JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You have trial access to videos in this collection until May 31, 2014.

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

Near Infrared optisk projektionstomografi för bedömningar av β-cells massdistribution i diabetesforskning

*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1, 1

1Umeå Centre for Molecular Medicine, Umeå University, 2Cell Transplant Center, Diabetes Research Institute, University of Miami,, 3EMBL-CRG Systems Biology Program, Centre for Genomic Regulation, Catalan Institute of Research and Advanced Studies, 4Dept. of Computing Science, Umeå University

* These authors contributed equally
Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Cite this Article

    Eriksson, A. U., Svensson, C., Hörnblad, A., Cheddad, A., Kostromina, E., Eriksson, M., et al. Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. J. Vis. Exp. (71), e50238, doi:10.3791/50238 (2013).

    Abstract

    Genom att anpassa OPT att inkludera förmågan att avbildning i det nära infraröda (NIR) spektrumet, visar vi här möjligheten att bilden större kroppar av pankreatisk vävnad, såsom råtta bukspottkörteln, och att öka antalet kanaler (celltyper) som kan studeras i ett enda prov. Vi beskriver vidare att genomföra ett antal beräkningsverktyg som ger: 1 / noggrann positionering av ett prov är (i vårt fall bukspottkörteln) masscentrum (KOM) vid rotationsaxeln (AR) 2, 2 / förbättrade algoritmer för tjänsten -justering tuning som förhindrar geometriska förvrängningar under tomografiska återuppbyggnaden 2 och 3 / ett protokoll för intensitet utjämning för att öka signal-brus-förhållanden i OPT-baserade BCM bestämningar 3. Dessutom beskriver vi en provhållare som minimerar risken för oavsiktliga rörelser provet under bilden förvärv. Tillsammans utgör dessa protokoll möjliggör bedömningar av BCM distribution och OTHER-funktioner, som skall utföras under volymen intakt pankreata eller andra organ (t.ex. i studier av ö-transplantation), med en upplösning ner till enskilda Langerhanska öarna.

    Introduction

    De insulinproducerande β-cellerna är viktiga för kroppens förmåga att kontrollera homeostasen blodsockret. Därför bedömningar av bukspottskörteln BCM distributionen är viktigt att många områden preklinisk diabetesforskning. I utvärderingar av terapeutiska regimer till exempel effekterna av riktade gen ablation på endokrina celldifferentiering eller studier av diabetes etiologi i gnagarmodeller för sjukdomen beror ofta på sådana analyser. Traditionellt har dessa typer av bedömningar åberopas tidskrävande stereologisk metoder som är svåra att genomföra på grund av storleken och komplexa anatomiska konstitution i bukspottkörteln. De flesta högupplösta avbildning närvarande (vanligen optisk), ger inte tillräcklig penetrationsdjup för att hela bukspottkörteln avbildning hos gnagare. Omvänt, avbildning som inte begränsas av deras inträngningsdjup (typiskt kärnkraft) tillhandahålla dålig upplösning för att lösa hela BCM distribution och hämmasav bristen på tillräckliga kontrastmedel 4,5.

    Optisk projektionstomografi är en 3D avbildning modalitet som möjliggör högupplösta bedömningar av biomedicinska prover på mm till cm skala 6. Härigenom kan information om den rumsliga position och volym individuella insulinbehovet uttrycker Langerhanska öar extraheras hela volymen av bukspottkörteln i normala och diabetiska möss 3,7-10. Syftet med denna studie är att ytterligare öka kapaciteten av denna teknik för bedömningen av bukspottkörtelns β-celler, deras endogena fördelning när ympade in i andra vävnader, deras förhållande till andra bukspottkörteln beståndsdelar (t.ex. infiltrera celltyper) och större pankreas förberedelser än tidigare.

    Den infraröda optiska projektion tomografi (NIR-OPT) installation

    I nedanstående protokoll, en OPT skanner baserad på den ursprungliga uppsättningen beskrivs av Sharpe 1, anpassad för avbildning i det nära infraröda området beskrives och används. För enkanaliga bedömningar av mus bukspottkörteln (t.ex. av BCM) kan SkyScan 3001 (Bioptonics) skanner användas.

    En metallhalogenlampa som ger högre exciteringsenergi än en kvicksilverbåglampa vid våglängder över 650 nm, levererar excitationsljuset. Ljuset överförs genom en flytande ljusledare. En användbar kombination av fluorokromer och band filter passerar för NIR fluorescensavbildning och kanalseparation visas i figur 3. Det emitterade ljuset detekteras med en bakre upplyst CCD-kamera, med hög kvanteffektivitet i NIR-spektrat. OPT skanning automatiseras med hjälp av en LabView plattform som styr kameran och stegmotorn. För att stödja prov i storlek av intakt råtta pankreata, en skyddad silverbelagd spegel och en stor kyvett används. Äntligen en provhållaren som eliminerar oönskade vertikala movements av provet under avsökningen var utformad.

    Protocol

    1. Provberedning och skanning

    1,1 Provberedning

    Följande förfarande utförs väsentligen såsom beskrivits tidigare 7.

    1. Skörda bukspottkörteln. Använd iskall PBS för att undvika proteolytisk nedbrytning.
    2. Fäst vävnad i 4% PFA i PBS på is 2-3 tim. Se till att loberna är "utspridda" under fixering. Detta kommer att underlätta identifiering av anatomiska landmärken efter återuppbyggnaden.
    3. Tvätta i överskott PBS under 30 minuter.
    4. Dehydratisera bukspottkörteln stegvis i metanol (33, 66%, 100%), 15 minuter / steg. Detta minimerar bildandet av bubblor under blekning (se steg 5) och förhindrar celldestruktion vid frysning-tining (se steg 7).
    5. Inkubera vävnaden i nyberedd MeOH: H 2 O 2: DMSO blekning buffert i en 02:01:03 förhållande vid RT under 24 timmar för att släcka endogen vävnad fluorescens. För större prover utbyte till nya bleaching buffert och inkubera under ytterligare 24 timmar.
    6. Tvätta i överskott MeOH, ON.
    7. Frys-tö under åtminstone 5 cykler i -80 ° C - RT för att underlätta penetrering antikroppar.
    8. Rehydrera stegvis tillbaka till TBST (33, 66%, 100%), 15 min / steg.
    9. Block i TBST med 10% serum (företrädesvis från samma art som den sekundära antikroppen genererades), 5% DMSO och 0,01% Naaz för 12-24 timmar vid rumstemperatur
    10. Inkubera med primära antikroppar i blockerande buffert under 48 timmar, vid RT, omfatta 72 timmar för större prover (antikroppar används här listas i tabellen av reagens).
    11. Tvätta i överskott TBST, ON.
    12. Inkubera med fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar för 48 timmar, vid rumstemperatur, omfatta 72 timmar för större prover.
    13. Tvätta i överskott TBST, ON.

    1,2

    Följande procedur beskriver hur du monterar provet i agaros och anslut den till skräddarsydda provhållaren (se Figur 7) Före OPT skanning.

    1. Separera mjälte, duodenal-och ventrikelsår lober enligt figur 3A i Hörnblad et al 3. Förhållandet mellan loberna ytterligare förtydligas i Hörnblad et al 11.
    2. Bered 1,5% (vikt / volym) låg smälttemperatur agaros i dH 2 O, filtrera, låt svalna till 37 ° C och skölj vävnaden i dH 2 O att tvätta bort detergenten och avlägsna bubblor före agaros-inbäddning på is.
    3. Klipp ut en agaros blocket bifoga ditt prov och lämna ett ~ 1 cm distans mellan provet och botten av agarosen. Trim skarpa kanter (≤ 90 °) i agaros blocket för att reducera ljusspridning.
    4. Dehydratisera provet stegvis i MeOH (33, 66%, 100%), vilket ger tid att komma i jämvikt mellan varje steg. När provet sjunker det anses vara i jämvikt.
    5. Rensa provet i ett 1:2-lösning av bensylalkohol: Bensyl Benzoat (BABB) tills det blir genomskinligt. Utbyte BABB lösning och inkubera under ytterligare 12 timmar.
    6. Placera rensas provet i provhållaren och fäst den genom att sätta 2 nålar genom agaros distans via de borrade hålen i flänsarna på hållaren.
    7. Placera provet i skannern och dränka den i en kyvett fylld med BABB clearing-lösning. När man jämför en serie pankreata samma förstoring bör användas för alla avsökningar. Förstoringen bör optimeras för det största samplet i serien.

    1,3 Positionering av prov vid AR

    Följande protokoll beskriver förfarandet för att exakt positionera ett prov med användning av COM-AR algoritmen. Detta förfarande är endast tillämpligt när ROI omfattar hela provet. För detaljerade beskrivningar av algoritmer, se Cheddad et al 2.

    1. Acquire bilder av provet i två positioner för both anatomi och kanaler signal. Läge 1 vid 0 ° (i samband med X-axeln), uppvisar den största projektionsyta, och position 2 vid 90 ° (i samband med Z-axeln). Vi använder GFP-kanalen att visualisera anatomin.
    2. Applicera förväntan-maximering (EM)-algoritm på anatomi bilderna till tröskeln ROI.
    3. Beräkna COM punkterna (x-koordinater) för de binära bilder som erhålls i steg 2 för både 0 ° och 90 ° utsprång.
    4. Överlagra en lodrät linje som går genom den identifierade COM-punkten beräknas i steg 3 på 0 ° och 90 bilder ° i signalen kanalen.
    5. Använda bilderna som förvärvats i steg 4 som hänvisningar att flytta provet så att centrumlinjen för synfältet passerar genom de funna COM punkterna i provet.

    1,4 Skanning

    1. Justera exponering gånger för att uppnå den högsta signal-brusförhållandet utan Saturating alla områden av projektionen bilder. Upprepa för alla kanaler som ska skannas.
    2. Välj filtret apparaten första fluorescens kanalen som ska skannas. Utsläpp från kortare λ fluoroforer kan excitera fluoroforer med längre λ och därmed orsaka fotoblekning. För att minimera denna möjlighet, skanna fluoroforen med längsta excitation λ först.
    3. Öppna slutaren att belysa provet och uppsamla fluorescens signalen över 360 °, rotera provet längs den vertikala axeln för varje kanal. Steget vinkel används för NIR-OPT installationen är 0,9 ° och för Bioptonics 3001 scannern 0,45 °.
    4. Välj lämplig filter för nästa kanal och fortsätt enligt ovan.

    2. Computational Bearbetning och återuppbyggnad

    2,1 efter förvärvet förskjutning upptäcka och korrigera (A-värdet inställning)

    I projektion tomografi, är det i allmänhet nödvändigtatt tilldela en post-inriktning värde för prognoser till finjustera bilderna position längs rotationsaxeln före ombyggnad. Emellertid kan en liten avvikelse i vinkel kameran mot den optiska axeln orsakar olikformiga A-värden längs längden av provet och sålunda inducera geometriska förvrängningar. För att undvika en sådan snedvridning kan en beräkningsmetod för att hitta exakt och enhetlig efter justering värde (A-värdet) i hela provet appliceras två.

    1. Använd en diskret Fourier-transform för att dela en projektion av den specifika signalen vid 0 ° och 180 ° i 8 pixlar höjd block och beräkna förskjutningen längs x-axeln (A-värde) mellan varje block.
    2. Applicera en linjär minsta kvadratregression att hjälpa beräkna vinkeln θ ", som beskriver lutningen av x-axeln-skift utmed längden av provet, och att finna en roterande mittpunkt.
    3. Korrigera för avvikelser vid skanning genom att rotera alla projeTGÄRDER θ '/ 2 kring rotationscentrum punkten.

    2,2 Kontrast begränsad adaptiv histogramutjämning (CLAHE)

    För att underlätta upptäckt och segmentering av objekt (öar) uppvisar mycket svaga signaler som är i riskzonen att "tröskel ut" under rekonstruktion och / eller segmentering för kvantitativa bedömningar, kan en CLAHE algoritm tillämpas på projektionsbilder. Den CLAHE utförs med två stora intensitet transformationer:

    1. Den lokala kontrasten beräknas och utjämnas inom icke-överlappande block i den projicerade bilden.
    2. Intensiteterna sedan normaliseras vid gränsområdena mellan blocken genom bilinjär interpolation.

    Namnet kontrast-begränsad hänvisar till klippet gränsen, som är satt för att undvika mättande bildpunkter i bilden. I detta protokoll MATLAB inbyggda funktionen "adapthisteq" användes och tillämpas med standard c läpp gräns på 0,01 och en bricka storlek på 256. Notera, måste den optimala storleken kakel som skall testas empiriskt och kan variera beroende på den analyserade provet. Mer information om algoritmen och exempel kan hittas i Hörnblad et al 3.

    OBS! De ovan angivna computational processteg (inklusive COM-AR, A-värdet inställning och CLAHE, se 1,3-2,2) är byggda på vanliga algoritmer och utförs i MATLAB (Mathworks).

    2,3 tomografiska rekonstruktion och iso-yta rendering

    1. Med hjälp av en filtrerad back-projektion algoritm kan de korrigerade och normaliserade bilder nu rekonstrueras med enhetlig snedställning kompensation och minimikrav för optimering av dynamiskt omfång. I detta protokoll är alla rekonstruktioner utförs med den filtrerade metoden bakprojektion finns i NRecon programmet (SkyScan), version 1.6.8 (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Observera beror förstoringen av ett avbildat objekt på dess avstånd från brännpunkt objektivet inte parallell stråle geometri genomförs i bildbehandling setup. Därför när du importerar en projektion dataset till NRecon programvara är det viktigt att rätt objekt att köpa avstånd (mm) och rotationsriktning skannern (för moturs ingång "CC" och för medurs ingång "CW") i det bifogade loggfil, för att undvika Cone Beam inducerade artefakter under rekonstruktion.
    2. Att visualisera och kvantifiera bunten med virtuella erhållna sektioner, skapa 3D iso-ytor med lämplig programvara bildbehandling som Imaris eller Volocity.

    Murint holme isolering och förfaranden transplantation utfördes vid Diabetes Research Institute prekliniska Cell Bearbetning och translationell modell Kärna omprövas enligt protokoll och godkänns av University of MiamJag Institutional Animal Care och användning kommittén. Den etiska kommittén för djurförsök, norra Sverige godkände alla andra experiment med djur.

    Representative Results

    I den aktuella rapporten beskriver vi ett protokoll för utvinning och beräkningsbiologi behandling av BCM data gnagare pankreata (och andra vävnader) med NIR-OPT (figur 1). Såsom illustreras i figur 2, är vävnad autofluorescense från pankreatisk prov som väntat markant minskat i NIR-spektrat. Detta leder till en betydande ökning av genomsnittlig signal till brus (S: N) för bedömning av insulin märkta Langerhanska öarna. Genom anpassningarna av OPT till bildåtergivning i NIR delen av spektrumet, som beskrivs här, kan åtminstone tre specifika kanaler visualiseras med tillräcklig S: N ratio så att bedömningar av antikropp märkt celltyper hela volymen av murina bukspottkörteln med distinkt kanaldelning (se figur 3 och 4). Tillämpat på avbildning av diabetogena processer och / eller BCM bedömningar i allmänhet, gör tekniken därmed för visualisering och kvantifiering avinsulin positiva områden i förhållande till omgivande och / eller interagera celltyper (se figur 4). Sådana bedömningar är tack vare den ökade vävnad penetrationsdjup erhålls i NIR-området möjligt att utföra i mycket större exemplar än tidigare, bland annat råtta bukspottkörteln, vilket är 3-5 gånger större än dess mus motsvarighet (se figur 5). Oavsett om synliga eller NIR våglängder används, kan genomförandet av CLAHE avsevärt underlätta OPT baserade bedömningar av BCM under olika genetiska och fysiologiska förhållanden genom att öka detektionskänsligheten av tekniken (se figur 6). En plan för den utvecklade provhållaren visas i figur 7.

    Figur 1
    Figur 1. Flödesschema som visar de kritiska stegen för opt-baserade analyser av BCM i murine bukspottkörteln. Den tid som krävs för att bedöma en typisk mus bukspottkörteln är 13-14 dagar. Huvuddelen av tiden förbrukas under vävnadsbehandling och immunohistokemisk färgning (10 dagar), kräver vävnads clearing ca 2 dagar, medan längden av skanningen är beroende av den som krävs exponeringstiden (normalt ca 1 timme). Den efterföljande behandlingen beräkningsmässiga typiskt utförs inom en dag. Observera den relativt långa färgningsprotokollet idealiskt lämpade för satsvis behandling av större mängder av prover.

    Figur 2
    Figur 2. Signal till brus-förhållanden för BCM bedömningar vid olika våglängder. En mus duodenal pankreatisk lob, färgades för insulin och med en cocktail av fluorokrom-konjugerade sekundära antikroppar (Alexa 488, 594, 680 och750), användes för att bestämma S: N-förhållanden vid olika våglängder. A, Bilder visar den första projektionen ramen för varje signal kanal. B, Diagram illustrerande den genomsnittliga S: N för varje signalkanal. Förhållandena bestämdes som den genomsnittliga ö intensitet (baserat på 215 öar) dividerat med bakgrunden intensiteten (den endogena vävnaden fluorescensen från den exokrina vävnaden). C Diagram som visar S: N kvoter för de enskilda öarna i varje kanal normaliseras till S: N erhålls för Alexa 594 kanal. Ett sätt ANOVA användes för statistiska analyser. Betydelse nivåer indikerade motsvarar ** p <0,01. Skala bar i (A) motsvarar 1 mm. Klicka här för att se större bild .

    Figur 3
    Figur3. Kanalseparation. A, Sekundära antikroppar konjugerade med Alexafluor färgämnen i tabellen immobiliserade separat på proteinG-Sepharose-pärlor. B, The fluorescerande pärlor sedan inbäddade på olika nivåer i en agaros fantom och avbildas med angivna filter.

    Figur 4
    Figur 4. OPT baserade flerkanalig avbildning i diabetesforskning. A, OPT baserade iso-yta rekonstruktion av en bukspottkörtel (12 veckor, duodenal lob) från icke feta diabetiker (NOD) modell för typ 1-diabetes. Provet färgas för insulin (ö β-celler, pseudo färgad blå), glatta muskler α-aktin (blodkärl, röd) och CD3 (infiltrerande T-lymfocyter, grön). De motsvarande sekundära antikroppar som användes var, Cy3, IRDye-680 och DyeLight-750 respektive. Deninläggningar (A'-A'' ') visar de individuella signalkanalerna. B, OPT bild (slag upp vyn) av en muslever lob (Lobus olycksbådande lateralis) ympad med syngena holmar och avbildas med NIR-OPT två veckor efter transplantation. Insulinet som uttrycker öarna pseuodocolored i blått och den glatta muskulaturen α-aktin positiva fartyg i rött. Den strategi gör det möjligt för bedömningar av ö transplantat distribution inom vaskulära nätverket. Skala barer motsvarar 1 mm.

    Figur 5
    Figur 5. NIR-OPT underlättar avbildning av större prov. A, Iso-yta rendering av BCM fördelningen i en råtta pankreas från Zucker Fatty modell för typ 2-diabetes (mjält loben vid 9 månader), exemplifierar möjligheten att avbilda prov på råtta bukspottkörteln skala genom NIR-OPT. Såsom bestämdesav denna teknik visade loben är ~ 6 gånger större (volym / volym) än dess motsvarighet mus och hyser 10.139 insulin uttrycker Langerhanska öar vars β-cellvolymen utgör 1,32% av den totala volymen lobulära. B, tomografisk sektion motsvarande den streckade linjen i (A) illustrerar att cellöar från alla djup vävnaden detekteras. C Iso-yta rendering av BCM fördelningen i en mus bukspottkörteln (mjälten lob vid 8 veckor) visas som en storlek referens. Den visade loben hyser 2490 insulin uttryckande öar vars β-cellvolymen utgör 0,89% av den totala volymen lobulära. Den pankreata färgas med GP-anti-insulin följt av Alexa594-konjugerad get-anti-GP (mus) och IRDye 680 Konjugerad åsna-anti-GP (råtta) antikroppar respektive. De exemplar i (AC) avbildas till skala och skala bar i (C) motsvarar 2 mm.

    Figur 6 Figur 6. CLAHE underlättar upptäckt av öar i det murina bukspottkörteln som OPT avbildning. AC, Representativa iso-yta utförda OPT bilder av ett C57BL / 6 mus bukspottkörteln (mjälten lob vid 8 veckor) märkt för insulin. Iso-yta rekonstruktioner av OPT bilder utfördes före (A, pseudo färgad grön) och efter CLAHE protokollet applicerades (B, pseudo färgad röd). C Överlagring av de icke-normaliserade data i (A) och de CLAHE behandlade data i (B). C'-C ", representant hög förstoring överlagring av de icke-normaliserade (A) och CLAHE bearbetade (B) bilder. Som framgår av närvaron av" röda "enbart cellöar, underlättar CLAHE skriptet detektion av små och låg signal intensitet holmar. I det aktuella exemplet den avbildade exemplaret (efter CLAHE bearbetning) härbärgerade 2419 öar med en volym på 1,74 mm 3 (Siffror baserade på motsvarande obehandlade projektionsdata var 1057 öar wie en volym av 1,77 mm 3). D och E, Exempel data från kontroll (D) och ob / ob-musmodellen för typ 2-diabetes 12 (E) vid 6 månader genomför CLAHE protokollet. Notera den massiva allmänna ökningen ö storlek i ob / ob-pankreas (E). I (D) och (E) bukspottkörteln kontur (grå) är baserat på signalen från vävnad autofluorescens. Skala bar i C är 500 nm i AC. Skala bar i C "motsvarar 200 nm i C och C''. Skala bar i E motsvarar 1 mm i (D) och (E). Bilder i (AC) är anpassade från Hörnblad m.fl. 3 och genererades med hjälp av Bioptonics 3001 skanner.

    Figur 7
    Figur 7. Provhållare för fastsättning av passiv prover. Provet är fäst genom införande nålar genom agaros distansorganet via förborrade hål i flänsarna. Hållaren är ledad till stegmotorn viastark magnet som ligger i botten. Denna setup utelämnar användning av instabila lim och förhindrar oönskade rörelser provet under skanning.

    Discussion

    De beskrivna teknikerna för OPT avbildning möjliggör extraktion av rumsliga och kvantitativa parametrar genom hela volymen av den murina bukspottkörteln. På grund av begränsningar i möjlig lösning för denna typ av mesoskopisk avbildning bör det noteras att, som för de flesta avbildningsmetoder, desto större provet desto lägre upplösning (Även om användningen av en högre upplösning CCD bör öka upplösningen av OPT scan) . Därför, för bedömning av intakta lober bukspottkörteln mus, ger tekniken för närvarande inte en enda cell upplösning även om nära (ca 15-20 nm) 7. Fortfarande, för utvinning av BCM distribution i mus bukspottkörteln protokollen har lämnat uppgifter som mer än väl motsvarar de som erhålls genom t.ex. punkt räkna morfometri 3,13 Det bör noteras att även om genomförandet av CLAHE protokollet tillåter detektion av betydligt fler öar Dessa holmar är i allmänhet mindre och inte bidragte avsevärt till de totala β-cellvolymer.

    De immunhistokemiska inblandade protokoll är relativt lång (upp till två veckor), men de faktiska händerna på tiden för provberedning är kort och därför tekniken lämpar sig väl för att studera stora grupper av djur 9. Om potential heterogena distributionsmönster är ett fokus för utredningen, bör det understrykas att försiktighet bör iakttas i stegen om fixering och montering för att undvika att pankreasvävnad blir fast i en ogynnsam sätt och en platt ("utspridda" ) montera av vävnaden bör eftersträvas för att underlätta sådana bedömningar.

    En viktig fråga när du utför OPT är att provets COM fastställs till rotationsaxeln och att det inte rör sig, antingen vertikalt eller horisontellt, vid undersökningen. Därför är det viktigt att ha en stabil mekanisk installation och ett väl fungerande system för attaching provet. Vi löste problemet genom att bygga en ny montering (Figur 7).

    Parallell geometri var inte sant för våra NIR-OPT eller Bioptonics 3001 scanner, som upptäcktes som en vertikal förskjutning mellan baksidan och framsidan positioner perifera föremål i inspelade projektionsbilder. Genom att justera objektet källan avstånd i loggfilen för respektive scannern (se 2.3.1) kan vi avsevärt förbättra kvaliteten på våra data och korrigera geometriska förvrängningar Längst kanter projektionsbilder, vilket är särskilt viktigt när bedöma större prover.

    I det nuvarande protokollet, ger vi ett förslag på filter uppsättningar som möjliggör visualisering av tre olika specifika kanaler och en "anatomi" kanal i bedömningar av intakta pankreatiska preparat. Uppenbarligen dessa inställningar kan anpassas för att bättre passa fluorokromer som används för en given studie även om, som med alla former av fluorescerandeprocent mikroskopi bör den potentiella risken av signal genomblödning noggrant utvärderas. Studien av insulin märkta öar med fluorokromer som exciteras över 750 nm har ännu inte varit möjligt av oss med metallhalogen lampa som vår inrättats använder. Det är möjligt att en kamera med ännu högre kvantverkningsgrad i de relevanta våglängderna i kombination med alternativa ljuskällor (t.ex. diodlasrar) kan öka potentialen för NIR-OPT ytterligare och möjliggöra avbildning vid ännu högre våglängder.

    OPT avbildning är en mycket mångsidig teknik för rumsliga och kvantitativa bedömningar av biomedicinska prov på mm-cm skala. Även om protokollen som presenteras här har utvecklats för det huvudsakliga syftet med bukspottkörteln / diabetesforskning de ska kunna översätta till forskning om andra arter, typer prov och markörer. Genom möjligheten att visualisera flera olika kanaler i intakta pankreatiska förberedelser NIR-OPT avbildning fTTERLIGARE har potential som ett verktyg för att utvärdera upptag specificiteten av kontrastmedel avsedda för icke-invasiva bedömningar av andra avbildningsmetoder, så länge dessa kontrastmedel kan vara utformade för att även en fluorofor upptäckas med OPT.

    Disclosures

    Inga intressekonflikter deklareras.

    Acknowledgements

    Dr P. Lindström är känd för att ge ob / ob möss. J. Lehtonen är känd för hjälp med videoproduktion och J. Gilbert för hjälp med redigering. Denna studie har finansierats med bidrag från Diabetes Research Institute Foundation (AP), Juvenile Diabetes Research Foundation (AP och UA), Europeiska kommissionen (FP-7, bidragsavtal nr:. CP-IP 228.933-2) (JS och UA), Kempestiftelserna, Umeå universitet och den svenska Vetenskapsrådet till UA

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Methanol Scharlau ME03162500
    30% H2O2 Scharlau HI01362500
    Benzyl Alcohol Scharlau AL01611000
    Benzyl Benzoate Scharlau BE01851000
    Low-meltingpoint agarose LONZA 50100
    Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
    DMSO Sigma-Aldrich D5879
    Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787
    Mouse anti-aSMA-Cy3 Sigma-Aldrich C6198 Primary antibody
    Rabbit anti-CD3 Sigma-Aldrich C7930 Primary antibody
    Guinea Pig anti-Ins DAKO A0564 Primary antibody
    Donkey anti GP-IRDye680 LI-COR Biosciences 926-32421 Secondary antibody
    Goat anti Rb-DyeLight750 Thermo Scientific 35570 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11076 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa488 Molecular Probes A-11008 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11012 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa680 Molecular Probes A-21076 Secondary antibody
    Goat anti GP-Alexa750 Molecular Probes A-21039 Secondary antibody
    OPT Skyscan 3001 Bioptonics OPT-Scanner
    Leica MZ FLIII Leica Microsystems Stereomicroscope
    Leica Objective 0.5x Leica Microsystems 10446157
    Leica Camera adapter 1.0x Leica Microsystems 10445930
    EL6000 Metal Halide 11504115 Lightsource
    Liquid Light Guide 11504116
    Cuvette Hellma Analytics 6030-OG 55 x 55 x 52.5 mm
    Mirror Edmund Optics F68-334 50 x 50 mm
    Andor Ikon-M Andor Technology DU934N-BV Back-illuminated CCD
    Filterset Chroma Technology 41021-MZFLIII TXR, Alexa-594, Cy3
    Filterset Chroma Technology 41022-MZFLIII IRDye680, Alexa-680
    Filterset Chroma Technology 49037-MZFLIII Dylight750, Alexa-750
    ProteinG-Sepharose beads GE Healthcare 17-0618-01 Protein G Sepharose 4 Fast Flow
    Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591 Sodium azide 0.1 M solution

    References

    1. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545, [pii] 296/5567/541 doi:10.1126/science.1068206 (2002).
    2. Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., & Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. doi:10.1109/TMI.2011.2161590 (2012).
    3. Hornblad, A., Cheddad, A., & Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208, doi:10.4161/isl.3.4.16417 (2011).
    4. Holmberg, D. & Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154, doi:10.1007/s00125-008-1140-7 (2008).
    5. Ahlgren, U. & Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57, doi:10.1007/978-90-481-3271-3_3 (2010).
    6. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228, doi:10.1146/annurev.bioeng.6.040803.140210 (2004).
    7. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33, [pii] nmeth985 doi:10.1038/nmeth985 (2007).
    8. Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070, doi:10.1117/1.3000430 (2008).
    9. Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764, doi:10.2337/Db09-1400 (2010).
    10. Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936, doi:10.1007/s00125-010-1692-1 (2010).
    11. Hornblad, A., Eriksson, A.U., Sock, E., Hill, R.E., & Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753, [pii] PONE-D-11-06725 doi:10.1371/journal.pone.0021753 (2011).
    12. Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
    13. Bock, T., Pakkenberg, B., & Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).

    Comments

    1 Comment

    Very interesting. this is not my field of study but I believe that your work is very important and it blows my mind. Christoffer Svensson, We know who has the BIG brains in the family. Congratulations on all your success and hard work I am proud of you. One day you have to take a couple of hours and sit down and explain it to me.
    Reply

    Posted by: Alexander S.January 15, 2013, 1:07 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter