Механическая диссоциация: метод получения жизнеспособных клеток из ткани

Во-первых, взвесить фрагмент ткани и измерить ее длину, ширину и высоту. Поместите ткань в культуру блюдо с культурой среды и кости его на мелкие кусочки с помощью скальпеля. Перенесите все в C-трубку для гомогенизации с помощью пипетки Pasteur.

Поместите трубку в механический диссоциатор и запустите циклы по мере необходимости. Аппарат использует механические силы для извлечения жизнеспособных одиночных клеток из образца ткани, сохраняя при этом клеточную целостность, включая поверхностные белки. Декант гомогената через клеточный ситечко, закрепленное на центрифуге трубки.

Рехомогенизировать оставшиеся ткани и процедить гомогенат через ситечко клетки в трубку. Центрифугать гомогенат и удалить супернатант. Теперь, resuspend гранулы клетки в средстве культуры и перенести небольшое количество подвески клетки к пробке содержа trypan голубое пятно.

После окрашивания перенесите клетки на слайд гемоцитометра. Подсчитайте прозрачные жизнеспособные ячейки. Мертвые клетки принимают пятно, так как их клеточная мембрана не повреждена. В следующем протоколе мы будем выполнять неинсиматическую диссоциацию свежих тканей человека для количественного и качественного анализа клеток CD45.

- Начните с взвешивания образца ткани, а затем измерения длины, ширины и высоты ткани. Затем перенесите фрагмент ткани в небольшую чашку Петри, содержащую 1 миллилитр соответствующей химически определенной, без сыворотки, гематопоэтической клеточной среды и используйте стерильный скальпель, чтобы нарезать образцы мелкими кусочками размером от 1 до 2 квадратных миллиметров. Затем перенесите содержимое блюда в механический диссоциатор C-трубки и промойте блюдо и скальпель с 2 миллилитров среднего.

Добавьте стирку в C-трубку, а затем запустите программу механического диссоциатора 8.01 два раза подряд, чтобы мягко гомогенизировать фрагменты тканей в одноклеточную подвеску. После второго цикла, декант гомогената через 40-микрометровый ситечко клеток в 50-миллилитровую коническую трубку. Затем используйте тот же пастер пипетки от мытья чашки Петри для передачи любой жидкости, оставшейся в C-трубки в клетку ситечко.

Затем используйте 1-миллилитровый микропипют для переноса фильтрованной жидкости в 15-миллилитровую коническую трубку и промыть C-трубку дополнительными 3 миллилитров среды. Перенесите эту стирку через клеточный ситечко в 50 миллилитровую трубку. Затем аккуратно переместите неоднородную ткань вокруг ситечкой с чистым 1-миллилитровым наконечником, чтобы выжать максимальное количество остаточной жидкости, попавшие в ткань, в 50-миллилитровую трубку. Теперь поместите клеточный ситечко вверх дном поверх оригинальной C-трубки и промойте ситечко еще 3 миллилитров среды так, чтобы неоднородная ткань упала обратно в C-трубку.

Рехомогенизировать ткани еще на два цикла, как только что показали, а затем залить второй гомогенат через ситечко клетки снова. Промыть C-трубку с еще 3 миллилитров среды. Затем процедите супернатант через ситечко и выжмите остаточную жидкость из ткани, как только что продемонстрировано. На данный момент, объем около 2,5 миллилитров одноклеточной подвески должны присутствовать в 15-миллилитровой трубке, и примерно 9 миллилитров должны наблюдаться в 50-миллилитровой трубке.

Чтобы отделить ткань от клеток, сначала центрифуга обе трубки гомогената в течение 15 минут при 600 Г при комнатной температуре. Декант супернатант из 15-миллилитровой трубки в 1,5-миллилитровую трубку, поместив его на 4 градуса по Цельсию, и отбросьте супернатант из 50-миллилитровой трубки. Затем аккуратно коснитесь каждой трубки на твердой поверхности, чтобы разбить каждую из клеточных гранул.

Resuspended свободные гранулы клеток в 50-миллилитровой трубки с 500 микролитров среднего и передачи клеток в 15-миллилитровую трубку, чтобы повторно использовать второй гранулы. Затем промойте 50-миллилитровую трубку еще 500 микролитров среднего и перенесите стирку в 15-миллилитровую трубку для максимального восстановления клеток. После подсчета количества жизнеспособных клеток путем trypan синего исключения, гранулы клеточной подвески.

Наконец, спина вниз зарезервированной ткани supernatant. Затем осторожно перенесите супернатант хотя бы в одну чистую трубку, не касаясь и не нарушая гранулы, и храните ее при отрицательном 80 градусах по Цельсию для будущего анализа ниже по течению.