काफी छोटे और कम विघटनकारी लगाने की साइट पर ऊतकों को है. (एफ, जी, एच) GFAP के खिलाफ immunofluorescence नाटकीय रूप से मानक प्रवेशनी के घाव के आसपास दर्शाता GFAP + astrocytes की संख्या में वृद्धि हुई (एफ) जब microcannula (जी) और सामान्य, unlesioned striatum (एच) की है कि तुलना में. एक सूचना और प्रसारण, 1 मिमी, डी - एच, 250 मीटर / ">: स्केल सलाखों.
चित्रा 6: स्थानीयकृत microcannula द्वारा कारण आघात की तुलना में खारा जलसेक के 5 दिनों के बाद एक मानक डिलीवरी प्रवेशनी. (ए) 50 सुक्ष्ममापी की एक टिप व्यास के साथ borosilicate टयूबिंग से खींच microcannula मुक्त, सबसे neuroactive एजेंटों के अप्रतिबंधित प्रवाह की अनुमति देता है, अभी तक एक मानक वितरण प्रवेशनी (28 गा, 0.30 मिमी) की तुलना में छोटे 6X है. (बी, सी) राज्याभिषेक वर्गों के बेदाग, गीला mounts (मोटाई, 70 सुक्ष्ममापी) और अधिक से अधिक स्थानीय ऊतक नुकसान (तीर) की वजह से एक मानक (बी) जब एक microcannula (सी) की तुलना में प्रवेशनी illustrating. (डी, ई) एच एंड ई दाग वर्गों के उच्च शक्ति photomicrographs क्रमशः बी और सी में दिखाया गया है,. मानक प्रवेशनी डी में सचित्र के रूप में अधिक व्यापक अभिघातजन्य चोट के कारण, ऊतक के एक बड़े क्षेत्र विस्थापित और अधिक से अधिक के रूप में घाव गुहा (तीर) के भीतर रक्त का संग्रह द्वारा प्रदर्शन vasculature को अपमान के कारण. microcannula के कारण घाव, तथापि, काफी छोटे और कम विघटनकारी लगाने की साइट पर ऊतकों को है. (एफ, जी, एच) GFAP के खिलाफ immunofluorescence नाटकीय रूप से मानक प्रवेशनी के घाव के आसपास दर्शाता GFAP + astrocytes की संख्या में वृद्धि हुई (एफ) जब microcannula (जी) और सामान्य, unlesioned striatum (एच) की है कि तुलना में. एक सूचना और प्रसारण, 1 मिमी, डी - एच, 250 सुक्ष्ममापी: स्केल सलाखों.
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Discussion
विभिन्न अध्ययनों से दिखा दिया है कि (पेरी एट अल, 1993) intracerebral सुई लेनी है, ऊतक आघात और रक्त मस्तिष्क बाधा के अपमान के लिए प्रसव प्रवेशनी के आकार को कम से कम कर रहे हैं, सूजन में कमी और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (तनु Finsen एट अल .) 1991, और प्रतिक्रियाशील gliosis (Nikkhah एट अल., 1994) कम है. हम यहाँ neuroactive एजेंट के जीर्ण कि 6 गुना पारंपरिक इस्तेमाल डिलीवरी cannulas के तुलना में कम है एक व्यास के साथ एक microcannula के माध्यम से मस्तिष्क के भीतर प्रसव के लिए एक तरीका मौजूद है. हमने दिखा दिया है कि इस प्रणाली को मज़बूती से बचाता है समय और स्थानीयकृत आघात और प्रतिक्रियाशील gliosis के स्तर में नाटकीय रूप से कम है पर एक प्रतिनिधि समाधान. इन अध्ययनों से 50 मीटर की एक अंतिम टिप व्यास के साथ एक प्रसव प्रवेशनी कार्यरत, तथापि, छोटे टिप व्यास उपयोग किया जा सकता है. ऐसी microinfusion प्रणालियों के प्राथमिक पुण्य उनके बहुत छोटे असतत लक्ष्य एजेंट देने, जबकि जलसेक के आसपास के क्षेत्र में कम से कम आघात वसूल करने की क्षमता है.
हम वर्णन जलसेक प्रणाली के निर्माण में इस्तेमाल किया microcannulas पूर्व निर्धारित लंबाई और टिप व्यास के साथ कस्टम निर्मित आसानी से किया जा सकता है. microinfusion प्रणाली जानवर की अनुमति सुरक्षित, कम प्रोफ़ाइल निर्धारण और एक बड़ी कपाल कुरसी के लिए जरूरत precluding खोपड़ी की सतह के अनुरूप बनाया गया है. सर्जिकल घाव इसलिए आसानी से सुव्यवस्थित microinfusion कुरसी पर sutured हो सकता है, इस प्रकार दोनों जानवरों को बेचैनी और संक्रमण का खतरा कम. इसके अलावा, खोपड़ी के लिए सिस्टम को सुरक्षित कम खोपड़ी की सतह क्षेत्र की आवश्यकता है, इसलिए अतिरिक्त या बाद प्रक्रियाओं एक बड़ा कुरसी से हस्तक्षेप के बिना किया जा सकता है है.
एक, तथापि, खाते कुछ तकनीकी विचार में लेना चाहिए जब यहाँ वर्णित पद्धति रोजगार. कौशल के एक उच्च स्तर की आवश्यकता है, और उत्पादन और आरोपण की प्रक्रिया कम समय कुशल की तुलना में यह मानक जलसेक प्रणालियों के लिए हो सकता है. दूसरी ओर, इस outweighed हो सकता है या कम से कम समय (और पशुओं) उच्च परिशुद्धता तकनीक का अभ्यास द्वारा बख्शा द्वारा counterbalanced,. एक और मुश्किल यह है कि जबकि microcannula वस्तुतः किसी भी व्यास के साथ अनुकूलित किया जा सकता है, एक बहुत छोटे लुमेन के साथ एक microcannula बाधित या तो infusate के घटकों द्वारा या ऊतक (जैसे, रक्त, मस्तिष्क के ऊतकों) आरोपण के दौरान सामना करना पड़ा द्वारा, बन सकता है. इस जोखिम रखने microcannula टिप सिक्त (जैसे, एक पानी या खारा संतृप्त कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए infusate विलेय के सुखाने को रोकने) आरोपण की प्रक्रिया के दौरान और साफ, "रक्त मुक्त" सर्जरी प्रदर्शन करके कम है.
हम अनुशंसा करते हैं कि एक microcannula टिप व्यास है कि विशेष संरचना और / या समाधान है कि एमओपी में लोड किया जाएगा के दलदलापन के लिए उपयुक्त है स्थापित शोधकर्ता. यह आसानी से इन विट्रो में परीक्षण प्रोटोकॉल (छवि 4) में वर्णित के समान प्रणाली में एक का उपयोग करके हासिल की है, या बस इकट्ठे प्रणाली एक 37 डिग्री सेल्सियस खारा स्नान में डुबो और स्नान और संरचना / निगरानी या मात्रा को मापने के द्वारा समय पर एमओपी सामग्री की. एक नुकसान यह है कि microcannula अपेक्षाकृत कमजोर है, विशेष रूप से अगर इसकी टिप व्यास बहुत छोटे (जैसे, ~ 10-50 microns) है. आम तौर पर गलती से सर्जरी के दौरान microcannula तोड़ने की आवश्यकता है कि पूरी प्रणाली की जगह हो सकता है, कि इकाई के रूप में मरम्मत या पुनर्निर्माण सर्जरी समय काफी विस्तार होगा. ऐसी तकनीकों में कुशल वैज्ञानिकों और जो अभ्यास मांग शायद ही कभी अनुभव टूटना विधि, तथापि.
प्रयोग के समापन पर, microinfusion सिस्टम करने के लिए सुनिश्चित करें कि microcannula किया गया है और क्षतिग्रस्त नहीं है कि यह पेटेंट बनी हुई है निरीक्षण किया जा सकता है. मिनी - आसमाटिक पंप की मात्रा भी करने के लिए सुनिश्चित करें कि neuroactive एजेंट की उचित मात्रा में दिया गया है मापा जा सकता है, हम रीसाइक्लिंग या पुन: उपयोग पंप सिफारिश नहीं है, तथापि. जबकि वर्तमान तरीकों वयस्क चूहों में प्रदर्शन किया गया, एक प्रणाली है कि आघात को कम कर देता है और आवश्यकता है है निर्धारण के लिए कम खोपड़ी सतह क्षेत्र के पारंपरिक तरीकों पर बेहतर हो सकता है चूहों या युवा चूहों जैसे छोटे जानवरों के साथ प्रयोग के लिए विचार का उपयोग करें.
हालांकि वर्तमान पद्धति और experimenter द्वारा प्रवीणता और कौशल का एक कुछ और अधिक उन्नत स्तर की आवश्यकता है, यह शायद परिमाण के एक आदेश द्वारा परिशुद्धता बढ़ाने के लिए और हित के क्षेत्र के लिए आघात के साथ जुड़े प्रयोगात्मक घालमेल कर दिया है कम से कम प्रदान करता है. हमारी प्रयोगशाला में, हमने पाया है कि प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के अधिक विश्वसनीय और मजबूत प्रभाव में इस sake.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
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तंत्रिका विज्ञान 13 अंक मिनी आसमाटिक पंप पुरानी जलसेक microcannula तेजी से हरेErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
