Dissociação Mecânica: Um Método para Obter Células Viáveis de um tecido

Primeiro, pesar um fragmento de tecido e medir seu comprimento, largura e altura. Coloque o tecido em um prato de cultura com um meio de cultura e pique-o em pequenos pedaços usando um bisturi. Transfira tudo para um tubo C para homogeneização usando uma pipeta Pasteur.

Coloque o tubo em um dissociador mecânico e execute os ciclos conforme necessário. O aparelho usa forças mecânicas para extrair células únicas viáveis da amostra de tecido, mantendo a integridade celular, incluindo as proteínas superficiais. Decante o homogeneizar através de um coador de células fixado em um tubo de centrífuga.

Rehomogenizar o tecido restante e coar o homogeneizar através do coador celular no tubo. Centrifugar o homogeneizar e remover o supernante. Agora, resuspenque a pelota celular no meio da cultura e transfira uma pequena quantidade da suspensão celular para um tubo contendo mancha azul trypan.

Após a coloração, transfira as células para um deslizamento hemótmetro. Conte as células viáveis transparentes. As células mortas tomam a mancha, pois a membrana celular não está intacta. No protocolo a seguir, realizaremos a dissociação não enzimática do tecido humano fresco para análise quantitativa e qualitativa das células CD45+.

- Comece pesando a amostra de tecido e, em seguida, medindo o comprimento, largura e altura do tecido. Em seguida, transfira o fragmento de tecido para uma pequena placa de petri contendo 1 mililitro do meio celular quimicamente definido, sem soro, hematopoiético e use um bisturi estéril para colocar as amostras em pequenos pedaços de 1 a 2 milímetros quadrados. Em seguida, transfira o conteúdo do prato para um tubo C dissociador mecânico e enxágue o prato e o bisturi com 2 mililitros de médio.

Adicione a lavagem ao tubo C e, em seguida, execute o programa dissociador mecânico 8.01 duas vezes em sucessão para homogeneizar suavemente os fragmentos de tecido em uma única suspensão celular. Após o segundo ciclo, decante o homogeneizar através de um coador de células de 40 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, use a mesma pipeta Pasteur da lavagem da placa de petri para transferir qualquer líquido restante no tubo C para o coador celular.

Em seguida, use uma micropipette de 1 mililitro para transferir o líquido filtrado para um tubo cônico de 15 mililitros e enxágue o tubo C com um adicional de 3 mililitros de médio. Transfira esta lavagem através do coador de células para o tubo de 50 mililitros. Em seguida, mova suavemente o tecido nãohomogenizado ao redor do coador com uma ponta limpa de 1 mililitro para espremer a quantidade máxima de líquido residual preso no tecido no tubo de 50 mililitros. Agora coloque o coador de células de cabeça para baixo em cima do tubo C original e enxágue o coador com mais 3 mililitros de meio para que o tecido nãohomogenizado caia de volta para o tubo C.

Rehomogenizar o tecido por mais dois ciclos como apenas demonstrado, e, em seguida, despeje o segundo homogeneizar através do coador celular novamente. Enxágüe o tubo C com outros 3 mililitros de meio. Em seguida, filtrar o supernaspeuta através do coador e espremer o líquido residual para fora do tecido, como apenas demonstrado. Neste ponto, um volume de aproximadamente 2,5 mililitros de suspensão celular única deve estar presente no tubo de 15 mililitros, e aproximadamente 9 mililitros devem ser observados no tubo de 50 mililitros.

Para separar o supernascedor tecidual das células, primeiro centrífuga ambos os tubos de homogeneizar por 15 minutos a 600 Gs à temperatura ambiente. Decante o supernaspe de 15 mililitros em um tubo de 1,5 mililitro, colocando-o a 4 graus Celsius, e descarte o supernasal do tubo de 50 mililitros. Em seguida, toque suavemente cada tubo em uma superfície dura para quebrar cada uma das pelotas de célula.

Resuspended a pelota de célula solta no tubo de 50 mililitros com 500 microliters de médio e transferir as células para o tubo de 15 mililitros para resuspensar a segunda pelota. Em seguida, enxágue o tubo de 50 mililitros com outros 500 microliters de médio e transfira a lavagem para o tubo de 15 mililitros para recuperação celular máxima. Depois de contar o número de células viáveis pela exclusão azul trypan, pelota a suspensão celular.

Finalmente, gire o tecido reservado supernasal. Em seguida, transfira cuidadosamente o supernasciente para pelo menos um tubo limpo sem tocar ou perturbar a pelota e armazená-la a 80 graus Celsius negativos para futuras análises a jusante.