Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
ראשית, לשקול שבר רקמה ולמדוד את אורכו, רוחבו וגובהו. מניחים את הרקמה בצלחת תרבות עם מדיום תרבות וקוביות אותו לחתיכות קטנות באמצעות אזמל. העבר הכל לצינור C להומוגניזציה באמצעות פיפטה פסטר.
מניחים את הצינור בדיסוציאטור מכני ולהפעיל מחזורים כנדרש. המנגנון משתמש בכוחות מכניים כדי לחלץ תאים בודדים קיימא מדגימת הרקמה תוך שמירה על שלמות הסלולר, כולל חלבוני פני השטח. דקאנט הומוגניט דרך מסננת תא קבוע על צינור צנטריפוגה.
Rehomogenize את הרקמה הנותרת ומתח הומוגנט דרך מסננת התא לתוך הצינור. צנטריפוגה הומוגנית ולהסיר את supernatant. עכשיו, resuspend גלולת התא במדיום התרבות ולהעביר כמות קטנה של השעיית התא לצינור המכיל כתם כחול trypan.
לאחר הכתמת, להעביר את התאים על שקופית hemocytometer. לספור את התאים קיימא שקוף. התאים המתים תופסים את הכתם, מכיוון שקרום התא שלהם אינו שלם. בפרוטוקול הבא, נבצע ניתוק לא אנזימטי של רקמה אנושית טרייה לניתוח כמותי ואיכותי של תאי CD45+ .
- התחל על ידי שקילה של דגימת הרקמה ולאחר מכן מדידת אורך, רוחב, וגובה של הרקמה. לאחר מכן להעביר את שבר הרקמה לתוך צלחת פטרי קטנה המכילה 1 מיליליטר של המתאים מוגדר כימית, סרום חינם, מדיום תא hematopoietic ולהשתמש אזמל סטרילי לקוביות הדגימות לחתיכות קטנות 1 עד 2 מילימטר מרובע. לאחר מכן, מעבירים את תכולת המנה לתוך צינור C דיסוציאטור מכני ולשטוף את המנה ואזמל עם 2 מיליליטר של בינוני.
מוסיפים את הכביסה לצינור C ולאחר מכן להפעיל את תוכנית ניתוק מכני 8.01 פעמיים ברציפות כדי הומוגנית בעדינות שברי הרקמה לתוך השעיה תא יחיד. לאחר המחזור השני, decant הומוגנט דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר מכן השתמש באותה פיפטה פסטר משטיפת צלחת פטרי להעביר כל נוזל שנותר בצינור C לתוך מסננת התא.
לאחר מכן, השתמש micropipette 1 מיליליטר להעביר את הנוזל המסונן לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ולשטוף את הצינור C עם 3 מיליליטר נוספים של בינוני. העבר שטיפה זו דרך מסננת התא לתוך הצינור 50 מיליליטר. ואז בעדינות להזיז את הרקמה unhomogenized סביב מסננת עם קצה נקי 1 מיליליטר כדי לסחוט את הכמות המרבית של נוזל שיורית לכודים ברקמה לתוך הצינור 50 מיליליטר. עכשיו מניחים את מסננת התא במהופך על גבי צינור C המקורי ולשטוף את מסננת עם 3 מיליליטר יותר של בינוני, כך הרקמה unhomogenized טיפות בחזרה לתוך הצינור C.
Rehomogenize את הרקמה במשך שני מחזורים נוספים כפי שהוכח רק, ולאחר מכן לשפוך את homogenate השני דרך מסננת התא שוב. לשטוף את הצינור C עם עוד 3 מיליליטר של בינוני. ואז לסנן את supernatant דרך מסננת וללחוץ את הנוזל שיורית מתוך הרקמה, כפי שהוכח רק. בשלב זה, נפח של כ 2.5 מיליליטר של השעיית תא יחיד צריך להיות נוכח בצינור 15 מיליליטר, וכ 9 מיליליטר צריך להיות שנצפה בצינור 50 מיליליטר.
כדי להפריד את הרקמה supernatant מן התאים, תחילה צנטריפוגה שני צינורות הומוגנט במשך 15 דקות ב 600 Gs בטמפרטורת החדר. דאנט supernatant מצינור 15 מיליליטר לתוך צינור 1.5 מיליליטר, הצבת אותו ב 4 מעלות צלזיוס, ולהשליך את supernatant מצינור 50 מיליליטר. לאחר מכן הקש בעדינות על כל צינור על משטח קשה כדי לשבור כל אחד כדורי התא.
resuspended גלולת התא רופף בצינור 50 מיליליטר עם 500 microliters של בינוני ולהעביר את התאים לצינור 15 מיליליטר כדי resuspend את הכדור השני. ואז לשטוף את הצינור 50 מיליליטר עם עוד 500 microliters של בינוני ולהעביר את הכביסה לצינור 15 מיליליטר להתאוששות תאים מקסימלית. לאחר ספירת מספר התאים קיימא על ידי הדרה כחולה trypan, גלולה ההשעיה התא.
לבסוף, לסובב את הרקמה השמורה supernatant. ואז בזהירות להעביר את supernatant לפחות צינור אחד נקי מבלי לגעת או להפריע גלולה ולאחסן אותו שלילי 80 מעלות צלזיוס לניתוח במורד הזרם בעתיד.
