साबुत प्लास्मिड के घर साइट निर्देशित… (Translated to Hindi)

Cite this Article: साबुत प्लास्मिड के घर साइट निर्देशित mutagenesis

Laible, M., Boonrod, K. Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids. J. Vis. Exp. (27), e1135, doi:10.3791/1135 (2009).

Abstract: साबुत प्लास्मिड के घर साइट निर्देशित mutagenesis

साइट पूरे plasmids के निर्देशित mutagenesis के एक मूल प्लाज्मिड थोड़ा अलग अलग रूपों बनाने के लिए एक सरल तरीका है. इस विधि के साथ क्लोन लक्ष्य जीन प्रतिस्थापन, या एक प्लाज्मिड में सीधे कुछ ठिकानों का विलोपन प्रविष्टि के द्वारा बदला जा सकता है. यह बस एक गैर thermocycling पीसीआर आधारित प्रतिक्रिया में, पूरे प्लाज्मिड amplifying द्वारा काम करता है है. प्रतिक्रिया के दौरान mutagenic प्राइमरों, इच्छित उत्परिवर्तन ले, नए संश्लेषित प्लाज्मिड में एकीकृत कर रहे हैं. में इस वीडियो ट्यूटोरियल हम एक आसान और लागत प्रभावी करने के लिए एक प्लाज्मिड में आधार substitutions परिचय प्रदर्शित करता है. प्रोटोकॉल मानक अभिकर्मकों के साथ काम करता है और वाणिज्यिक किट, जो अक्सर बहुत महंगे हैं से स्वतंत्र है. इस प्रोटोकॉल लागू यह क्या वाणिज्यिक किट के कुछ का उपयोग की लागत का एक आठवीं के लिए एक प्रतिक्रिया की कुल लागत को कम कर सकते हैं. इस वीडियो में हम भी इस प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण कदम पर टिप्पणी और कैसे mutagenic प्राइमरों डिजाइन करने के लिए पर विस्तृत निर्देश दे.

Protocol: साबुत प्लास्मिड के घर साइट निर्देशित mutagenesis

विधि का सिद्धांत:

साइट का निर्देशन पूरे plasmids के mutagenesis के इस वीडियो में एक mutagenesis के विधि है जो आप एक प्रतिस्थापन, या कुछ ठिकानों का विलोपन प्रविष्टि के द्वारा क्लोन एक प्लाज्मिड में सीधे लक्ष्य जीन को बदलने की अनुमति देता है समझाया. यह एक गैर thermocycling पीसीआर आधारित प्रतिक्रिया में, पूरे प्लाज्मिड amplifying द्वारा काम करता है. प्रतिक्रिया के दौरान mutagenic प्राइमरों, बेमेल के रूप में मूल प्लाज्मिड वांछित उत्परिवर्तन ले जाने, नए संश्लेषित प्लाज्मिड में एकीकृत कर रहे हैं. मूल प्लाज्मिड की प्रतिक्रिया से हटाने के बाद mutated प्लाज्मिड ई. में तब्दील हो जाता है कोलाई निम्नलिखित कदम स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए ही कर रहे हैं, क्योंकि इस विधि का उत्परिवर्तन क्षमता 100% नहीं है. पूरी प्रक्रिया में तीन दिन लगते हैं, लेकिन मुख्य भाग के एक दिन के भीतर किया जा सकता है है.

1.0 एक दिन:

1.1 Thermocycling प्रतिक्रिया:

मूल प्लाज्मिड: इस साइट mutagenesis के प्रोटोकॉल निर्देशित 10kb करने के लिए ऊपर plasmids के साथ सबसे अच्छा काम करता है . बड़ा प्लास्मिड एक बिट के लिए इस विधि के साथ रूपांतरित होना मुश्किल कर रहे हैं और कुछ धैर्य और thermocycling शर्तों और / या सक्षम कोशिकाओं के समायोजन ले सकता है. इसके अलावा प्लाज्मिड जो आप के साथ काम + बांध बैक्टीरिया तनाव से अलग होना चाहिए. Thermocycling प्रतिक्रिया के लिए आप प्लाज्मिड आप के रूप बदलना चाहते हैं 10 से 60 ngs की आवश्यकता होगी.

प्राइमर्स: इससे पहले कि आप अपने thermocycling प्रतिक्रिया सेट कर सकते हैं आप हाथ में अपने प्राइमरों है. आप हर mutagenic प्राइमर के बारे में 150 एनजी की जरूरत है. यह ठीक है अगर आप 1:10 पतला 100 PM स्टॉक के 1.5 μl ले. वहाँ कुछ सरल दिशा निर्देशों आप जब अपने mutagenic प्राइमरों डिजाइन पर विचार करना चाहिए रहे हैं:

प्राइमरों एक दूसरे के पूरक होना चाहिए
प्राइमरों लंबाई में 25 और 45 nucleotides के बीच होना चाहिए
मूल प्लाज्मिड बेमेल के रूप में परिवर्तन दोनों प्राइमरों में निहित होना चाहिए
बेमेल प्राइमर में केंद्रित किया जाना चाहिए और प्रत्येक पक्ष पर कम से कम 8 nucleotides द्वारा flanked
प्राइमरों कम से कम 40% की जीसी सामग्री चाहिए
प्राइमरों 5 प्रधानमंत्री और तीन प्रधानमंत्री के साथ एक या एक से अधिक जी या Cs अंत होना चाहिए
प्राइमरों की जरूरत नहीं है phosphorylated है, न ही वे FPLC या PAGE विशुद्ध, केवल desalted वे किया जाना चाहिए किया जाना है.
Tm की गणना के लिए आप किसी सूत्र लेकिन Tm शिपिंग प्रमाण पत्र पर 60 से अधिक होना चाहिए डिग्री सेल्सियस की जरूरत नहीं है
स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए यह व्यावहारिक है सम्मिलित करने के लिए या अपने उत्परिवर्तन के साथ प्रतिबंध साइट को हटाना. आनुवंशिक कोड के अध: पतन की वजह से वहाँ कई संभावनाओं करने के लिए अपने वांछित परिवर्तन के साथ प्रतिबंध साइट सम्मिलित हैं. न्यू इंग्लैंड Biolabs की वेबसाइट पर इस तरह के एक उचित प्रतिबंध साइट खोजने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है. बस अपने प्राइमर अमीनो एसिड अनुक्रम आप की इच्छा के लिए कोडिंग, अनुक्रम डीएनए के लिए अस्पष्टता कोड का उपयोग कर दर्ज करें. एंजाइम खोजक उपकरण आपको बता सकते हैं जो प्रतिबंध साइटों अपने वांछित परिवर्तन के लिए समानांतर शुरू कर सकते हैं होगा. यदि आप इस तरह से किसी भी संभव या व्यावहारिक प्रतिबंध साइट नहीं मिल सकता है, तो आप साइट पर उत्परिवर्तन के आनुवंशिक कोड के विषय में बिना किसी भी नए प्रतिबंध साइट सम्मिलित हो सकता है. इसके बाद आप इस म्यूटेशनों की एक श्रृंखला है, जो में इस प्रतिबंध साइट में नए mutagenic प्राइमरों के सम्मिलन से हटा दिया जाएगा के लिए टेम्पलेट के रूप में प्लाज्मिड उपयोग कर सकते हैं. यह दृष्टिकोण बहुत सुविधाजनक हो सकता है अगर आप प्लाज्मिड के एक ही साइट पर परिवर्तन की एक श्रृंखला की योजना बना रहे हैं हो सकता है.

डीएनए पोलीमरेज़: इस विधि के लिए आप एक थर्मास्टाइबल डीएनए पोलीमरेज़ है जो '3'-5 exonuclease गतिविधि दर्शाती है और मुँहफट समाप्त होता है बनाता है की जरूरत है . हम हमेशा Fermentas से पुनः संयोजक Pfu - पोलीमरेज़ का उपयोग करें. यदि आप प्रवर्धन कदम के साथ समस्याओं को मिला है आप एक उच्च गुणवत्ता पोलीमरेज़ की कोशिश करो, लेकिन हो सकता है सबसे प्रयोजनों के लिए मानक Pfu पर्याप्त होगा. DNTPs, पोलीमरेज़ बफर और पानी के साथ प्रतिक्रिया को पूरा करें.

1.2 Thermocycling शर्तों

thermocycler निम्नलिखित तरीके में स्थापना की जानी चाहिए. प्रारंभिक और आवर्ती विकृतीकरण चरण 95 डिग्री सेल्सियस पर 30sec के लिए सेट कर दिया जाता है

प्राइमरों की annealing तापमान जटिल फार्मूले के साथ गणना नहीं करना चाहिए. हम आम तौर पर annealing तापमान 55 डिग्री सेल्सियस और annealing एक मिनट के लिए समय निर्धारित किया है. जो आप ज्यादातर का उपयोग किया जाएगा 25 से 30 nucleotides के प्राइमरों के लिए, यह हमारे लिए समय के 95% काम करता है. और 60 डिग्री सेल्सियस - किसी भी तरह अगर यह काम नहीं करना चाहिए, बस 50 के बीच annealing तापमान अलग - अलग करने की कोशिश

बढ़ाव तापमान पोलीमरेज़ आप उपयोग पर निर्भर करता है है. इस प्रदर्शन में हम Pfu - Fermentas से पोलीमरेज़ ° है जो 72 के एक बढ़ाव तापमान लिए कॉल सी. का उपयोग बढ़ाव समय प्लाज्मिड के आकार के अनुसार भिन्न होता है. हम हमेशा केबी प्रति एक मिनट की गणना, और कहा कि एक अतिरिक्त मिनट जोड़नेसमय है. उदाहरण के लिए, एक 9kb प्लाज्मिड के लिए हम बढ़ाव समय के रूप में 10min चुनना होगा.

18 चक्र बनाने के लिए पर्याप्त आगे उपयोग के लिए प्लाज्मिड उत्परिवर्तित के लिए पर्याप्त हैं. कम चक्र की संख्या में रखते हुए, यह भी आप समय बचाता है.

चित्रा 1

1.3 Gelcheck बाद Thermocycling प्रतिक्रिया

सफल प्रवर्धन एक वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन द्वारा जाँच की जानी चाहिए. सीधे के बाद साइकिल समाप्त हो गया है, एक 1% TAE agarose जेल पर प्रतिक्रिया के 5 μl लोड. अगर प्रवर्धन सफल रहा था, आप एक अलग बैंड देखना चाहिए. लेकिन अगर नव संश्लेषित डीएनए जेल पर स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं है, तो आप पूरे प्रतिक्रिया वेग कोशिश करते हैं और यह अगले कदम में परिवर्तन के लिए उपयोग कर सकते हैं. हमारे लिए यह शायद ही कभी काम किया है लेकिन यह एक कोशिश देने लायक है. सबसे अच्छी बात अगर प्रतिक्रिया नहीं काम करता है annealing तापमान को समायोजित करने के लिए है.

1.4 DpnI पाचन:

परिवर्तन से पहले मूल प्लाज्मिड जो एक टेम्पलेट के रूप में सेवा की प्रतिक्रिया के लिए मजबूत पृष्ठभूमि को रोकने से हटाया जाना चाहिए. यह DpnI के साथ प्रतिबंध पाचन द्वारा किया जाता है. यह प्रतिबंध endonuclease कटौती केवल प्लाज्मिड methylated. इसकी मान्यता और प्रतिबंध साइट अनुक्रम GATC है जबकि एक के लिए methylated हो गया है. जब DpnI साथ पचा ही मूल unmutated प्लाज्मिड जो बांध से अलग किया गया था + तनाव कट जाता है, नए संश्लेषित उत्परिवर्तित प्लाज्मिड DpnI जो नहीं methylated है से प्रभावित नहीं है. बस प्रतिक्रिया DpnI के 1-2 μl को जोड़ने और 37 पर यह कम से कम एक घंटे सेते °. जब फास्ट पचाने में DpnI ऊष्मायन समय का उपयोग के बारे में 15 मिनट के लिए कम किया जा सकता है है. अपने DpnI और इस प्रतिबंध पाचन की ऊष्मायन समय की गुणवत्ता काफी निर्धारित करता है कैसे मजबूत unmutated प्लाज्मिड के साथ अपनी पृष्ठभूमि जाएगा.

1.5 परिवर्तन:

DpnI पाचन के बाद प्लाज्मिड सक्षम ई. में परिवर्तन के लिए तैयार है कोलाई कोशिकाओं. बस DpnI पाचन प्रतिक्रिया से सक्षम कोशिकाओं में 5 μl और परिवर्तन जोड़ने के प्रदर्शन के रूप में अपनी प्रयोगशाला में सिफारिश. हमारे मामले में हम 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण बैक्टीरिया प्लाज्मिड incubating और फिर 90 के लिए 42 डिग्री सेल्सियस सेकंड में गर्मी झटका गर्मी झटका प्रक्रिया का उपयोग करें. 200 μl समाज समाधान जोड़ने के बाद, बैक्टीरिया incubated हैं, सख्ती 37 में मिलाते हुए, एच. 1 डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के बाद बैक्टीरिया अगर मीडिया के चयन पर चढ़ाया जाता है.

2.0 दो दिन

2.1 क्लोन भाग 1 की स्क्रीनिंग: क्लोनों का चयन

क्योंकि उत्परिवर्तन दक्षता 100% नहीं है आप अपने म्यूटेंट के लिए स्क्रीन की जरूरत है. हम प्रतिबंध पाचन जिसमें हम जो हम जोड़ा या प्राइमर एकीकरण के माध्यम से हटाए गए प्रतिबंध साइट की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए की जाँच करें द्वारा इस करते हैं. इस प्रयोजन के लिए हम आम तौर पर आठ कालोनियों लेने और रात में उन्हें अगले दिन पर प्लाज्मिड तैयारी के लिए विकसित.

3.0 तीन दिन

क्लोन भाग 2 के 3.1 स्क्रीनिंग: मार्कर एंजाइम के साथ प्रतिबंध पाचन

तीसरे दिन आप एक मिनी और अपने मार्कर एंजाइम के साथ बाद प्रतिबंध पाचन तैयारी करते हैं. जेल में तो आप देख सकते हैं अपने क्लोनों में से एक है जो वांछित उत्परिवर्तन ले और लोगों को जो नहीं है.

स्क्रीनिंग प्रतिबंध पाचन पद्धति का उपयोग करके बहुत अच्छी तरह से काम करता है. फिर भी, आप अनुक्रमण द्वारा अपने सफल उत्परिवर्तन की पुष्टि करना चाहिए.

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Discussion: साबुत प्लास्मिड के घर साइट निर्देशित mutagenesis

साइट निर्देशित mutagenesis के एक mutagenesis के विधि है जो एक तेजी से एक प्लाज्मिड द्वारा किए गए जीन रूप बदलना तरीका प्रदान करता है. पूरे प्रतिक्रिया केवल एक दिन में किया जा सकता है. इस विधि के साथ, यह केवल मानार्थ प्राइमरों वांछित म्यूटेशनों ले जाने की एक जोड़ी और Pfu - पोलीमरेज़ जैसे proofreading पोलीमरेज़ की आवश्यकता होगी. नए संश्लेषित प्लाज्मिड प्रतिबंध एंजाइम DpnI के साथ प्रतिक्रिया पचाने के द्वारा माता - पिता प्लाज्मिड से अलग किया जा सकता है. यह एंजाइम केवल डीएनए methylated हज़म. इसलिए केवल नए संश्लेषित प्लाज्मिड तब्दील किया जा सकता है. इस ट्यूटोरियल में हम एक घर mutagenesis किट का उपयोग करके एक साइट निर्देशित mutagenesis के प्रदर्शन का प्रदर्शन किया. इस किट के लाभ लागत बचत जबकि प्रभावशीलता रहता है. इस विधि के महत्वपूर्ण बिंदुओं प्राइमर डिजाइन और annealing तापमान हैं. मामले में नए संश्लेषित डीएनए कल्पना नहीं वैद्युतकणसंचलन के बाद, जो विधि की विफलता का संकेत हो सकता है, एक पूरी और बैक्टीरिया में परिवर्तन के लिए इसे का उपयोग करें प्रतिक्रिया वेग की कोशिश कर सकते हैं कर सकते हैं. हालांकि इस समस्या को हल करने का सबसे अच्छा तरीका annealing तापमान का अनुकूलन या प्राइमरों में लगातार क्षेत्र की लंबाई में वृद्धि की कोशिश कर रहा है. इसके अलावा, एक उच्च गुणवत्ता पोलीमरेज़ या प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग भी प्रतिक्रिया की संवेदनशीलता में सुधार हो सकता है. सक्षम कोशिकाओं को भी एक महत्वपूर्ण कारक है जो इस विधि का successfulness प्रभाव हैं. इसलिए (107 cfu / μg डीएनए) मध्यम या उच्च (109 cfu / μg डीएनए) सक्षम कोशिकाओं बेहतर कर रहे हैं.

हालांकि इस ट्यूटोरियल में हम विलोपन या घर का बना किट का उपयोग करके प्रविष्टि प्रदर्शित नहीं किया है, हम हमारी प्रयोगशाला में इन सफल रहे थे. हम को सफलतापूर्वक विकल्प, सम्मिलित या एक ही समय में कम से कम 3 अड्डों हटाने के करने में सक्षम थे.

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Disclosures: साबुत प्लास्मिड के घर साइट निर्देशित mutagenesis

Materials: साबुत प्लास्मिड के घर साइट निर्देशित mutagenesis

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pfu polymerase (recombinant or native)	Fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
primers	Invitrogen		desalted

References: साबुत प्लास्मिड के घर साइट निर्देशित mutagenesis

Papworth, C, Bauer, JC, Braman, J, Wright, DA QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies 1996, 9:3-4

Ask the Author: साबुत प्लास्मिड के घर साइट निर्देशित mutagenesis

16 Comments

I know your publication is not about a kit, but I was wondering if you can help me. Using a kit, I get through the amplification step with a product, but the transformation is unsuccessful. The control plasmid I use in every transformation (has not undergone amplification) gives positive results. I tried lengthening the extension time, yet still, no colonies. Do you have any idea what could be wrong? I've heard about duplication of primers during amplification. Do you think this could be the problem? Unfortunately, I don't have a restriction site where I need the mutation. Thank you for any help!

Posted by: LeahJuly 23, 2009, 2:11 PM

Another reason why the transformation is not working, could be the size of your plasmid. With large plasmids we also have problems in transformation. Try using very high competent cells or even electroporation. Hope I could help you.

1.1

Posted by: AnonymousJuly 31, 2009, 8:04 AM

Hi Leah, which kit are you using? Does it use the same principle as we use? There are other kits on the market where you have to perform ligation prior to transformation (Phusion kit from neb). You may also check if it actually is the right plasmid you are amplifiying by performing restriction digestion with it after amplification and comapre it to your input plasmid. Otherwise you could use your input plasmid as control plasmid in transformation to check if it gives colonies. To help you more, I need more information about the kit your using and any points were you vary from the original protocol.
Best wishes

Posted by: MarkJuly 24, 2009, 4:56 PM

Mark, I was using a Stratagene Kit. I used my input plasmid as the transformation control, and that does give colonies. I gave up on the kit and tried your method. I get a few colonies, but now am not sure if the plasmid was mutated properly. It's a long and complicated discussion! I would type it if you have time to read it! :)

2.1

Posted by: LeahOctober 6, 2009, 11:59 AM

Hi Leah, you can check your succesfull mutation by restriction digestion if you inserted or deleted the appropriate restriction sites with your mutagenic primers. If you are not able to introduce the sites together with your desired mutation you could first introduce a restriction site and then delete it by introducing your desired mutation. The introduction of a restriction site could then also serve as a control if the method is working. This would be the cheapest way. The easiest way would be to introduce your mutation without restriction marker and verify your successful mutation by sequencing of a number of colonies. When you choose this approach you could enhance the DpnI digestion to reduce background. However, you should always verify your mutation by sequencing before moving on with your experiments.
Feel free to type your problems up, I would be happy if I could help you. Best wishes

2.1.1

Posted by: MarkOctober 8, 2009, 3:40 PM

Unfortunately, I can't insert a restriction site because the area I would like to mutagenize is in the replication region, in the antisense RNA region. I went ahead and tried again with different primers and over and over, I get no colonies after transformation. I use about 60ng DNA, I have varied the annealing temp, tried longer extension times. Maybe I'm not using enough dNTPs? I'm pretty terrible at some of the math regarding concentration. :) I have a 40mM stock that I've been taking .5uL and putting it in a 50uL reaction. Should I be using 1uL? I'm also wondering if maybe the added mutations cause so much of a difference in the RNA that it can't function and thus, cannot be established in a cell? I'm getting minimal help from my lab, so any insight would be very much appreciated.

2.1.1.1

Posted by: AnonymousNovember 6, 2009, 2:59 PM

Hi Leah, do I understand you right, your region of intrest lies in the origin of replication of the plasmid? If your region of intrest is not essential for plasmid maintainence you can try to mutate it and create a restriction site as a positive control. This one you can then mutate to your desired sequence, then using the absence of the restriction site as assay for succesful mutation. If your region of intrest is in the origin of replication and does not allow any big changes you could verify your mutation by sequencing. Regarding the dNTPs, polymerases usually require a concentration of 200�M or lower per dNTP. So just take 1�L of a 10mM dNTP mix for a 50�L reaction. Do you get a product on the gel after the reaction, check 5�L on a gel, you should see a distinct band. You may also try using electroporation for transformation, or try a different polymerase (proofreading, non strand displacing and producing blunt ends). Hope this helps you. Good luck.

2.1.1.1.1

Posted by: MarkNovember 11, 2009, 1:04 PM

Hello,
I was wondering if you need to do ligation with this protocol.
Also, if the primers are complementary, is there much likelihood of producing primer dimers, and how can we overcome that?

Thanks for you help

Posted by: AnonymousMarch 16, 2010, 12:01 AM

Hi,
ligation is not needed in this protocol. Normally no problems are observed with primer dimers if you stick to the protocol (ca 25-45 bp primers with at least 8 perfectly matching bases on either side of the mismatched region). If you have problems, you can try to make the primers shorter. By the way, purification of primers (HPLC or PAGE) will also enhance the efficiency and accuracy of the reaction.

Have fun

Posted by: MarkMarch 16, 2010, 5:53 PM

i ordered the finnzyme,s (phusion) kit for site directed mutagenesis. and in that kit the primer designing was different. i have primers which are designed back to back and they are 5' phosphorylated(for lagation purpose). kindly guide me if i can use these primers with this protocol. coz unfortunately i didn get that kit. i have to complete this part of my work in a week. i m relly worried.

Posted by: aliyaJune 2, 2010, 2:23 PM

those primers are not overlapping and one of them have mutation (single). in taht kit they used hot start DNA polymerase. i have used the pfu polymerase. but got ambigous result. there were 2 bands in pcr product. one of 3.5kb(size of vector(ptz) +my gene) and a 3 kb band. i wonder Y pcr produced 2 bands :(

Posted by: aliyaJune 2, 2010, 2:31 PM

Hi Aliya, I would assume that you can exchange the phusion polymerase for the standard pfu (and reverse)as they both have the same basic functions (generating blunt ends, no strand displacing activity, proofreading). Also the orientation and design of the primers can vary a lot between different mutagenesis protocols available, so there are definetely many ways to mutate a plasmid. In your case I would say it's ok to use pfu instead of phusion as long as you use the correct cycling conditions. If you get two bands, you could either play around with the cycling conditions and/or primer design or you could just simply extract the band of correct size and use it for the ligation. Hotstart polymerases have several advantages (mainly higher specificty) but they are not necessarily needed. If you still have problems, you may also order new primers and stick with the protocol above. Hope this will help you.
Have fun
Mark

Posted by: MarkJune 7, 2010, 4:48 PM

Hi Mark, i have recently ordered new primers (overlapping primers having mutation in middle of the sequence) but i i can,t add a restriction site in them coz mutation is in middle of my gene. and in ur protocol u didn mentioned about the size i mean the plasmid plus insert which u r using. my plasmid is of 2.8 and my gene is about .5kb. would this procedure work for this size of DNA. and how the nick protroduced in the strands would be sealed in the end. and another question is in fermentas prescribed manual for pcr wd pfu polymerase it is mention that the extension time should be 2min/kb. which makes almost 12 min for my DNA. what should i do now.
thanx for ur guidence

7.1

Posted by: AliyaJune 15, 2010, 1:55 AM

Hi Aliya
If your desired mutation is in the middle of the gene and you dont want to insert "silent" mutations you can check by Sanger sequencing of a few clones. Mostly all of them carry the correct mutation. The size of your plasmid is totally fine for the protocol. For thermocycling you should definetely stick to the protocol of the supplier, if pfu is too slow for you just take phusion. Also I'm sure that not all 18 cylces we recommend in the protocol are needed. But generally the cycling times are quite long in this protocol, this is normal. The nick in the plasmid is repaired upon transformation in the bacteria.
Have fun

7.1.1

Posted by: MarkJune 15, 2010, 4:06 AM

Hi Mark
thanx a lot for ur guidence. i followed that protocol and i succeded to introduce my desired mutation in gene. i just did it in 1st attempt. i got positive results by sanger sequencing. thanx :)

7.1.1.1

Posted by: aliyaAugust 2, 2010, 1:42 AM

can u tell me the mechanism of this method. how many copies of mutated plasmid will be produced by this method from pcr of single unmutated plasmid. i am a bit confused how the primers aneal and synthesis more copies from newly synthesized strands in next cycles of pcr.

Posted by: shazarSeptember 29, 2010, 12:35 PM

Hi Shazar,
the plasmid amplification works by a non PCR based thermocycling reaction (no exponential amplification but a linear one, similar to sanger sequencing just without disrupting nucleotides). The amount of mutated plasmid will be increased by the amount of input plasmid with every cycle, assuming the reaction is 100% efficient. So if you use 50ng of template, after the first cycle there should be 50ng of mutated plasmid, after the second cycle 100, after the third 150ng and so on. The amplification only takes place on the original plasmid and not on the newly synthesized (to my best knowledge). The newly synthesized plasmid strands then form plasmids with nicks in each strand which lie at the 5 prime end of each of the primers. If you transform this nicked plasmid into E. coli the nicks get repaired and result in a normal plasmid. I think in the video there's a scheme of the amplification process. If you cant acces the video you can view the article which the viedo is based on (in german). It contains the same scheme. www.laborjournal.de/rubric/tricks/tricks/trick126.lasso
All the best
Mark

8.1

Posted by: AnonymousSeptember 29, 2010, 5:28 PM

Hi,
I have the problem of primer dimer with this protocol and i did not find any band after gel then i redesigned the primer which are partially overlaping and it works well in the first time and i got a good band
but when i repeat it again it failed -----i used the same primers but changed only one amino acid in the same position
i do not know what should I do ?
any advise will be helpful to me

Posted by: Marium45July 7, 2011, 10:43 PM

Hello Friends..
Well iam working on Site-directed mutagenesis of one gene coding for one enzyme,however i dont get desired mutant ,sequencing results in undesirable mutation beside desired mutation. I follow strategene quick change mutagenesis protocol. I use pET28a vector.Could anyone please guide how to adress this issue..Thanks fr d help..

Posted by: shadAugust 12, 2011, 5:14 AM

Hi Shad,
have you made sure that the undesired mutation was caused by the mutagenesis and was not present already before? If the undesired mutation appears in a region outside the one you are mutating, simple check some more colonies. As the mutagenesis is based on a linear amplificaation undesired mutations should not be propagated and therefore not present in most of the colonies. However if the mutation lies in the region of your primers, go and check their sequence once again (on the tube). During mutagenesis your primers are incorporated into the new plasmid, so if these are corrupted you will never get a good result. You could as well go for HPLC purified primers, which diminishes the risk of having a mixture of primers. Hope this helps you.
Enjoy,
Mark

Posted by: MarkAugust 12, 2011, 8:24 AM

Thanks dear for your kind reply,
i have ensured the mutations were not present prior amplification. Mutations were not in the primer as it is FPLC- HPLC purified. I get many deletion and insertion kind of muations. i even changed the Polymerase, from Pfu polymerse to Ex taq polymerase, still didnt work out.. Please help me out with a nice solution to this problem.. always thanks..

11.1

Posted by: shadSeptember 6, 2011, 10:20 PM

Ok, so the mutations seem to appear during mutagenesis and they are additional to the desired ones which you introduce with your primers, right? I'm not sure where the mutations lie relative to the primer but you must be aware that in sanger sequencing the read quality towards the end gets quite poor and might seem like a mutation. To ensure that what you are seeing is really an additional mutation, you could check the chromatogramm and also perform a second sequencing reaction from the other side to ensure you have high quality coverage off the putative mutation. But this only if the chromatogramm quality is poor. Otherwise, I would say, try a diffrent polymerase such as phusion hotstart. Maybe you could also go for a fresh aliquot of dNTPs. Sorry Shad for the delayed answer, but keep the comments coming if you've got problems. Hope this will help.

11.1.1

Posted by: MarkSeptember 18, 2011, 8:43 AM

Hey Thanks Dear Mark for responding to my queries.!
Yea you r right, i get final additional mutations in the gene sequencing result[Macrogen]. The undesirable mutations found through out the gene not at any specific position relative to primers, when i checked by aligning the wild & mutant gene using BiEdit program. I change the polymerase to Ex taq polymerase, i get the desired band of expected size, however confirming its sequence results in failure due to same additional undesirable mutations.
I dont have much idea about Chromatogram and about sequencing from other side? As we sent our sequencing to Macrogen Gene sequencing Comp. Could you please tell me little more about it.
Always Thanks. Your suggestions surely helps me. Hope to keep getting your valuable guidance.

11.1.1.1

Posted by: shadSeptember 18, 2011, 11:10 PM

Hi Shad, what I mean with sequencing from the other side is simply that you should make sure the sequencing reaction gives reliable results. So what we do when we check a plasmid is sequencing into the orf from both sides, 3 prime and 5 prime ends. You could as well use a primer which lies further into the gene but sequencing in the same direction. When you get your sequecing results there should always be file containing the unprocessed chromatogram for example .abi file. You can check by opening the file with finch.tv program. Once you have the correct files, use these as input for the alignement and compare to the reads you get before mutagenesis. Extaq I don't know but generraly you should only use enzymes with proofreading activity (pfu based enzymes or kod should work). Ok and as well there is no expected band size because the reaction amplifies the whole plasmid. Maybe you can get some help from your labmates or the sequencing company regarding the quality of reads. Good luck and keep me posted. We will get it solved :-)

11.1.1.1.1

Posted by: MarkSeptember 20, 2011, 3:55 PM

I did this protocol for getting point mutants and i have been successful a couple of times. But recently i am noticing the sequence has multiple copies of mutated oligos. The primer sequence is concatenated and repeated several times in the mutated plasmid. The primers i used had a tm of 65 C and are 28 bp long. What could be the problem ?

Posted by: sankarOctober 7, 2011, 10:18 AM

Hi Sankar, I have not yet encountered the problem you describe. However I could imagine it is caused by pairing of the primers at their ends. You could check if the sequences could allow such a pairing and the maybe add some more bases to dimish dimerisation. You could also try raising the annealing temperature. Keep me posted. Mark

12.1

Posted by: MarkOctober 7, 2011, 11:55 AM

12.2

Posted by: MarkOctober 7, 2011, 11:55 AM

The problem I believe is, while the polymerase is amplifying, the primer spontaneously separates allowing the polymerase to copy the primer region on to a daughter strand. Since the DNA is circular two primer regions are close by in the daughter strand. The reverse primer could anneal in this region and the polymerase could amplify the daughter strand instead, creating multiple primer regions on subsequent PCR cycles. In a normal point mutation reaction, the amplified daughter strands should not act as a template.

To solve this, i ran the cycle separately for the two primers in two different tubes and mixed the samples before dpnI digestion. I had several colonies and one in 10 were positive for the mutation. And sequencing gave no concatenated primer region in any of the positive clones.

12.2.1

Posted by: sankarNovember 4, 2011, 5:33 AM

Hey mutagenesis fans, if you have problems mutating large plasmids you can give this modified protocol a try. In a nutshell, the protocol works for well for large plasmids, makes use of KOD polymerase and only 6 amplification cycles are needed: http://www.zju.edu.cn/jzus/openiptxt.php?doi=10.1631/jzus.B1100180 (download quite slow but eventually works). Good luck and happy pipetting

Posted by: MarkNovember 2, 2011, 2:17 PM

I have amplified ss DNA library of 60 mer size by assymetric PCR method using gradient primer(F.Primer 100uM R.prmer-10uM). i could able to amplify ss DNA libray ,however fail to isolate amplified DNA band from the Gel slab by Crush & Soak protocol.
Thanks.

Posted by: AnonymousJuly 16, 2012, 9:44 PM

Hi all,
I could't figure out how to us NEB tool to design primer bearing a new restriction site, which can be used for clones screening. could anyone share any tips on how to conveniently do so?
Many thanks!

Posted by: Oleksiy K.March 20, 2013, 1:38 AM

Dear Oleksiy K.

My name is Ana Egana and I am the Technical Support Manager at New England Biolabs. I would like to invite you to contact us directly at info@neb.com with your questions. We will be happy to review the tool with you and provide you guidelines on how to use it for your intended purpose. We look forward to hearing from you.

Sincerely,

Ana

Posted by: Ana E.March 26, 2013, 10:10 AM

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Date Published	5/11/2009
JoVE Section	General
JoVE Issue	27
Comments	16 Comments
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DOI	doi:10.3791/1135

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