Mekanik Ayrışma: Dokudan Uygulanabilir Hücreler Elde Etme Yöntemi

İlk olarak, bir doku parçasını tartın ve uzunluğunu, genişliğini ve yüksekliğini ölçün. Dokuyu bir kültür ortamına sahip bir kültür kabına yerleştirin ve neşter kullanarak küçük parçalara ayırın. Pasteur pipet kullanarak homojenizasyon için her şeyi bir C tüpüne aktarın.

Tüpü mekanik bir ayrıştırıcıya yerleştirin ve gerektiğinde döngüleri çalıştırın. Cihaz, yüzey proteinleri de dahil olmak üzere hücresel bütünlüğü korurken doku örneğinden uygulanabilir tek hücreleri çıkarmak için mekanik kuvvetler kullanır. Homojenatı santrifüj tüpüne sabitlenmiş bir hücre süzgecinden çıkarın.

Kalan dokuyu yeniden züpogenize edin ve homojenatı hücre süzgecinden tüpe süzün. Homojenatı santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Şimdi, hücre peletini kültür ortamına yeniden aktarın ve hücre süspansiyonunun küçük bir miktarını trippan mavi lekesi içeren bir tüpe aktarın.

Lekelemeden sonra, hücreleri bir hemositometre slaydına aktarın. Şeffaf uygulanabilir hücreleri sayın. Ölü hücreler lekeyi alır, çünkü hücre zarları sağlam değildir. Aşağıdaki protokolde, CD45+ hücrelerinin nicel ve nitel analizi için taze insan dokusunun enzimatik olmayan ayrışması gerçekleştireceğiz.

- Doku örneğini tartarak ve daha sonra dokunun uzunluğunu, genişliğini ve yüksekliğini ölçerek başlayın. Daha sonra doku parçasını kimyasal olarak tanımlanmış, serumsuz, hematopoetik hücre ortamının 1 mililitresini içeren küçük bir petri kabına aktarın ve örnekleri küçük 1 ila 2 milimetrelik parçalara zarlamak için steril bir neşter kullanın. Daha sonra, çanak içeriğini mekanik bir ayrıştırıcı C tüpüne aktarın ve kabı ve neşteri 2 mililitre orta ile durulayın.

Yıkamayı C tüpüne ekleyin ve ardından doku parçalarını tek bir hücre süspansiyonuna hafifçe homojen hale getirmek için 8.01 mekanik ayrıştırıcı programını art arda iki kez çalıştırın. İkinci döngüden sonra, homojenatı 40 mikrometre hücreli bir süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe deklare edin. Daha sonra C tüpünde kalan herhangi bir sıvıyı hücre süzgecine aktarmak için petri kabını yıkamaktan aynı Pasteur pipetini kullanın.

Daha sonra, filtrelenmiş sıvıyı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 1 mililitrelik bir mikropipette kullanın ve C tüpünü ek 3 mililitre orta ile durulayın. Bu yıkamayı hücre süzgecinden 50 mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra, dokuda sıkışan maksimum miktardaki artık sıvıyı 50 mililitrelik tüpe sıkıştırmak için süzgeç etrafında temiz bir 1 mililitre ucu ile unhomogenized dokuyu hafifçe hareket ettirin. Şimdi hücre süzgecini orijinal C tüpünün üzerine baş aşağı yerleştirin ve süzgeci 3 mililitre daha ortamla durulayın, böylece unhomogenized doku C tüpüne geri düşer.

Az önce gösterildiği gibi iki döngü daha dokuyu yeniden anojenleştirin ve ardından ikinci homojenatı tekrar hücre süzgecinden dökün. C tüpünü 3 mililitre daha orta ile durulayın. Daha sonra süpernatantı süzgeçten geçirin ve az önce gösterildiği gibi artık sıvıyı dokudan sıkın. Bu noktada 15 mililitrelik tüpte yaklaşık 2,5 mililitrelik tek hücreli süspansiyon hacmi bulunmalı ve 50 mililitrelik tüpte yaklaşık 9 mililitre gözlenmelidir.

Doku süpernatantı hücrelerden ayırmak için, önce her iki homojenat tüpünü oda sıcaklığında 600 Gs'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı 15 mililitrelik tüpten 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin, 4 santigrat dereceye yerleştirin ve süpernatantı 50 mililitrelik tüpten atın. Ardından, hücre peletlerinin her birini parçalamak için sert bir yüzeydeki her tüpe hafifçe dokunun.

50 mililitrelik tüpteki gevşek hücre peletini 500 mikrolitre orta ile yeniden biriktirdi ve ikinci peletin yeniden dirilmesi için hücreleri 15 mililitrelik tüpe aktardı. Daha sonra 50 mililitrelik tüpü 500 mikrolitre daha orta ile durulayın ve maksimum hücre iyileşmesi için yıkamayı 15 mililitrelik tüpe aktarın. Trypan mavi dışlama ile uygulanabilir hücre sayısını saydıktan sonra, hücre süspansiyonu pelet.

Son olarak, ayrılmış doku süpernatant aşağı çevirin. Daha sonra pelete dokunmadan veya rahatsız etmeden süpernatant'ı en az bir temiz tüpe dikkatlice aktarın ve gelecekteki aşağı akış analizi için negatif 80 santigrat derecede saklayın.