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 JoVE Biology

Une technique non invasive cheveux d'échantillonnage pour obtenir l'ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

1, 1, 1

1Department of Biology and Centre for Species at Risk and Habitat Studies,, University of British Columbia, Okanagan Campus

Article
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    Summary

    Nous présentons une approche d'échantillonnage non invasive pour collecter efficacement les échantillons de cheveux de insaisissables petits mammifères, comme indiqué pour le pika américain. Nous démontrons l'utilité de cette méthode par extraction d'ADN à partir de cheveux prélevés et amplifiant plusieurs types de marqueurs moléculaires couramment utilisées dans les études sur l'écologie de la faune et la conservation.

    Date Published: 3/13/2011, Issue 49; doi: 10.3791/2791

    Cite this Article

    Henry, P., Henry, A., Russello, M. A. A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals. J. Vis. Exp. (49), e2791, doi:10.3791/2791 (2011).

    Abstract

    Méthodes d'échantillonnage non invasif génétiques sont de plus en plus important d'étudier les populations fauniques. Un certain nombre d'études ont déclaré utiliser des techniques d'échantillonnage non invasif pour étudier la génétique des populations et la démographie des populations sauvages 1. Cette approche s'est avérée être particulièrement utile lorsqu'il s'agit d'espèces rares ou insaisissables 2. Bien qu'un certain nombre de ces méthodes ont été développées pour les cheveux de l'échantillon, les matières fécales et autres matières biologiques à partir des carnivores et mammifères de taille moyenne, elles sont largement restées non testée dans insaisissables les petits mammifères. Dans cette vidéo, nous vous présentons un roman, une caisse claire de cheveux peu coûteux et non invasif destiné aux petites insaisissable un mammifère, le pika américain (Ochotona princeps). Nous décrivons les réglages généraux de la caisse claire de cheveux, qui se compose de bandes de ruban d'emballage, organisé de façon toile d'araignée et placés le long voyage itinéraires dans l'habitat du pika ". Nous illustrons l'efficacité du piège à collecter une grande quantité de cheveux qui peuvent ensuite être collectés et ramenés au laboratoire. Nous avons ensuite démontrer l'utilisation du système de l'ADN QI (Promega) pour isoler l'ADN et de montrer l'utilité de cette méthode pour amplifier couramment utilisé des marqueurs moléculaires microsatellites nucléaires, y compris, amplifié polymorphismes de longueur des fragments (AFLP), des séquences mitochondriales (800bp) ainsi que d'un marqueur de sexage moléculaire. Globalement, nous démontrons l'utilité de ce piège de cheveux non invasive roman comme une technique d'échantillonnage pour les biologistes de la population faunique. Nous prévoyons que cette approche sera applicable à une variété de petits mammifères, le désenclavement des zones d'investigation au sein des populations naturelles, tout en minimisant l'impact pour les organismes d'étude.

    Protocol

    1. Snare cheveux

    Avant de mettre en place un piège, un emplacement idéal doit être déterminée dans l'habitat ou des talus d'éboulis pika. Cela inclut des tas de foin, qui sont des caches végétation qui recueillent les animaux en fin d'été ainsi que des excréments frais trouvés sur les sites des latrines. Des bandes de ruban adhésif d'emballage (10-50cm de longueur) sont enroulées pour fournir une surface de 360 ​​° collants et sont disposées de façon toile d'araignée à l'enveloppe de l'entrée de tas de foin le pika (fig. 1) ou le site des latrines. Selon la configuration de la roche, un morceau de fil de pêche peuvent être utilisés pour soutenir la structure de la caisse claire de cheveux, mais ce n'est souvent pas nécessaire lorsque les entrées sont assez petites (<30 cm de diamètre), une description complète de l'utilisation de la ligne de pêche peuvent être trouvés dans Henry et Russello (2010) 3. Cheveux pièges sont vérifiés aussi souvent que possible, et des échantillons de cheveux déposé sur la bande (Fig. 2) sont ensuite recueillies et étiquetées. Une fois transporté au laboratoire, les poils sont retirés de la bande collante en utilisant une pince stérile et transféré dans des tubes cryogéniques et conservés à -20 ° C jusqu'à ce que davantage de manipulation. Les échantillons de cheveux regroupés le long d'un filet de cheveux sont considérés comme appartenant à un seul individu, tandis que les échantillons groupés de façon indépendante sont supposés appartenir à des individus différents. Dans ce dernier cas, les cheveux sont ensuite placés dans des tubes différents. Ces hypothèses peuvent ensuite être testées au moyen d'empreintes ADN et des calculs de probabilité d'identité basée sur des microsatellites données génotypiques.

    2. Extraction de l'ADN

    Depuis les cheveux Pika est très mince et contient une ampoule minuscule racine, nous avons montré précédemment que d'un minimum de 25 poils sont nécessaires pour obtenir des quantités suffisantes d'ADN pour l'amplification par PCR de bonne qualité aval 3. Nous avons utilisé l'ADN du système IQ (Promega, Madison, WI, USA) et une version légèrement modifiée des instructions du fabricant pour l'isolement de l'ADN provenant d'échantillons de cheveux. Premièrement, l'échantillon de cheveux est centrifugé dans une centrifugeuse micro-afin d'éviter la perte des cheveux, tout en ouvrant le tube. Puis la solution d'incubation est préparé en mélangeant 80 pi de solution d'incubation avec 10 ul de la TNT (1M) et 10 pi de la protéinase K (18ng/ml) pour aboutir à une concentration finale de 0,1 M TNT et 1.8ng/ml de protéinase K. incubation solution (100 pi) est ajouté à l'échantillon et incubés à 56 ° C pendant 1 heure. En attendant, la solution de lyse est préparée en ajoutant 1 pl de la TNT (1M) pour chaque 100 ul de tampon de lyse, résultant en une concentration finale de 0,01 M de DTT. Préparé solution de lyse (200 pi) est ensuite ajouté à l'échantillon, avec 7 pl d'ADN QI de résine, vortexés pendant 3 secondes à grande vitesse et incubée à température ambiante pendant 5 minutes. L'échantillon est ensuite vortexé pendant 2 secondes et insérées dans le support magnétique, où la séparation des billes magnétiques de la solution de produit. La solution restante est ensuite aspiré et mis au rebut, en faisant attention à ne pas perturber le culot de résine magnétique. L'échantillon est ensuite traitée avec 100 pi de la solution de lyse préparé, vortex et remis sur le stand magnétique où la séparation se produit à nouveau. Le tampon de lyse est aspirée et mis au rebut, et cette étape est répétée trois fois en utilisant un tampon de lavage (100 pi). L'échantillon est ensuite mis à sécher dans le support magnétique pendant 15 minutes. Une fois sec, 100 pi de tampon d'élution est ajouté à l'échantillon et incubés à 65 ° C pendant 5 minutes. L'échantillon est vortexé et inséré dans le support magnétique. La solution contenant maintenant l'ADN élue est alors transféré dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et stockés à -20 ° C jusqu'à ce que de nouvelles manipulations. L'ADN d'échantillons de foie a également été extraites en utilisant le système IQ ADN et utilisé comme contrôle positif pour des amplifications PCR.

    3. L'amplification par PCR

    L'ADN obtenu à partir de notre filet de cheveux non invasive et des échantillons de foie ont ensuite été utilisées pour amplifier un ensemble de communément utilisé des marqueurs moléculaires (microsatellites, AFLP, mitochondrial du cytochrome b et le marqueur de sexage ZFX / ZFY). PCR ont été effectuées en utilisant une Veriti thermocycleur (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dans un volume de 25 ul contenant: 10 - 20 ng d'ADN, 0,5 uM de chaque amorce, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTP, 10 μ de sérum albumine bovine (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) et 0,5 U AmpliTaq ADN polymérase Gold (Applied Biosystems). Paramètres de cyclisme pour les loci microsatellites ont été optimisés en utilisant un programme de cyclisme touchdown (10 min à 95 ° C, 35 cycles à 95 ° C pendant 30 s, 30 s recuit, et 45 s à 72 ° C, suivie d'une étape finale à 72 ° C pendant 10 min.) La température de recuit a diminué de 1 ° C par cycle de 60 à 55 ° C jusqu'à atteindre le sixième cycle, à quel point les 29 cycles restants ont continué à 55 ° C. Cyclisme paramètres pour les fragments mitochondrial ont été décrits ci-dessus, mais se composait de 35 cycles, avec un recuittempérature de 50 ° C. Amplified fragment length polymorphism a été entrepris suivant le protocole pour les génomes de vertébrés décrites par Bonin 4. Enfin, le sexage moléculaire a été entreprise en utilisant la PCR-RFLP du ZFX / ZFY loci à la digestion des enzymes de restriction Hinfl 5. Les produits de PCR de la microsatellites, AFLP et le cytochrome séquences B ont été effectuées sur un analyseur ABI 3130XL génétique (Applied Biosystems), tandis que digérée ZFX / ZFX fragments ont été longent une échelle de 100 pb (New England Biolabs) sur un gel d'agarose 3% contenant 2,5% de gel de l'ADN SYBR Safe. tache (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et visualisés en utilisant un système Red personnels imagerie gel (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) Microsatellites et AFLP ont été visualisées en utilisant GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) et le chromatogramme ADN mitochondrial a été visualisée en utilisant Sequencher v4.7 (Gene Code des sociétés, Ann Harbour, MI, USA).

    4. Les résultats représentatifs

    L'ADN extrait d'échantillons de poils obtenus en utilisant notre piège non invasif ont été utilisés pour amplifier par PCR différents types de marqueurs moléculaires. Comme base de comparaison, en utilisant l'ADN extrait des échantillons de foie a été amplifié aux côtés de nos échantillons de cheveux. Nucléaire loci microsatellites ont été amplifié avec succès à la fois pour les cheveux et échantillons de foie (Fig. 3). Bien que l'intensité du signal était plus grande lors de l'utilisation des échantillons de foie, cela n'a pas eu un effet négatif sur la notation génotype (Fig. 3). Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant les AFLP (fig. 4), les séquences d'ADN mitochondrial (fig. 5), et le marqueur ZFX / ZFY sexage moléculaire (Fig. 6).

    Figure 1
    Figure 1. Un exemple d'un piège de cheveux non invasif mis en place à un tas de foin. Des bandes de ruban adhésif d'emballage enroulé claires sont disposées d'une façon toile d'araignée pour enfermer l'entrée de la pile de foin. Un morceau de fil de pêche est utilisé ici pour offrir un soutien supplémentaire pour la caisse claire cheveux.

    Figure 2
    Figure 2. Un piège cheveux réussie contenant un grand nombre de cheveux collée au ruban d'emballage.

    Figure 3
    Figure 3. Un chromatogramme représentant microsatellites nucléaires (Ocp6) 8 tel qu'il apparaît dans GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). Le chromatogramme dessus a été obtenue par amplifier l'ADN des tissus du foie, et il est hétérozygote (354/358) à ce locus. Le chromatogramme du bas représente un autre individu présentant un génotype hétérozygote (358/362) basées sur l'ADN extrait de poils. Alors que le signal du chromatogramme de l'échantillon de cheveux a une intensité plus faible que l'échantillon du foie, marquant le génotype n'est pas affectée par cette différence de signal.

    Figure 4
    Figure 4. Un chromatogramme AFLP représentant (E31T32) tel qu'il apparaît dans GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). Le chromatogramme dessus a été obtenue par amplifier l'ADN des tissus du foie, le chromatogramme du bas représente l'ADN extrait de poils.

    Figure 5
    Figure 5. Un représentant chromatogramme séquence d'ADN mitochondrial (cytochrome b) tel qu'il apparaît dans Sequencher v4.7 (Gene Code des sociétés). Le chromatogramme dessus a été obtenue par amplifier l'ADN des tissus du foie, le chromatogramme du bas représente l'ADN extrait de poils.

    Figure 6
    Figure 6. Un marqueur sexage représentant moléculaire (ZFX / ZFY) amplifié à la fois pour le foie et les échantillons de cheveux. Cette approche repose sur l'observation que le chromosome Y possède un site de restriction Hinfl dans cette région que le chromosome X manque. Ainsi, les femelles produisent deux co-migration des fragments de 432 pb alors que les mâles produisent des fragments de 432 pb, 261 pb et 171 pb.

    Discussion

    Non invasive l'échantillonnage génétique est devenu une alternative intéressante aux méthodes traditionnelles de piégeage pour plusieurs raisons. D'abord, en discrètement collecter du matériel biologique (par exemple, des excréments, poils, plumes, de salive et de mucus) à partir de populations sauvages, les chercheurs peuvent étudier ces espèces sans déranger, la manutention, ou même en les observant, réduisant ainsi les risques pour les animaux et les chercheurs. Deuxièmement, l'échantillonnage génétique non invasif permet aux biologistes pour étudier les populations d'espèces insaisissables et rares, une tâche qui peut s'avérer difficile avec les plus traditionnelles approches de capture d'animaux vivants 6. Et troisièmement, NGS peut potentiellement augmenter la taille des échantillons, en réduisant les perturbations pour les animaux, les efforts d'échantillonnage, et les coûts, contribuant ainsi à minimiser les biais dans les estimations des paramètres de la population 7. Ce dernier point peut s'avérer cruciale lorsqu'il s'agit d'espèces menacées, puisque des estimations biaisées des paramètres de population peut aboutir à une gestion inappropriée.

    Dans l'article, nous décrivons vidéo présente une méthode simple, un roman, peu coûteuse et non invasive pour l'échantillon insaisissables petits mammifères, en utilisant le pica d'Amérique comme un exemple. Nous démontrons que l'ADN extrait de poils effectue la même façon que l'ADN extrait d'échantillons de foie à l'égard de microsatellites, AFLP, marqueurs mitochondriaux et le sexage, ce qui rend cette méthode d'échantillonnage non invasif une alternative intéressante à vivre d'échantillonnage de piégeage ou mortelles. Globalement, nous prévoyons que cette méthode sera utile dans la phase de collecte des données des études de génétique des populations et de comportement des rares ou insaisissables espèces de petits mammifères, tout en minimisant l'impact sur les organismes à l'étude.

    Disclosures

    Aucun conflit d'intérêt déclaré.

    Acknowledgements

    Nous tenons à remercier L. Evans, B. Granger, D. Rissling, Z. Sim, A. Goodwin, K. et D. Hayhurst Kuch d'assistance dans le domaine. K. Galbreath aimablement fourni des échantillons de foie pika de la vallée de Bella Coola. Merci à A. Gonçalves da Silva et K. Larsen pour des discussions intéressantes qui ont contribué à la conception de cette méthode d'échantillonnage génétique non invasif. Ce travail a été financé par les sciences naturelles et en génie du Canada, Discovery, et UBC Okanagan subventions de recherche individuelles sur MAR. Un Fonds national suisse de bourses de doctorat soutenue PBSKP3_128523 PH. Cette étude a été réalisée suivant le protocole de soins aux animaux de l'Université de la Colombie-Britannique (Numéro de certificat: A07-0126).

    Materials

    Hair snare:

    • Rolls of clear packing tape (3M, St. Paul, MN, USA)
    • Fishing line (10lb)
    • Cryogenic tube (2ml)
    • Sterile forceps
    • Liquid Nitrogen Dewar (optional)

    DNA extraction:

    • DNA IQ System (Cat. # DC6701; Promega) with the tissue and hair extraction Kit (Cat. # DC6740; Promega).
    • MagneSphere Technology Magnetic Separation Stand (Cat. # Z5342; Promega)
    • Micro centrifuge
    • Hybridization oven or water bath
    • 1.5 ml Eppendorf Tubes

    References

    1. Kendall, K. C. Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population. J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).
    2. Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia. Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).
    3. Henry, P. In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger. Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).
    4. Henry, P., Russello, M. A. Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares. Eur J Wildlife Res. (2010).
    5. Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395. 145-145 (2005).
    6. Fontanesi, L. Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci. Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).
    7. Piggott, M. P., Taylor, A. C. Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species. Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).
    8. Banks, S. C. Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material. Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).
    9. Litvaitis, J. A. A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails. Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).
    10. Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps. Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).

    Comments

    5 Comments

    Well-done Philippe et al! Good to see the pikas in their native environments!
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 7, 2011, 1:38 PM

    For a weather-proof alternative, check this link please:
    http://www.flickr.com/photos/philgimp/6²68408998/in/photostream
    Thanks.

    Philippe et al.,
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 22, 2011, 12:54 AM

    Great work you guys! Very fascinating research!
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 22, 2011, 4:08 PM

    very good work philipe. can you suggest me to how to sample form large mammals and birds
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 1, 2011, 12:29 AM

    Dear Tribhuwan,

    this will likely depend on your species of interest. I am unsure how good sticky traps would be helpful for large mammals and you may have to resort to more drastic measures such as barbed wire corals. As for birds, there are many options in the literature including egg shells, shed feathers etc. Please email me if you would like to continue this conversation!

    Best,

    Philippe
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 7, 2011, 12:35 PM

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