ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Nörobilim soruşturma hale geldikçe, daha sofistike, beyin yapılarının incelenmesi ve devreleri, doğruluk ve daha yüksek çözünürlük gelişmiş düzeyde gerektirir. Biz bir ucu çapı 50 mikron ile borosilikat mikrokanül kullanarak beynin içinde kronik bir infüzyon sistemi hazırlanması ve implantasyon için bir yöntem geliştirdiler.
Abstract
Nöroaktif ajanlar kronik infüzyon için kullanılan deneysel protokolleri beyin bölgeleri içinde sık sık bir mini-osmotik pompa sistemi kullanmaktadır. Ajanlar, yaygın olarak, 0,30 mm veya daha büyük bir çapa sahip paslanmaz çelik bir kanül aracılığı ile teslim edilir. Bu çapta bir kanül kullanan sistemler, böylece yapısal bütünlüğünü ve normal işleyişi ödün, mimari hasara neden ilgi alanı travma getirebilir. Nörobilim soruşturma hale geldikçe, daha sofistike, beyin yapılarının incelenmesi ve devreleri, doğruluk ve daha yüksek çözünürlük gelişmiş düzeyde gerektirir. Biz bir ucu çapı 50 mikron ile borosilikat mikrokanül kullanarak beynin içinde kronik bir infüzyon sistemi hazırlanması ve implantasyon için bir yöntem geliştirdiler. Bu teknik, yerel çevreye zarar azaltır ve infüzyon yerinde reaktif gliozis azalır. Mikroinfüzyon sistem konfigürasyonu da skalp insizyonu kapatılmasını kolaylaştırmak ve böylece enfeksiyon riskini azaltır, büyük kafatası kaideleri gerek kalmaz, hayvanın kafatası yüzeyine uyacak şekilde yapabiliyor. Biz, in vitro modeli ve in vivo çalışmalar sıçanlarda kullanarak bir temsilci moleküler ağırlığa sahip bir boya güvenilir sürekli teslim göstermektedir.
Protocol
Giriş
Nöroaktif ajanları doğrudan infüzyon, kan beyin bariyerini atlayarak belirli beyin bölgelerinde çalışmaya olanak sağlar. Nörobilim bu yaklaşımın uygulamaları çok çeşitlidir ve beyin aktivitesinin düzeyini ayrık alt bölgelerini (Berretta ve ark, 2004 Kim ve ark, 2000; Gliddon ve ark, 2005.) Değiştirerek (psikotrop ajanlar eylemlerini soruşturma Clinton ve ark, 2006;. mekanizmaları inceleyerek, Rosi ve ark, 2004); Marchalant ve ark, 2007;. Di Benedetto ve ark, 2004), beyin iltihabı kontrollü modeller (Hauss-Wegrzyniak ve ark, 1998 bağımlılığı (Kim ve ark, 2005; Zhang ve ark, 2006; Lockman ve ark, 2005) ve trofik faktörler (Naert ve ark, 2006 sağlayarak uzun vadeli yönetimi;. Radecki ve ark, 2005; Takahashi ve ark, 2006).
Ajanlar kronik teslimat için standart yöntemler sık sık değişebilir çapında paslanmaz çelik bir kanül aracılığı ile, beynin içinde teslim bir nöroaktif ajan, yüklü bir mini-osmotik pompa (örneğin, ALZET Osmotik Pompalar, Cupertino, CA) kullanan 0.25 mm (Williams ve ark, 1987), 0.5 mm, ancak en yaygın olarak yaklaşık 0,3 mm (Plastik biri, Roanoke, VA bkz. Şekil 6A). Bu boyutu teslim kanüller yüksek düzeyde hassasiyet ve mikroçevresinin travmaya neden olan birçok uygulama için uygun olması önemli bir endişe kaynağı olsa da, bu kanüller kanül karşılaştırılabilir olduğu küçük, narin siteleri ajanları sunmak için optimal boyutu (ya da daha büyük) hedeflenen yapının kendisi veya fonksiyon travmatik hakaret taviz verilmemelidir.
Burada sunulan nöroaktif ajanların çok azalır ucu çapı "mikrokanül" kullanılarak beynin içinde teslimat için kronik bir infüzyon sisteminin hazırlanması ve implantasyon için bir yöntemdir. Bu teknik, küçük altyapılar hedef izin verir ve ilgi alanı travma azaltır. Bu prosedür, bu nedenle soruşturma altında beyin bölgesi kesintileri en aza indirmek isteyen araştırmacılar için geleneksel yöntemlere alternatif olarak öğretilir.
Gereç ve yöntem
Hayvanlar ve tasarım
Onsekiz yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlar (400-450 gr), yordam göstermek ve mevcut yöntemin işlevini test etmek için kullanılmıştır. Oniki hayvan mikroinfüzyon sistemleri ile implant ve 4 gün boyunca sürekli fonksiyonu bir zaman ders değerlendirme katkıda bulunmuştur. Altı hayvanlar 5 gün tuzlu su dolu bir mini-ozmotik pompaya bağlı ya da standart 28 ga teslim kanül (N = 3) ya da bir mikrokanül (N = 3) implantasyonu sonrası travma ve reaktif gliozis düzeyini karşılaştırmak için kullanıldı. Hayvanlar şeffaf plastik kafeslerde ev ve ad libitum sağlanan gıda ve su ile, 12 saat ışık / karanlık programı tutuldu. Tüm prosedürler, hayvanların deneysel kullanım için geçerli federal ve yerel kurallarına uygun olarak, McLean Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Mikroinfüzyon sistemi grubu
Şekil 1 mikroinfüzyon sistem bileşenleri ve montaj göstermektedir. Biz steril tekniği kullanarak sistem inşa ve implante tavsiye ederiz. Buna ek olarak, tuzlu su içinde batık ise sistem içine hava girişini önlemek amacıyla, monte edilir. Mevcut testleri için, mini-osmotik pompaları (paspaslar) 14 günlük süre, 0.25 mcL / saat akış hızı, ve 98.6 mcL dolgu kapasitesi (ALZET # 1002, model, Cupertino, CA) istihdam edilmiştir. Ancak, aşırı akım hızlarında tufan beyin ilgi daha küçük alanlarda ve yapısal hasar, bu çalışmalar, üretici tarafından anlatıldığı gibi, parafin ile 0.125 mcL / saat MOP kaplama yarı oranında azalmıştır için akış hızı neden. Yerel travma değerlendirilmesi için, paspaslar steril serum fizyolojik ile dolduruldu. Nedeniyle düşük toksisite, canlı beyin dokusu içinde diffüz kabiliyetini, çünkü mikroinfüzyon sistemleri, Hızlı Yeşil (tuzlu su içinde% 1, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) sürekli fonksiyonunun değerlendirilmesi için bir test çözümü seçildi kronik infüzyonu (örneğin muscimol, picrotoxin, fluoksetin, vb.) ilgi yaygın olarak "küçük moleküller" (1000) aralığın üst ucunda, bir molekül ağırlığına (808,84) sahiptir.
Şekil 1: Assemkızak kesici mikroinfüzyon sistemi. (A) sistem bileşenleri, montaj için göreli konumları yerleştirilir. Akış modulater boru flanşı uzakta kırılmış oldu. Biz hizalama tel (metin) sadece implantasyon öncesi güvenli olması önerilir. (B) hizalama tel ve implantasyon ek önce mikroinfüzyon sistemi monte edilmiştir.
Mikrokanül hazırlık
Mikrokanül ayarları ile bir cam elektrot, hafifçe sivrilen uzun bir sap (Şekil 2A) üretmek için standart bir yatay ya da dikey elektrot çektirmesi (Stoelting Co, Wood Dale, IL) ile moda olabilir. Borosilikat boru, bu amaç için uygundur (part 1B100F-6, 1,0 mm, 6; Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL), izin, nispeten düşük bir erime noktası vardır odaklı ısı bükme sonraki. Düz bir mikrokanül en distal kısmı diseksiyon makas ile kesilebilir veya istenilen son ucu çapı (kontrollü bir mola vermek için microforceps (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL) ile yapılabilir bugünkü gösteriler için 50 mikron ) ve mikroskop sahne mikrometre, istenilen çap kılavuzu ve onaylamak için yararlıdır. Kısaca kesme ucu ısıtılır ya da "yangın cilalanmış", kaba ya da keskin kenarları kaldırmak için olabilir. Elektrot çektirmenin veya bir Bunsen beki ısıtma rezistansı sonra ısıtma rezistansı içinde borosilikat tüp yerleştirerek (ya da Bunsen alev mikrokanül ucu (Şekil 2B) önceden belirlenmiş bir mesafeyi mikrokanül üzerine doğru bir açı empoze etmek için kullanılır. boru ısıtmalı olduğu gibi) ve forseps ile distal hafif kuvvet uygulayarak. Dayatılan dik açı distal mikrokanül önceden belirlenmiş uzunluk (hedef alınması (örneğin, 5 mm) beyin bölgenin derinliğine göre karar verdi ve kafatası kalınlığı dikkate alarak (~ 1 mm) ve kafatası üzerinde çalışma mesafesi örneğin, 1-2 mm). Böylece mikrokanül ucu bugünkü gösteriler için dayatılan dik açı için önceden belirlenmiş bir mesafe 7-8 mm idi. Bir elmas kalem sonra borosilikat tüp dik açı proksimalinde yaklaşık 8 mm kesmek için kullanılır.
Şekil 2: mikrokanül hazırlanması. (A) bir elektrot çektirmesi (Stoelting Co Wood Dale, IL), incelen, uzun bir sap ile bir mikrokanül üretmek için kullanılır. (B) ısıtma rezistansı kullanım kolaylığı için Nokia'nın olabilir ve mikrokanül dik açılı bir viraj cam tüp ısıtılır forseps kullanarak kurulacak sağlayan, bobin içinde yerleştirilir.
Microcannulas, istediğiniz numarayı yapıldıktan sonra, etilen oksit veya otoklav ile sterilizasyon tavsiye ederiz. Mikrokanül distal 1-2 mm mikrokanül ucu cerrahi işlem sırasında kolayca görüntülenebilmekte izin steril bir cerrahi işaretleyici (veya sterilizasyon için önce kalıcı mürekkep) ile renkli olabilir.
MOP hazırlık
Paspaslar, üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır. Kısaca, plastik, paslanmaz çelik MOP boru ("akış modülatör") flanş ilk makas veya rongeurs kullanarak kaldırılır. Polietilen boru, OD, 1.22 mm, Plastik biri, Roanoke, VA, C312 VT ID: 0.72 mm uzunluğunda, paslanmaz çelik boru, paslanmaz takarak flanş (~ 4 mm), daha önce işgal alanında bağlı olduğu çelik borular, polietilen boru ve bağlantı dış çevresinde uygun bir yapıştırıcı ile güvence lümenine. LumaBond (myNeuroLab, Inc, St Louis, MO) odaklanmış ışık maruz kalma (örneğin, bir fiber optik lamba) üzerine birkaç saniye içinde tedavileri olarak yararlıdır. Boru uzunluğu hayvanın kafatası taban ve scapulaların en rostral yönü (örneğin, laboratuvar sıçanlar için yaklaşık 1.5-3.0 cm) arasında yaklaşık mesafe olmalıdır. Pompa olarak talimat doludur, ve, paslanmaz çelik ALZET sonuna kadar bağlı polietilen boru uzunluğu ile boru, dolu pompa yerleştirilir. Pompa çözüm küçük bir hacim pompa-boru arayüzü (ve uzakta sildi olmalıdır) dışında çevresinde ve ayrıca polietilen boru proksimal bölgeye zorunda kalacaktır. Ekli boru ile dolu pompa sonra, 37 ° C'de 12 saat süreyle steril serum fizyolojik inkübe Bu kuluçka döneminden sonra, pompa düzgün çalışıyorsa, sıvı, polietilen tüp içinde birkaç milimetre yolculuk yapmış görülecektir.
Kurmak mikroinfüzyon sistemi iyon
Steril serum fizyolojik içeren bir 10 cm Petri kabı bağlı boru ile pompa batırılır ve polietilen boru içinde kalan hava pompası ve içerdiği aynı çözümü ile dolu bir şırınga kullanılarak kaldırılır küçük çaplı borular ile monte edilmiştir polietilen boru içinde eklenebilir. Çözüm, böylece hava yerine polietilen boru içine enjekte edilebilir. Benzer şekilde, mikrokanül tuzlu su içine batırılır ve hava çözümü ile enjekte edilerek kaldırılır. Bu kolay mikrokanül büyük (proksimal) ucuna uyan esnek tüp (örneğin, silikon) ile donatılmış ikinci bir çözüm şırınga ile elde edilir.
Borosilikat tüp proksimal ucu sonra polietilen borular yerleştirilir. Not böylece borosilikat tüp kolay yerleştirilmesi için açılış ışıl ışıl lümenine microforceps, kapalı ipuçları sıkıca basarak polietilen boru genişlemesi gerektirebilir. Hava infüzyon sistemi daha sonra tuzlu su ve steril bir yüzey üzerine yerleştirilir ve hafifçe gazlı bez ya da pamuklu bir bez ile kurutulur. Mikrokanül polietilen boru bağlantı yapışkanlı bir çevresel kat (örneğin, LumaBond) ile güvence altına alınmıştır.
Sistem düzgün bir şekilde monte edilmiş ve MOP, olması gerektiği gibi çalışması için, bu yordamı çözümün bir damlacık son adımı sırasında devam ederse, genellikle pompanın içindeki osmotik mekanizması olarak mikrokanül ucunda görünecek hazırlanması sırasında devam ediyor. MOP akış oranı, üretici tarafından talimat olarak parafin ile kaplama uygun yüzey alanı ile orantılı olarak azalmış olabilir. Bugünkü gösteriler için% 50, her MOP yarı yarıya böylece 0.125 mcL / saat akış hızını azaltarak, kısaca içine erimiş parafin dunking ve soğumaya izin kaplanmıştır. Tamamlanan mikroinfüzyon sistemi daha sonra steril tuzlu sular altında ve 37 ° C kadar implantasyonu saklanır.
Mikroinfüzyon sistemi implantasyonu
Mikroinfüzyon sistemi önceden tanımlanmıştır (Cooley, 1990) standart stereotaksik yöntemler kullanılarak yerleştirilir. Cerrahi alanında ön hazırlıktan sonra, burr hole mikrokanül giriş için delinmiş. İsterseniz, kafatası vidaları da mikrokanül güvenliğini sağlamak için kullanılan yapıştırma bileşik stabilize etmek için yerleştirilmiş olabilir. Bu laboratuvarda kullanılan bileşik (Geribond, Den-Mat A.Ş., Santa Maria, CA) ek demir gerektirmez, ancak kafatası yüzeyinde bir acetonedampened pamuklu bir bez ile temizlik hazırlıklı olmalıdır. "Kanca" 1-2 mm çapında borosilikat boru bükme kuşatmak için izin, hizalama telin distal ucu (bkz. Şekil 1). Yapılır. Daha sonra bir oryantasyon mikrokanül distal kısmı aynı eksen boyunca (beyin içine ileri, bakınız şekil. 3B), (LumaBond kullanarak) sabitlenir. Infüzyon sistemi sonra da sahibinin üzerine uyum tel sıkma, stereotaksik taşıyıcı üzerine monte edilmiş (Şekil 3). Bu nedenle askıya alma ve pompa ağırlığı (ve tork) (Şekil 3B) nedeniyle işlem sırasında yönlendirme kaybının önlenmesi, steril dikiş halata stereotaksik manipülatör üst infüzyon pompası için kullanılır. Mikrokanül sonra hafifçe taşıyıcı kelepçe distal hizalama eğmemek için forseps kullanarak istenilen açıda (örneğin tam dikey) yerleştirilebilir. Mikrokanül ucu referans noktası (örneğin, bregma veya lambda) üzerine yerleştirilmiş ve daha sonra beyin içine giriş noktası için manevra. Bu deneylerde hayvanların kullanılan koordinatları: bregma 0,2 mm, 3,2 mm yan, 5,0 mm ve ventral duranın altında hayvanın kafatası düz bir pozisyonda kafa ile.
Mikrokanül beyin içinde uygun derinliğe kadar ileri düzeydedir sonra, sistem bir kaide bileşik konuma (örneğin, Geribond) ile sabittir. Kaide, yara kapanmasını kolaylaştırmak için kafatasının yüzeye yakın heykel olabilir. Kaide bileşik (~ 2 dak.) Kürünü sonra, hizalama tel matkap kesme tekerleğini kullanarak kaide ile aynı hizada kesilir. Kapak ve kopmuş tel kalan barbus düzeltmek için küçük bir miktar bileşik kullanılıyor olabilir. MOP, sonra subkutan takılan hayvan skapula arasında konumlandırılmış. Son olarak, yara steril serum fizyolojik ile lavaj ve kesi dikiş veya yara klipleri kullanarak (Şekil 3, panel D) kapalı.
croinfusion sistemi yerleştirme ve sabitleme için bir hayvan içinde konumlandırılmış. (D), riskini enfeksiyonu azaltarak ve hayvan rahatsızlığı en aza indirir mikroinfüzyon sisteminin tasarımı, düşük profilli bir kaide üzerinde kesi kolay kapanmasını sağlar. "Width =" 511 "height =" 381 "/>
Şekil 3: mikroinfüzyon sistem İmplantasyon. (A) stereotaksik alet üzerine mikroinfüzyon sistemi konumlandırma. (B) MOP mikrokanül yönünü kesintiye kilo önlemek için steril dikiş kullanarak bağlı. Mikrokanül hassas dikey hizalama tel kullanarak beyin içine giriş için konumlandırılmış. (C) mikroinfüzyon sistemi yerleştirme ve sabitleme için bir hayvan içinde konumlandırılmış. (D) mikroinfüzyon sistemi tasarım, riskini enfeksiyonu azaltarak ve hayvan rahatsızlığı en aza indirir, düşük profilli bir kaide üzerinde kesi kolay kapanmasını sağlar.
Standart infüzyon sisteminin hazırlanması ve implantasyon
Bir Plastik, Roanoke, VA, # 3300PM / standart infüzyon sisteminin hazırlanması için prosedür mikrokanül 300 mm çapında bir "osmotik pompa konektörü kanül" (28 ga yerini dışında mikroinfüzyon sistemi için bu aynıdır SPC) Şekil 5a bakın. Implantasyonu standart sistem mikroinfüzyon sistemi, beyin içine giriş kanül hassas dikey konumlandırma sağlayan bir hizalama tel eki de dahil olmak üzere aynıdır.
Histoloji ve Analiz
Hızlı Yeşil sürekli teslim sağlamak için mikroinfüzyon sisteminin yetenekleri incelemek için ameliyattan sonra 12 saat, 1 gün, 2 gün ve 4 gün, üç hayvan grupları kurban edildi. Başlık sodyum (120 mg / kg, ip) ve transcardially 200 mL 0.1M fosfat tamponlu salin (PBS) 400 mL 0.1M fosfat tampon% 4 paraformaldehid tarafından takip pentobarbital perfüze ile derin anesteziye edildi. Perfüzyon çözümler, pH 7.4, 4 ° C'de muhafaza ve peristaltik bir pompa kullanarak dakikada 50 ml bir oranı az perfüze edildi. Kanüller postmortem doku zarar vermeden ortadan kaldırmak için, perfüze hayvan stereotaksik bir çerçeve içinde tespit edildi, kaide, manipülatör kolunun kelepçe bağlı katı bir tel yapıştırıcı ile güvenli ve kafatası dikkatle kullanarak kaide her yerinden kaldırıldı Bir diş çapak. Kaide ve altta yatan bir kanül böylece kanül yerleştirilmesi için gelişmiş olduğu aynı yörünge boyunca çıkarıldı. Brain calvaria sonra çıkarılır ve aynı fiksatif içinde 12 saat için batırıldı.
Hızlı Yeşil sürekli infüzyon, kalınlığı 200 mikron olan bölümleri değerlendirilmesi Vibratome (myNeuroLab, St Louis, MO) ve ıslak monte edilmiş cam slaytlar kullanarak kesilmiştir için. Temsilcisi bölümler Canon LIDE 600F tarayıcı kullanılarak görüntülenmiştir. Yerel travma ve reaktif gliozis değerlendirilmesi için, 70μm Vibratome bölümleri ilk ıslak monte edilmiş ve doku bozulmasını önlemek için, kurutma, boyama, ve dehidratasyon gibi histolojik süreçler ile oluşabilir lekesiz fotoğraflandı. Bu aynı bölümlerde daha sonra jelatin kaplı cam slayt üzerine kuruması için izin verildi ve kademeli alkoller ile kurutulmuş hematoksilen ve eosin (H & E) ile boyandı ve Permount ile kapak süzüldü.
Bitişiğinde 70 mikron bölümleri astrositler reaktif gliozis işlemi sırasında travma (.. Ma ve ark, 1991 Ding ve ark, 2000) tarafından ifade edilir glial fibriller asidik protein (GFAP), tespit etmek için bir standart immunofloresan prosedür uygulandı. Kısaca, serbest kesitler PBS ile yıkanır ve% 10 normal eşek serum (NDS) ve Triton X-100 (PBS / Triton) bir saat ve daha sonra% 0.3 inkübe 0,1 M PBS albumin% 3 sığır serumu ile bloke edildi tavşan anti-GFAP antikor (1:500; Sigma Chemical Co, St Louis, MO),% 1 NDS 12 saat ile 4 PBS / Triton ° C. Bölüm sonra PBS ile yıkanır ve Alexa Fluor ® 594 eşek antirabbit ikincil antikor ile inkübe edildi, oda sıcaklığında bir saat süreyle% 5 NDS ile PBS (1:500 Molecular Probes, Inc, Eugene, OR). Kesitler tekrar PBS ile iyice durulanır ve NeuroTrace ile zıt ® yeşil flüoresan Nissl leke (5 dakika PBS 1:500; Molecular Probes, Inc, Eugene, OR). PBS ile son bir durulama sonra, bölümler jelatin kaplı slaytlar üzerine monte edildi ve Yavaş Fade (Molecular Probes) dakika muamele. Tüm fotomikrografı AxioVision yazılımı (Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY) ile Zeiss Axioskop mikroskop kullanılarak elde edildi.
Sonuçlar
In vitro test
Hayvanların değerlendirme öncesinde, üç mikroinfüzyon sistemleri bir bölmesi (15 ml konik tüp) Hızlı Yeşil-dolu paspaslar yerleştirerek ve ikinci bir bölmesi (1 ml Epp microcannulas yerleştirerek tarafından hazırlanmıştır. Endorf tüp), 37 içeren steril serum fizyolojik hem ° C. Her sistem, 12 saat boyunca gözlem boya sürekli akış göstermiştir. Şekil 4, tipik bir 3 saat boyunca sistemi fonksiyonu göstermektedir.
Şekil 4: mikroinfüzyon sistem işlev in vitro gösteri. (A) Hızlı Yeşil boya Akış kolayca bir in vitro test dönemi başında mikrokanül engelsiz görülür. Akışı devam ederken, (B), (B) rezervuar çözüm doymuş ve renklenme (C) sonuçta opak hale gelir.
In vivo mikroinfüzyon sisteminin değerlendirilmesi
Perfüzyon sonra, kaldırılan microcannulas ve bunların bağlantıları dikkatle incelendi ve tüm tamamen sağlam olduğu tespit edildi. Böylece, doku içinde borosilikat cam kırılma oluştu, ne de sistem bileşenlerinin bağlantılarını herhangi bir arıza vardı. Kısa bir silikon boru uzunluğu ile, iğne bağlı 10 L tuzlu su dolu Hamilton şırınga mikrokanül bağlı polietilen boru kesme sonuna kadar nazik akış uygulamak için kullanılır oldu. Microcannulas tüm oniki devam dolaşmasına izin ve tıkalı olması görünmedi. Ayrıca, hayvanların her MOP çıkardıktan sonra, kalan çözüm hacmi ölçülür ve MOP debisi (0.125 mcL / saat) ve bu işlevi izin verildi süreyi uygun olduğu tespit edilmiştir.
In vivo teslim
Hızlı Yeşil ile aşılanmış doku koronal bölümlerin değerlendirilmesi, herhangi bir zaman noktasında (12 saat, 1 gün, 2 gün ve 4 gün) hayvanlar arasındaki dağıtım grupları içinde çok az değişkenlik göstermiştir. Şekil 5, dört gün boyunca boya infiltrasyon sürekli bir artış gösteren bu zaman noktalarında Hızlı Yeşil difüzyon temsilcisi alanları göstermektedir. Böylece zamanla mikroinfüzyon sisteminin fonksiyonu doğru değerlendirilmesine engel parankiminin hızlı opasifikasyonu sonuçlandı - Fast Green yüksek konsantrasyonlarda (% 15 örneğin, 5) kullanarak önceki deneyler, unutmayın. % 1 boya difüzyon tam manasıyla doğru brüt muayene belirlemek zor olabilir, infiltrasyon alanları 2.5X büyütme kolayca ayırt edilebilir, ve Şekil 5 kesik çizgi ile gösterilir.
Şekil 5: Hızlı Yeşil sürekli mikroinfüzyon in vivo demonstation. (A) On iki saat Fast Yeşil yüklü mikroinfüzyon sistemi intrastriatal yerleştirildikten sonra, boya mikrokanül sitesinde çevreleyen parankimi içine difüzyon görülür. 1 gün (B), 2 gün (C), ve 4 gün (D) Gözlemler boya infiltrasyon artan alanları ile hızlı Yeşil çözüm devam teslim göstermektedir. Difüzyon dış sınırı düşük güç mikroskobu altında gözlendi ve kesikli çizgiler ile gösterilir. Ölçeği bar, 2 mm.
Travma ve reaktif gliozis Değerlendirilmesi
Taze kesilmiş, lekesiz doku kesitlerinde Brüt gözlem mikroinfüzyon sistemi teslimat yerinde lokalize travma bir azalma yol açtığını gösterdi. Standart kanül değişmez bozabilir ve H & E (Şekil 6D & E) ile daha yüksek güç daha iyi takdir doku daha büyük bir alanı (Şekil 6B & C), yerinden görüldü. Ayrıca, sık sık kan, damar, büyük ölçüde bir uzlaşma öneren ve azalma, kan-beyin bariyerinin bütünlüğü ima standart infüzyon sitesi (Şekil 6D) birikmiş görüldü.
Standart bir kanül (Şekil 6F) kıyasla bir mikrokanül (Şekil 6G) ile infüzyon çevresinde GFAP azalma immünoreaktivite tarafından gösterildiği gibi mikroinfüzyon sistemi de büyük ölçüde azaltılmış reaktif gliozis sonuçlandı. Mikrokanül indüklenen GFAP boyama normal seviyeleri (Şekil 6H) üzerinde artmış iken, mikroinfüzyon sistemi istihdam, standart bir kanül yerleştirilmesi ve infüzyonu (6F) reaktif gliozis çarpıcı tırmanması görüldü.
5 gün sonra serum fizyolojik infüzyonu ivery kanül. (A) A mikrokanül m en nöroaktif ajanların ücretsiz, sınırsız akışı sağlar. Borosilikat tüp bir ucu çapı 50 ile çekti, henüz standart bir teslimat kanül (28 GA, 0.30 mm) daha küçük 6X. (B, C), neden daha fazla lokal doku hasarı (oklar) gösteren koronal bölümden lekesiz, ıslak bağlar (kalınlığı, 70 m) standart bir kanül (B) bir mikrokanül (C) ile kıyaslandığında. H & E boyanan kesitler (D, E) Yüksek güç fotomikrografı sırasıyla, B ve C gösterilmiştir. Standart kanül yerinden doku daha geniş bir alana ve damarsal lezyon (ok) kavite içinde kan toplanması gibi gösterdiği için büyük hakaret neden olan D gösterildiği gibi daha geniş bir travmatik yaralanma neden. Ancak, mikrokanül neden lezyon infüzyon yerinde doku oldukça küçük ve daha az yıkıcı. (F, G, H) İmmünofloresan GFAP karşı büyük ölçüde standart kanül lezyon etrafında GFAP + astrositler sayıları artan göstermektedir (F), mikrokanül (G) ve normal, unlesioned striatum (H) ile kıyaslandığında. Ölçek bar: A & B, 1 mm, D - H 250 m "/>.
Şekil 6: salin infüzyon 5 gün sonra standart bir teslimat kanül ile karşılaştırıldığında, bir mikrokanül neden Lokalize travma . (A) borosilikat tüp ucu çapı 50 mm ile çekilen bir mikrokanül henüz standart bir teslimat kanül (28 GA, 0.30 mm) daha küçük 6X en nöroaktif ajanların ücretsiz, sınırsız akışı sağlar. (B, C), standart bir kanül (B) bir mikrokanül (C) kıyasla neden daha fazla lokal doku hasarı (oklar) gösteren koronal bölümden lekesiz, ıslak bağlar (kalınlığı, 70 mikron). H & E boyanan kesitler (D, E) Yüksek güç fotomikrografı sırasıyla, B ve C gösterilmiştir. Standart kanül yerinden doku daha geniş bir alana ve damarsal lezyon (ok) kavite içinde kan toplanması gibi gösterdiği için büyük hakaret neden olan D gösterildiği gibi daha geniş bir travmatik yaralanma neden. Ancak, mikrokanül neden lezyon infüzyon yerinde doku oldukça küçük ve daha az yıkıcı. (F, G, H) İmmünofloresan GFAP karşı büyük ölçüde standart kanül lezyon etrafında GFAP + astrositler sayıları artan göstermektedir (F), mikrokanül (G) ve normal, unlesioned striatum (H) ile kıyaslandığında. Ölçek bar: A & B, 1 mm, D - H, 250 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çeşitli çalışmalarda intraserebral infüzyon, doku travması ve kan-beyin bariyerini hakaret teslim kanül boyutunu azaltarak (Perry ve ark, 1993) azalır olduğunu göstermiştir, inflamasyonu azalttığı ve bağışıklık tepkisi zayıflatılmış (pisi et al , 1991) ve reaktif gliozis (Nikkhah ve ark, 1994) azalır. Biz burada 6 kat, geleneksel olarak kullanılan teslim kanüller ile karşılaştırıldığında azalır çapında bir mikrokanül ile beynin içinde nöroaktif ajanlar kronik teslimat için bir yöntem mevcut. Bu sistem, zaman ve lokalize travma ve reaktif gliozis düzeyi önemli ölçüde azalır üzerinde güvenilir bir temsilcisi çözüm sağladığını göstermiştir. Bu çalışmaların nihai bir ucu çapı 50 m teslim kanül çalışan, ancak daha küçük uç çapları kullanılan olabilir. Bu tür mikroinfüzyon sistemlerin birincil erdem infüzyon çevresinde minimal travma ödemeden, çok küçük, ayrık hedeflere ajanlar sunmak için yeteneğidir.
Açıklayan infüzyon sistemi yapımında kullanılan microcannulas, önceden belirlenen uzunluklarda ve uç çapları kolayca özel yapılmış olabilir. Mikroinfüzyon sistemi, güvenli, düşük profilli fiksasyon sağlayan ve büyük bir kafatası kaide gerek kalmaz hayvanın kafatası yüzeyine uyacak şekilde tasarlanmıştır. Bu nedenle cerrahi yara kolayca böylece hayvan rahatsızlık ve enfeksiyon riskini azaltarak, akıcı bir mikroinfüzyon kaide üzerinde sütüre edilebilir. Buna ek olarak, kafatası sistem güvenliğini daha az kafatası yüzey alanı gerektirir; bu nedenle, ek veya daha sonraki işlemler, daha büyük bir kaide müdahalesi olmaksızın yapılabilir.
Burada açıklanan metodoloji istihdam bir adet Ancak, hesap belli teknik değerlendirmeler içine almalıdır. Daha yüksek seviyede beceri ve üretim ve implantasyon prosedürü daha az zaman verimli daha standart infüzyon sistemleri için olabilir. Öte yandan, bu yüksek hassasiyetli tekniği uygulayarak ayrılan zaman (ve hayvanlar), galip ya da en azından dengeli olabilir. Başka bir zorluk mikrokanül hemen hemen her çap ile özelleştirilmiş olabilir, çok küçük bir lümen mikrokanül infusate bileşenleri veya implantasyon (örneğin, kan, beyin dokusu) sırasında karşılaşılan doku tarafından tıkanır olabilir. Bu risk mikrokanül ucu implantasyon prosedürü sırasında (infusate çözünenlerin kurumasını önlemek için su ya da tuzlu doymuş pamuklu çubukla kullanarak, örneğin) nemlendirilmiş tutarak, "kan-free" cerrahi temiz performans azalır.
MOP yüklenebilir çözüm özellikle kompozisyon ve / veya viskozite için uygun bir mikrokanül ucu çapı kurmak araştırmacı tavsiye ederiz. Bu kolay bir protokol (Şekil 4) açıklanan benzer vitro test sistemi kullanılarak elde ya da monte edilen sistem, sadece 37 ° C tuzlu su çeker ve banyo bileşimi ve / izleme veya hacmini ölçerek zamanla MOP içeriğinin. Bir dezavantajı ucu çapı çok küçük (örneğin, ~ 10-50 mikron), özellikle mikrokanül nispeten kırılgan olmasıdır. Genellikle ameliyat sırasında yanlışlıkla mikrokanül kırarak, tüm sistemin değiştirilmesi olmasını gerektirir, bu birim tamir veya yeniden inşa olarak cerrahi süresi önemli ölçüde uzanacak. Bu tür teknikler yetenekli bilim adamları ve ancak nadiren uygulama titiz yöntemi deneyim kırılması,.
Deney bitiminde, mikroinfüzyon sistemi mikrokanül hasar ve bunun patentini kalmıştır edilmemiş olduğunu sağlamak için kontrol edilebilir. Nöroaktif ajan uygun miktarda teslim edilmiştir sağlamak için mini-osmotik pompa hacmi de ölçülebilir, ancak, geri dönüşüm veya yeniden pompaları tavsiye etmiyoruz. Mevcut yöntemlerden yetişkin sıçanlarda gösterilmiştir iken, travma azaltır ve sabitleme için az kafatası yüzey alanı, fareler ya da genç sıçanlar gibi küçük hayvanlar, deneyler için geleneksel yöntemleri üzerinde tercih olarak kabul edilebilir gerektiren bir sistem kullanın.
Şimdiki yöntem biraz daha ileri düzeyde deneyci tarafından yeterlilik ve beceri gerektirmesine rağmen, belki de bir büyüklük sırasına hassasiyetini arttırmak ve ilgi bölgeye travma ile ilişkili deneysel boşa en aza indirmek için sunmaktadır. Laboratuvarımızda, biz bulduk, daha güvenilir ve sağlam etkileri deneysel müdahale doğru çevirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
Tags
Nörobilim sayı 13 mini osmotik pompa kronik infüzyonu mikrokanül hızlı yeşilErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
