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 JoVE Neuroscience

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

1, 1, 2, 1

1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg, 2Centre of Chronic Immunodeficiency (CCI), University Medical Centre Freiburg, University of Freiburg

Article
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    Summary

    Los astrocitos se han reconocido para ser versátiles células que participan en los procesos biológicos fundamentales que son esenciales para el desarrollo normal del cerebro y la función, y la reparación del sistema nervioso central. Aquí presentamos un procedimiento rápido para obtener cultivos puros de astrocitos de ratón para estudiar la biología de esta clase importante de centrales células del sistema nervioso.

    Date Published: 1/19/2013, Issue 71; doi: 10.3791/50079

    Cite this Article

    Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079, doi:10.3791/50079 (2013).

    Abstract

    Los astrocitos son un tipo de células abundante en el cerebro de los mamíferos, pero aún queda mucho por aprender acerca de sus características moleculares y funcionales. Astrocitos in vitro de sistemas de cultivo celular se puede utilizar para estudiar las funciones biológicas de estas células gliales en detalle. Este protocolo video muestra cómo obtener los astrocitos puras mediante el aislamiento y la cultura de una mezcla de células corticales de crías de ratón. El método se basa en la ausencia de neuronas viables y la separación de los astrocitos, los oligodendrocitos y microglia, las tres poblaciones principales de células gliales del sistema nervioso central, en cultivo. Imágenes representativas durante los primeros días de cultivo demostrar la presencia de una población de células mixtas e indicar el punto de tiempo, cuando los astrocitos se hacen confluentes y debe ser separado de microglia y oligodendrocitos. Por otra parte, se demuestra la pureza y la morfología astrocytic de astrocitos en cultivo utilizando tinciones inmunocitoquímicas para bien establecidos yrecién descrito marcadores de astrocitos. Este sistema de cultivo puede ser fácilmente utilizado para obtener los astrocitos puros ratón y el medio acondicionado de astrocitos para el estudio de diversos aspectos de la biología de astrocitos.

    Introduction

    Los astrocitos son un tipo de célula muy abundantes en el sistema nervioso central (SNC). La relación de los astrocitos de las neuronas es de 1:3 en la corteza de ratones y ratas, mientras que hay 1,4 astrocitos por neurona en la corteza humana 1. El interés en función de los astrocitos se ha incrementado dramáticamente en los últimos años. Una función clave de los astrocitos es su papel en la prestación de apoyo estructural y metabólico de las neuronas 2,3. Papeles recién descubiertas de astrocitos cubren un amplio espectro de funciones. Estos incluyen guiar la migración de los axones en desarrollo y los neuroblastos determinadas durante el desarrollo de 4-6, funciones en la transmisión sináptica, la fuerza de sinapsis y procesamiento de la información por los circuitos neuronales 7-9, roles en la barrera hematoencefálica (BBB) ​​formación 10 y la integridad 11-13 y la regulación del tono vascular cerebral 14. Otra característica importante de los astrocitos es su respuesta a la lesión. Bajo condiciones patológicas astrocytES vuelven reactivos y más regular al alza la expresión de la proteína de filamentos intermedios ácida fibrilar glial (GFAP) y proteínas inhibidoras de la matriz extracelular (ECM) 15,16. Astrocitos reactivos demarcar el sitio de la lesión del tejido sano mediante la formación de una cicatriz glial, que consiste principalmente en astrocitos proteínas secretadas de ECM de la proteoglicano sulfato de condroitina (CSPG) de la familia, los principales factores que inhiben la regeneración axonal después de una lesión del SNC 15-17.

    Los astrocitos se originan en gliales radiales (RG) de las células durante la embriogénesis tardía y la vida postnatal temprana. Después de especificación de astrocitos se ha producido, precursores de astrocitos migran a sus posiciones finales, en el que comienzan el proceso de diferenciación terminal. In vivo, los astrocitos parecen ser maduro tres a cuatro semanas después del nacimiento, como se indica por su morfología típica de 18,19. Una subpoblación de células RG convertir en astrocitos de la zona subventricular (tipo de células B). Both, RG y células de tipo B funcionar como astrocitos como células madre neurales (NSC) durante el desarrollo y en el adulto, respectivamente. Al igual que los astrocitos, RG y células de tipo B también expresan el transportador de glutamato específico de astrocitos (GLAST), cerebro lípido-proteína de unión (BLBP), y GFAP, lo que indica que estos marcadores no pueden ser exclusivamente utilizado para etiquetar específicamente astrocitos adultos. En contraste con los astrocitos adultos parenquimatosas, que no se dividen en el cerebro sano RG, y el tipo B muestra células tallo potencial de la célula tales como la capacidad de auto-renovación. La desregulación de los astrocitos se ha implicado en numerosas patologías, incluyendo la enfermedad de Alzheimer 20,21, enfermedad de Huntington 22, 23 enfermedad de Parkinson, síndrome de Rett 24 y enfermedad de Alexander 25. Por otra parte, los astrocitos reaccionar a todos los insultos del SNC, que conduce a la activación de astrocitos y la formación de cicatriz glial astrocytic 16,26. La cicatriz glial astrocytic que forma tr cerebro siguienteauma lesión o la médula espinal se piensa que es la barrera primer impedir la regeneración neuronal 15.

    El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones purificadas de células ha sido esencial para nuestra comprensión del sistema nervioso. Los trabajos pioneros de McCarthy y de Vellis permite a los investigadores hasta la fecha para preparar cultivos casi puros de astrocitos de rata neonatal tejido 27. Se ha aprendido mucho sobre la biología de los astrocitos utilizando este método, que se presenta aquí en una forma ligeramente modificada para aislar los astrocitos corticales de ratón. Como complemento de los estudios in vivo, los astrocitos, así como el medio condicionado obtenido utilizando el descrito en el cultivo in vitro, son herramientas valiosas para obtener más ideas sobre las funciones de los astrocitos.

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    Protocol

    1. El aislamiento y forro de una mezcla de células corticales

    Aislamiento de células mixtas para cultivos de astrocitos corticales se puede realizar utilizando P1 a P4 crías de ratón. Con el fin de conseguir una densidad de astrocito adecuado, es necesario el uso de 4 capas corticales de ratón pup por T75 matraz de cultivo de tejido. Por lo tanto, los volúmenes en el protocolo siguiente se calculan para una preparación de células usando 4 crías de ratón.

    1. Antes de iniciar el procedimiento de disección, precalentamiento 30 ml de medios de cultivo de astrocitos (DMEM, alta glucosa + 10% inactivado por calor suero fetal bovino + 1% de penicilina / estreptomicina; véase la tabla) a 37 ° C. Cubra un matraz T75 con 20 ml de poli-D-lisina (PDL) a una concentración de 50 mg / ml en agua de grado de cultivo de células durante 1 hora a 37 ° C en la incubadora de CO 2.
    2. Para el procedimiento de disección, preparar todos los reactivos y materiales necesarios. Usted necesitará: tijeras quirúrgicas, pinzas finas lisas, pinzas de punta plana, toallas de papel, bolsas de residuos, un 70% de etanold 2 platos de disección (3,5 cm de diámetro) en el hielo llena con 2 ml de HBSS cada uno.
    3. Aplique suavemente y rociar la cabeza y el cuello del ratón cachorro con 70% de etanol. El animal es sacrificado por decapitación con las tijeras.
    4. Realizar una incisión en línea media, de posterior a anterior, a lo largo del cuero cabelludo para revelar el cráneo.
    5. Cortar cuidadosamente el cráneo desde el cuello hasta la nariz. Dos cortes adicionales se realizan para permitir el acceso adicional al cerebro: El primer corte se hace anterior de los bulbos olfatorios, la otra inferior del cerebelo para desconectar el cráneo de la base del cráneo.
    6. Uso de las pinzas de punta plana, las aletas craneales se volcó suavemente a un lado y el cerebro se extrae y se coloca en el plato primero disección llena con HBSS. Coloque el plato de nuevo en hielo y seguir cosechando los 4 cerebros.
    7. El resto del procedimiento de disección se realiza bajo un estereomicroscopio. En primer lugar, los bulbos olfatorios y el cerebelo se eliminan mediante la multafórceps de disección (Figura 1B).
    8. Con el fin de recuperar las cortezas, agarra el extremo posterior del cerebro con las pinzas finas, realizar una incisión en línea media entre los hemisferios, insertar un segundo conjunto de pinzas de la arboleda creado y se desprenden de la estructura en forma de placa de la corteza de la cerebro.
    9. Diseccionar cuidadosamente las meninges de la corteza de los hemisferios tirando con las pinzas finas (Figura 1 D '). Este paso evita la contaminación del cultivo de astrocitos final por células de las meninges y los fibroblastos. Transfiera los hemisferios corticales preparados en el segundo plato lleno de HBSS y devolverlo en hielo. Continuar en consecuencia con todas las 4 capas corticales.
    10. Por último, cortar cada hemisferio corteza en trozos pequeños con cuchillas afiladas (aproximadamente 4 a 8 veces).
    11. En condiciones estériles, piezas de transferencia de corteza en un tubo Falcon de 50 ml y añadir HBSS hasta un volumen total de 22,5 ml.
    12. Añadir 2,5 ml de tripsina al 2,5%, mezclar e incubarel tejido en el baño de agua a 37 ° C durante 30 min. Mezclar por agitación ocasional cada 10 min.
    13. Centrifugar durante 5 min a 300 xg para piezas de pellets tejido de la corteza.
    14. Retire con cuidado el sobrenadante por decantación. Con el fin de evitar la pérdida del sedimento de tejido que puede retener mecánicamente usando una pipeta. Disociar el tejido en una suspensión de células individuales mediante la adición de 10 ml de medio de recubrimiento de astrocitos y pipeteado vigoroso usando una pipeta de plástico de 10 ml hasta trozos de tejido se disocia en células individuales (20 a 30 veces). Ajuste el volumen a 20 ml con medio chapado astrocitos. Puede prueba de la disociación del tejido de la corteza en células individuales mediante recuento usando un hematocitómetro. Una preparación de 4 cortezas de ratón cachorro debe ceder 10-15 x 10 6 células individuales disociados.
    15. Aspirar PDL del matraz de cultivo T75, placa de la suspensión disociado sola célula y se incuba a 37 ° C en la incubadora de CO 2.

    2. Obtención de una EnrCultura Astrocyte iched

    1. Cambiar el medio 2 días después de la siembra de las células mixtas corticales y los 3 días posteriormente.
    2. Después de 7 a 8 días, cuando los astrocitos son confluentes microglia y superposición sentarse expuestos en la capa de astrocitos o que ya están separados de la capa de astrocitos (Figura 2), agitar el matraz T75 a 180 rpm durante 30 min en un agitador orbital para eliminar la microglía. Desechar el sobrenadante que contiene microglia o si desea examinar la cultura y la microglia, lo hace girar hacia abajo y la placa de la cultura 28,29.
    3. Añadir 20 ml de medio fresco cultivo de astrocitos y continuar agitando el matraz a 240 rpm durante 6 horas para eliminar las células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Dado que algunos OPC no se desprenderá completamente de la capa de astrocitos, siguen agitar fuertemente durante 1 min con el fin de evitar la contaminación OPC. Desechar el sobrenadante o girar hacia abajo y la placa, si lo desea con la cultura OPC 29.
    4. Enjuague el conflue restantent capa de astrocitos dos veces con PBS, aspirar el PBS, añadir 5 ml de tripsina-EDTA y se incuban en la incubadora de CO 2 a 37 ° C. Compruebe la separación de los astrocitos cada 5 minutos y hacer cumplir la separación de los astrocitos golpeando el frasco en la palma de tu mano (2-3 veces).
    5. Después de astrocitos se desprenden del matraz de cultivo, añadir 5 ml de medio de cultivo de astrocitos, células giran a 180 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante y añadir 40 ml de medio fresco chapado de astrocitos. Uno T75 frasco de cultivo de tejidos deben producir alrededor de 1x10 6 células después de la división celular en primer lugar. Células de la placa en dos matraces T75 de cultivo y se incuba a 37 ° C en la incubadora de CO 2. Cambiar el medio cada 2 a 3 días.
    6. 12-14 días después de la primera división de los astrocitos se sembraron en la concentración apropiada de células 24-48 horas antes de realizar el experimento. Uno T75 frasco de cultivo de tejidos deben producir alrededor de 1.5-2 x 10 6 células después de la división celular segundo.

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    Representative Results

    Tras el aislamiento del cerebro de ratón completo (Figura 1A), el cerebelo y el bulbo olfativo tiene que ser eliminado (Figura 1B). Las cortezas se pelan del vástago de cerebro de ratón (Figura 1C) y de las meninges de la corteza individual (Figura 1D ') se retiran cuidadosamente (Figura 1E). Meninges son evidentes por el sistema de la arteria meníngea y resultados incompletos de eliminación de contaminación en el cultivo de astrocitos final por células de las meninges y los fibroblastos.

    Después de la siembra de la suspensión celular cortical mixto, algunos astrocitos ya adjuntar al matraz de cultivo dentro de 24 hr (Figura 2A). Sin embargo, el sobrenadante de cultivo celular contendrá restos de células y las neuronas que mueren durante los primeros 3 a 5 días (Figura 2A-C), como el medio de cultivo favorece la supervivencia y el crecimiento de las células gliales. Una vez que los astrocitos y microglia son confluentes siéntese expuesto en la astrocytcapa de e, por lo general en el día 7 después del aislamiento de una mezcla de células corticales, astrocitos debe ser separado de la microglía y los OPC mediante agitación (Figura 2D). 2 días después de las celdas divididas primera muestra morfología astrocitos. A esta densidad de astrocitos punto es baja y los astrocitos son voluminosos (2E figura, las flechas negras marcan una célula). El rendimiento esperado en este punto es baja con alrededor de 4-6 x 10 5 células por matraz de cultivo de tejidos T75. Sin embargo, las células todavía proliferar y madurar en cultivo en este punto de tiempo. Los astrocitos se utilizan generalmente para experimentos en el día 21 a 28 (Figura 2F) para asegurar un fenotipo maduro de astrocitos aislados. En este punto el rendimiento esperado es aproximadamente 1.5-2 x10 6 células por matraz de cultivo de tejidos T75.

    La pureza del cultivo de astrocitos se ha caracterizado por estudios de microscopía electrónica morfológicas, expresión de marcador de las células y la respuesta farmacológica 27. La contaminación de la unacultura strocyte puede ser examinada mediante el uso de marcador de microglia (IBA-1) y OPC (O4). La pureza obtenida cultivo de astrocitos y la madurez debe ser examinado por examen inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo contra la proteína GFAP. Se espera que la mayoría de las células muestran una señal intensa, filamentosa (Figura 3). Nuestro método de aislamiento y cultivo de astrocitos corticales como resultado una pureza de astrocitos de mayor que 98%, reveló mediante el uso de un anticuerpo contra la proteína GFAP (Figura 3). Si el procedimiento se ha realizado correctamente, células contaminantes son raros (<2%) y contienen microglia y los OPC, que se pueden teñir utilizando IBA-1 y O4, respectivamente. Si se desea, el análisis adicional de otros marcadores de astrocitos, como acuaporina-4, BLBP, S100B y GLAST puede ser utilizado. Además de GFAP, estos marcadores se expresan todos en los 28 días astrocito culturas antiguas. Recientes perfiles de expresión génica de las poblaciones purificadas de astrocitos reveló ast nuevo potencialrocyte marcadores, tales como la enzima metabólica folato ALDH1L1 30,31, que también se expresa por la mayoría de los astrocitos corticales aisladas (Figura 3).

    Figura 1
    Figura 1. La disección de la corteza postnatal ratón (P3). Un cerebro) Entero. B) Brain después de la eliminación de los bulbos olfativos y el cerebelo. C) Aislamiento de cortezas despegando la estructura en forma de placa de la corteza del cerebro. D) D 'Corteza del sitio ventral y dorsal con meninges (flechas negras indican las arterias meníngeas). E) Corteza sin meninges. Barra de escala de 1,5 mm.

    Figura 2
    Figura 2. Descripción morfológica de las células aisladas mixtas corticales y la cultura astrocito puro en momentos diferentes después del aislamiento.A) 1 día después de la siembra de una mezcla de células corticales. Astrocitos primero se adjunta a la parte inferior del matraz (flechas negras) y las neuronas mueren en el sobrenadante. B) 3 días después de la siembra de una mezcla de células corticales. Capa de astrocitos se está formando (flechas negras). Las neuronas están casi ausentes. C) 5 días después de la siembra de una mezcla de células corticales. En primer lugar microglia y los OPC en la parte superior de una capa de astrocitos (flechas negras). D) 7 días después de la siembra de una mezcla de células corticales. Capa de astrocitos es completamente confluente. E) Después de eliminar la microglía y los OPC por agitación vigorosa y 2 días después de la división, las células adjuntas muestran la morfología de los astrocitos con baja densidad (flechas indican una célula). F) capa de astrocitos muestra de alta densidad 2 semanas después de la primera división. Barra de escala, a 10 m.

    Figura 3
    Figura 3. La pureza de la cultura de astrocitos primarios. Inmunomarcación de cul primario de astrocitos de ratónciones con los marcadores GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 y BLBP (todo verde) reveló pura cultura astrocitos primarios. Los núcleos se tiñen con 4 ', 6'-diamino-2-fenilindol (DAPI) (azul). Barra de escala: 10 m.

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    Discussion

    El método descrito aquí se basa en la preparación de cultivo de astrocitos a partir de cerebros de roedores neonatos, originalmente descrito por McCarthy y de Vellis en 1980 27. El método modificado del aislamiento y el cultivo de astrocitos corticales a partir de P1 a P4 postnatal cerebro de ratón se presenta aquí es rápido, los rendimientos de los astrocitos primarios puros y es altamente reproducible. Esta técnica se puede transferir fácilmente para aislar los astrocitos a partir de otras especies, tales como de rata o cerdo y de otras regiones del cerebro, tales como la médula espinal. Mientras que el aislamiento de células progenitoras a partir de astrocitos del cerebro neonatal por el método de McCarthy y DeVellis genera células altamente proliferativas, la proliferación celular y la propagación de los astrocitos aislados de postnatales P1-P4 crías de ratón es limitado. Después de astrocitos dividir una vez a los 7 días in vitro (DIV), crecerán hasta la confluencia y madura. In vivo, la proliferación de astrocitos es en gran medida más completa por P14 32. Élre, se aconseja utilizar los astrocitos para experimentos en día 21 al 28 DIV (Figura 2F) para asegurar el fenotipo maduro de los astrocitos aisladas. Debido a la limitación intrínseca de proliferar cultivos de astrocitos no debe ser dividido más de 3 veces.

    Los pasos críticos en el método de aislamiento descritas son la digestión de las cortezas y la trituración de la siguiente tejido digerido para la obtención de la suspensión de células individuales. Por lo tanto, es necesario para optimizar la concentración de tripsina y el tiempo de digestión con el fin de obtener una suspensión de células individuales después de la trituración del tejido de la corteza cerebral de 20-30 veces. Con el fin de minimizar la variación de la tripsina se debe alícuotas y congelación y descongelación se debe evitar. El procedimiento descrito se basa en placas las células corticales mixtos en matraces de cultivo de PDL recubiertos, lo que asegura la unión de los astrocitos y promueve una capa confluente de astrocitos varios días después de la siembra. Mientras PDL-recubrimiento no es necesario que los astrocitos mantenimiento después de su separación de la microglia y oligodendrocitos, que se puede realizar para ciertas aplicaciones posteriores tales como la tinción de inmunofluorescencia. Buena sincronización de la división celular primero es importante para la integridad celular y el rendimiento. Si astrocitos se cultivaron más allá de ellos alcanzaron la confluencia, es posible que pierda la mayor parte de las células debido a la separación insuficiente durante la división celular en primer lugar. Esto no puede ser superado por el aumento del tiempo para el desprendimiento, desde el tiempo de incubación con tripsina extensa influye negativamente en la integridad celular. En contraste, el recubrimiento de la suspensión celular cortical demasiado apenas resultará en una insuficiente formación de una capa de células confluente de astrocitos. El mejor momento para la división celular primero es de 7 a 8 días después de la siembra de una mezcla de células corticales, cuando son confluentes astrocitos y células de la microglia sentarse en la posición más alta de la capa de astrocitos.

    En el cultivo celular descrito cortical, astrocitos muestran heterogeneidad celular (<strong> Figura 3), como se ha descrito para los astrocitos in vivo 33,34. Sin embargo, la definición de diversa morfología de astrocitos y la funcionalidad se ha visto obstaculizada por el número limitado de marcadores para identificar y distinguir los subtipos de astrocitos potencialmente heterogéneos. Un marcador bien caracterizado de fibroso maduro y astrocitos reactivos es GFAP. Sin embargo, apenas se GFAP expresado por astrocitos protoplasmáticos maduros, lo que limita su uso como un marcador para todos los astrocitos y también se expresa por las células RG durante el desarrollo y por las células B en el adulto, restringiendo su uso como un marcador de la etapa específica. Otros marcadores de astrocitos, incluyendo GLAST, ALDH1L1 o BLBP, también son expresadas por astrocitos inmaduros y por lo tanto no exclusivamente marcar astrocitos maduros. Por último, los marcadores de astrocitos maduros como GFAP, Aquaporin-4, y S100B (Figura 3) son cada vez más hasta reguladas durante la maduración postnatal.

    En nuestras manos, astculturas rocyte a una edad de 4 semanas tienen características de astrocitos maduros in vivo. El uso de cultivos primarios de astrocitos que podríamos identificar el mecanismo molecular cómo la sangre nacido fibrinógeno proteína induce la activación de astrocitos 17. Nuestros estudios revelaron que el fibrinógeno es un portador de latente de TGF-β. Tratamiento de astrocitos primarios con fibrinógeno llevó a TGF-β formación y la activación de la vía de señalización TGF-β/Smad en astrocitos 17,26. Estos resultados han sido confirmados mediante inyecciones de fibrinógeno in vivo. Además, los astrocitos controlar otros tipos de células por la secreción de sustancias, que pueden ser analizados por la recolección de astrocito medio acondicionado y la aplicación de este medio condicionado a otros tipos de células. Antes utilizábamos astrocito medio condicionado a analizar en un ensayo funcional como medio condicionado de fibrinógeno tratados con astrocitos afecta crecimiento de las neuritas. Reactiva astrocitos expresan y secretanproteínas de la familia CSPG, que inhiben la extensión de neuritas 16. De hecho, el medio acondicionado de astrocitos tratados con fibrinógeno disminuyó significativamente tanto la longitud de neuritas y el porcentaje de células que muestran crecimiento de las neuritas 17.

    El aislamiento y el cultivo de astrocitos corticales descritos en este protocolo proporciona una herramienta poderosa para la investigación de la biología de astrocitos, ya que su capacidad de administración en diversas aplicaciones, en gran medida puede completar su investigación in vivo. Sin embargo, se debe tener en cuenta que los astrocitos obtenidos han sido cultivadas in vitro y antes de que se reflejan muchas características de astrocitos, que también difieren de los astrocitos en vivo. Por lo tanto, otros métodos de selección directa y el aislamiento de los astrocitos por FACS immunopanning aislamiento 35 o anticuerpo basado-36 representan nuevas vías para investigar más a fondo las propiedades fundamentales de los astrocitos.

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    Disclosures

    No hay conflictos de interés declarado.

    Acknowledgements

    Con el apoyo de la Fundación de Becas de Postgrado Fazit a SS, el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF 01 EO 0803) en KB y la Comisión Europea FP7 subvención PIRG08-GA-2010 a 276.989, Neurex, y la beca de la Fundación Alemana para la Investigación SCHA 1442 / 3-1 ante el CS Los autores no tienen intereses financieros en conflicto.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Astrocyte culture media
    DMEM, high glucose Life Technologies 31966-021
    FBS, heat-inactivated Life Technologies 10082-147 Final Concentration: 10%
    Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122 Final Concentration: 1%
    Solution for brain tissue digestion
    HBSS Life Technologies 14170-088
    2.5% Trypsin Life Technologies 15090-046 Final Concentration: 0.25%
    Other
    70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
    Poly-D-Lysine Millipore A-003-E 50 μg/ml
    Water PAA S15-012 cell culture grade
    PBS PAA H15-002 cell culture grade
    0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-062
    0.45 μm Sterile filter Sartorius 16555
    3.5 cm petri dish BD Falcon 353001
    15 ml Falcon tube BD Falcon 352096
    50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
    75 cm2 Tissue culture flask BD Falcon 353136
    Forceps, fine Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
    Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
    13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
    Stereomicroscope Leica MZ7.5
    Stereomicroscope + Camera Leica MZ16F; DFC320
    Microscope + Camera Zeiss; Canon Primo Vert; PowerShot A650 IS
    Centrifuge Eppendorf 5805000.017 Centrifuge5804R
    Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450
    Water bath Julabo SW20; 37 °C

    References

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    Comments

    6 Comments

    Hi, I'm hoping you can tell me what antibodies you used for your GFAP and Aldh1l1 immunofluorescence. Thanks very much.

    Leslie
    Reply

    Posted by: Leslie S.August 1, 2013, 3:27 PM

    Dear Leslie,

    we used the rat anti-GFAP antibody from invitrogen (#13-0300) and the rabbit anti-ALDH1L1 from abcam (#ab87117) for immunofluorescence on astrocytes.

    Best regards, Christian
    Reply

    Posted by: Christian S.August 2, 2013, 6:36 AM

    Hi, I really like to watch the video but I couldn't able to watch the video. I want to request to watch the video, so that that video could help me in my study.

    Thank you,
    Fatin
    Reply

    Posted by: fatin n.December 1, 2013, 6:31 PM

    Hi,

    Thank you for the video. I have a few questions regarding culture maintenance. Is there a particular reason you maintain your astrocyte cultures up to 2 weeks after the first split? Do you continue to passage them a few times afterwards for multiple experiments? I find that my cultures change morphology after the second split and proliferate poorly.

    Thank you

    Kind regards,

    Janitha
    Reply

    Posted by: Janitha M.March 4, 2014, 6:50 PM

    Dear Janitha,
    we isolate mixed cortical cells from P1 to P4 mouse pups. We keep the isolated cells for 3 to 4 weeks in culture to perform experiments with aged, mature astrocytes. This aged astrocytes express and secrete for example chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs) upon activation, whereas cells that are just cultured for some days express only low amounts of CSPGs.

    We mention in the protocol that the cell proliferation and propagation of isolated astrocytes of postnatal P1-P4 mouse pups is limited. We suggest to use astrocytes for experiments at day 21 to 28 DIV to ensure the mature phenotype of isolated astrocytes. Due to the intrinsic restraint to proliferate astrocyte cultures should not be splitted more than 3 times.

    Best Regards, Christian
    Reply

    Posted by: Christian S.March 5, 2014, 10:22 AM

    Dear Christian,

    Apologies for the late reply, as I just realised that my earlier response did not post here. Thank you for your reply and sharing your protocol. I have found it quite helpful in setting up my primary astrocyte cultures.

    Kind regards,

    Janitha
    Reply

    Posted by: Janitha M.March 17, 2014, 6:43 PM

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