Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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첫째, 조직 조각을 무게와 길이, 폭, 높이를 측정합니다. 배양 배지가 있는 배양 접시에 티슈를 놓고 메스를 사용하여 작은 조각으로 주사위. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 균질화를 위해 모든 것을 C-튜브로 옮기십시오.
튜브를 기계적 해리에 놓고 필요에 따라 사이클을 실행합니다. 이 장치는 표면 단백질을 포함한 세포 무결성을 유지하면서 조직 샘플에서 실행 가능한 단일 세포를 추출하기 위해 기계적 힘을 사용합니다. 원심분리기 튜브에 고정된 세포 스트레이너를 통해 균동화를 분리합니다.
남은 조직을 다시 호질화하고 세포 여과기를 통해 균주를 튜브로 변형시다. 원심 분리는 동종 동종을 제거하고 상체를 제거합니다. 지금, 배양 배지에서 세포 펠릿을 재중단하고 소량의 세포 현탁액을 트라이판 블루 얼룩을 포함하는 튜브로 이송한다.
염색 후 세포를 혈류계 슬라이드로 옮기십시오. 투명한 실행 가능한 셀을 계산합니다. 죽은 세포는 세포막이 손상되지 않기 때문에 얼룩을 차지합니다. 다음 프로토콜에서, 우리는 CD45+ 세포의 정량적 및 질적 분석을 위해 신선한 인간 조직의 비 효소 해리를 수행 할 것입니다.
- 조직 샘플을 계량한 다음 조직의 길이, 너비 및 높이를 측정하여 시작합니다. 그런 다음 조직 조각을 적절한 화학적 정의, 혈청 프리, 조혈 세포 배지의 1 밀리리터를 포함하는 작은 페트리 접시로 옮기고 멸균 메스를 사용하여 샘플을 작은 1 ~ 2 평방 밀리미터 조각으로 주사위로 넣습니다. 다음으로, 접시 내용물들을 기계식 해리식 C-튜브로 옮기고 접시와 메스를 2밀리리터의 매체로 헹노게 한다.
C-튜브에 세척을 추가한 다음 8.01 기계식 해리를 두 번 연속 실행하여 조직 조각을 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 균질화합니다. 두 번째 주기 후에, 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 50 밀리리터 원뿔관으로 균형계를 감내십시오. 그런 다음 페트리 접시를 세척하는 것과 동일한 파스퇴르 파이펫을 사용하여 C-튜브에 남아 있는 액체를 세포 여과기로 옮기십시오.
다음으로, 1밀리리터 마이크로파이프를 사용하여 여과된 액체를 15밀리리터 원물 튜브로 옮기고 C-튜브를 추가로 3밀리리터의 배지로 헹구십시오. 이 세척을 세포 여과기를 통해 50 밀리리터 튜브로 옮겨 넣습니다. 그런 다음 깨끗한 1 밀리리터 팁으로 스트레이너 주변의 비homogenized 조직을 부드럽게 이동하여 조직에 갇힌 잔류 액체의 최대 양을 50 밀리리터 튜브로 짜냅니다. 이제 세포 스트레이너를 원래 C 튜브 위에 거꾸로 놓고 스트레이너를 배지 3 밀리리터로 헹구어 불균성 조직이 C-튜브로 다시 떨어뜨립니다.
방금 입증 된 대로 두 개의 더 많은 사이클에 대한 조직을 다시 호모겐화 한 다음 다시 세포 여과기를 통해 두 번째 동종모네이트를 부어. C-튜브를 또 다른 3 밀리리터의 중간 체와 헹맺습니다. 그런 다음 여과기를 통해 상체를 필터링하고 방금 입증 된 것처럼 조직에서 잔류 액체를 짜냅니다. 이 시점에서, 단일 세포 현탁액의 약 2.5 밀리리터의 부피는 15 밀리리터 튜브에 존재해야하며, 약 9 밀리리터는 50 밀리리터 튜브에서 관찰되어야한다.
세포로부터 조직 상신체를 분리하기 위해 실온에서 600 Gs에서 15 분 동안 두 개의 동종 튜브를 원심 분리합니다. 15 밀리리터 튜브에서 1.5 밀리리터 튜브로 상수 체재를 제거하고 섭씨 4도에 배치하고 50 밀리리터 튜브에서 상수관을 폐기하십시오. 그런 다음 단단한 표면에 각 튜브를 부드럽게 탭하여 각 셀 펠릿을 분해합니다.
50 밀리리터 튜브에 느슨한 세포 펠릿을 500 마이크로리터의 배지로 재일시 중단하고 세포를 15 밀리리터 튜브로 이송하여 두 번째 펠릿을 재일시 중단시합니다. 그런 다음 50 밀리리터 튜브를 또 다른 500 마이크로리터의 중간 크기로 헹구고 세척을 최대 세포 회복을 위해 15 밀리리터 튜브로 이송합니다. 트라이판 블루 배제에 의해 실행 가능한 세포의 수를 계산 한 후, 펠릿 셀 현탁액.
마지막으로, 예약 된 조직 상수 아래로 회전. 그런 다음 펠릿을 만지거나 방해하지 않고 상체를 적어도 하나의 깨끗한 튜브로 조심스럽게 옮기고 향후 다운스트림 분석을 위해 음의 섭씨 80도에 저장하십시오.
