Name: Près de tomographie optique de projection infrarouge pour lévaluation de la distribution de masse β-cellulaire en recherche sur le diabète (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 18 s
Description: Découvrez la tomographie optique de projection infrarouge pour évaluer la masse de cellules bêta pancréatiques. Cette méthode computationnelle améliore l'imagerie multicanal et la qualité des données pour la recherche sur le diabète.

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Dr. P. Lindström est reconnu pour fournir des souris ob / ob. J. Lehtonen est reconnu pour l&#39;aide à la production vidéo et J. Gilbert de l&#39;aide à l&#39;édition. Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation Diabetes Research Institute (AP), la Juvenile Diabetes Research Foundation (AP et UA), la Commission européenne (FP-7, un accord de subvention n °:. CP-IP 228933-2) (JS et UC), les Fondations Kempe, Umeå University et le Conseil de recherche suédois d&#39;UC

1. Préparation des échantillons et de numérisation 1.1 Préparation des échantillons La procédure suivante est réalisée essentiellement comme décrit précédemment 7. <ol><li> Récolter le pancréas. Utilisez PBS glacé pour éviter la dégradation protéolytique. </li><li> Fixer le tissu en PFA à 4% dans du PBS sur la glace pendant 2-3 h. Assurez-vous que les lobes sont &quot;étalés&quot; lors de la fixation. Cela facilitera l&#39;identification des repères anatomiques après reconstruction. </li><li> Laver à l&#39;excès de PBS pendant 30 min. </li><li> Déshydrater le pancréas par étapes dans le méthanol (33, 66%, 100%), 15 min / étape. Cela permet de minimiser la formation de bulles lors du blanchiment (voir étape 5) et empêche la destruction des cellules au cours de congélation-décongélation (voir l&#39;étape 7). </li><li> Incuber le tissu fraîchement préparée dans du MeOH: H 2 O 2: DMSO blanchiment tampon dans un rapport de 02:01:03 à température ambiante pendant 24 h à étancher fluorescence tissu endogène. Pour les plus grands échantillons, l&#39;échange de nouvelles bleaching tampon et incuber pendant une autre heure 24. </li><li> Laver dans du MeOH en excès, ON. </li><li> Congélation-décongélation pendant au moins 5 cycles de -80 ° C - RT pour faciliter la pénétration des anticorps. </li><li> Réhydrater par étapes vers TBST (33, 66%, 100%), 15 min / étape. </li><li> Bloquer dans TBST avec 10% de sérum (de préférence de la même espèce dans laquelle l&#39;anticorps secondaire a été généré), 5% de DMSO et Naaz 0,01% pour les 12-24 h à la température ambiante </li><li> Incuber avec des anticorps primaires dans un tampon bloquant pendant 48 heures, à la température ambiante, de prolonger à 72 h pour les grands échantillons (anticorps utilisés ici sont répertoriés dans le tableau des réactifs). </li><li> Laver dans du TBST excès, ON. </li><li> Incuber avec fluorescence des anticorps secondaires conjugués pendant 48 heures, à la température ambiante, de prolonger à 72 h pour les grands échantillons. </li><li> Laver dans du TBST excès, ON. </li></ol> 1,2 La procédure suivante décrit comment monter l&#39;échantillon dans de l&#39;agarose et le fixer au porte-échantillon faits sur mesure (voir Figure 7) Avant OPT balayage. <ol><li> Séparer les lobes spléniques, gastriques et duodénaux selon la figure 3A dans Hörnblad et al 3. La relation entre les lobes est en outre précisé dans Hörnblad et al 11. </li><li> Préparer 1,5% (p / v) d&#39;agarose à faible température de fusion de dH 2 O, filtre, laisser refroidir à 37 ° C et rincer le tissu dans dH 2 O pour laver la lessive et éliminer les bulles d&#39;agarose avant-encastrement sur ​​glace. </li><li> Découper un bloc d&#39;agarose renfermant l&#39;échantillon et laisser un espacement ~ 1 cm entre l&#39;échantillon et la base de l&#39;agarose. Couper des arêtes vives (≤ 90 °) du bloc d&#39;agarose afin de réduire la diffusion de lumière. </li><li> Déshydrater l&#39;échantillon pas à pas dans le MeOH (33, 66%, 100%), ce qui permet d&#39;équilibrer le temps entre chaque étape. Lorsque l&#39;échantillon coule il est considéré comme étant équilibrée. </li><li> Effacer l&#39;échantillon dans une solution 1:2 d&#39;alcool benzylique: Benzyl Benzoate (BABB) jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne transparent. Échange BABB solution et incuber pendant encore 12 heures. </li><li> Positionner l&#39;échantillon effacée dans le porte-échantillon et le fixer par l&#39;insertion, 2 aiguilles à travers l&#39;entretoise d&#39;agarose par des trous percés dans les brides du support. </li><li> Placer l&#39;échantillon dans le scanner et le plonger dans une cuvette remplie de compensation BABB solution. Lorsque l&#39;on compare une série de pancréas même grossissement doit être utilisé pour toutes les analyses. Le grossissement doit être optimisé pour le plus grand échantillon de la série. </li></ol> 1.3 Positionnement de l&#39;échantillon à l&#39;AR Le protocole suivant décrit la procédure à positionner avec précision un échantillon en utilisant l&#39;algorithme COM-AR. Cette procédure n&#39;est applicable que lorsque le retour sur investissement inclut le spécimen. Pour une description détaillée des algorithmes, s&#39;il vous plaît voir Cheddad et al 2. <ol><li> Acquérir des images de l&#39;échantillon en deux positions de roboth l&#39;anatomie et de canaux de signaux. La position 1 à 0 ° (associée à l&#39;axe X), présentant la plus grande zone de projection, et de la position 2 à 90 ° (associé à l&#39;axe Z). Nous utilisons le canal de GFP de visualiser l&#39;anatomie. </li><li> Appliquer l&#39;espérance-maximisation (EM) sur les images d&#39;anatomie au seuil du retour sur investissement. </li><li> Calculer les points COM (abscisses) des images binaires obtenues à l&#39;étape 2 à la fois pour le 0 ° et 90 ° des projections. </li><li> Superposer une ligne verticale passant par le point COM identifié calculé à l&#39;étape 3 sur le 0 ° et 90 ° des images de la chaîne du signal. </li><li> Utiliser les images acquises à l&#39;étape 4 comme références pour déplacer l&#39;échantillon de telle sorte que la ligne médiane du champ de vision passe par les points trouvés COM de l&#39;échantillon. </li></ol> 1.4 Numérisation <ol><li> Réglez le temps d&#39;exposition pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit possible sans saturationTing toutes les zones des images de projection. Répétez l&#39;opération pour tous les canaux à scanner. </li><li> Sélectionner le jeu de filtres pour le premier canal de fluorescence à numériser. Les émissions des fluorophores λ courts peuvent exciter des fluorophores avec plus λ et provoquer ainsi photoblanchiment. Pour minimiser ce problème, scannez le fluorophore avec λ la plus longue première excitation. </li><li> Ouvrir l&#39;obturateur pour illuminer l&#39;échantillon et collecter le signal de fluorescence au-dessus de 360 ​​°, la rotation de l&#39;échantillon le long de l&#39;axe vertical pour chaque canal. L&#39;angle de pas utilisée pour la configuration NIR-OPT est de 0,9 ° et pour le scanner 3001 Bioptonics 0,45 °. </li><li> Sélectionnez le filtre approprié pour le canal suivant et procéder comme ci-dessus. </li></ol> 2. Traitement informatique et de la reconstruction 2.1 Détection de désalignement post-acquisition et de correction (Une valeur de mise au point) En tomographie à projection, il est en général nécessaired&#39;attribuer une valeur post-alignement sur les projections pour affiner la position des images le long de l&#39;axe de rotation avant la reconstruction. Toutefois, une petite aberration dans l&#39;angle de la caméra vers l&#39;axe optique peut provoquer la non-uniforme de valeurs-sur la longueur de l&#39;échantillon et donc induire des distorsions géométriques. Pour éviter ces distorsions, une méthode de calcul pour trouver le précise et unifiée post-alignement valeur (valeur A) dans le spécimen peut être appliquée 2. <ol><li> Utiliser une transformée de Fourier discrète pour diviser une projection du signal spécifique à 0 ° et 180 ° en 8 blocs de pixels de hauteur et calculer le décalage le long de l&#39;axe x (la valeur A) entre chaque bloc. </li><li> Appliquer une régression des moindres carrés linéaire pour aider à calculer l&#39;angle θ &#39;, qui décrit la pente de l&#39;axe des x-décalage le long de la longueur de l&#39;échantillon, et de trouver un point central de rotation. </li><li> Corriger les défauts d&#39;alignement lors de la numérisation par rotation tous les projections θ &#39;/ 2 autour du point central de rotation. </li></ol> 2.2 Contraste égalisation adaptative limitée histogramme (CLAHE) Pour faciliter la détection et la segmentation des objets (îlots) présentant des signaux très faibles, qui sont à risque d&#39;être «seuillée sur&quot; lors de la reconstruction et / ou de segmentation pour des évaluations quantitatives, un algorithme CLAHE peut être appliqué sur les images de projection. L&#39;opération est effectuée avec CLAHE deux transformations importantes d&#39;intensité: <ol><li> Le contraste local est estimé et égalisé à l&#39;intérieur des blocs ne se chevauchant pas dans l&#39;image de projection. </li><li> Les intensités sont ensuite normalisés sur les régions frontalières entre les blocs par interpolation bilinéaire. </li></ol> Le nom de contraste limitée se réfère à la limite clip, qui est réglé pour éviter Pixel saturation de l&#39;image. Dans ce protocole, le MATLAB intégré dans la fonction &quot;adapthisteq» a été utilisée et appliquée par défaut avec le c<html> limite lèvre de 0,01 et une taille de carreau de 256. Notez la taille des carreaux optimal doit être testée empiriquement et peut varier en fonction de l&#39;échantillon analysé. Plus de détails sur l&#39;algorithme et des exemples peuvent être trouvés dans Hörnblad et al 3. Remarque: Les étapes énumérées ci-dessus (y compris traitement de calcul COM-AR, réglage Une valeur et CLAHE, voir 1,3-2,2) sont construits sur des algorithmes standard et sont exécutées dans MATLAB (The Mathworks). 2,3 reconstruction tomographique et iso-surface de rendu <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un rétroprojection filtrée algorithme, les images corrigées et normalisées peuvent maintenant être reconstruit avec compensation de désalignement unifiée et exigence minimale pour l&#39;optimisation de la gamme dynamique. Dans ce protocole, toutes les reconstructions sont réalisées en utilisant la méthode de projection arrière filtrée disponible dans le logiciel NRecon (Skyscan), version 1.6.8 (= &quot;_blank&quot;&gt; Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Remarque, le grossissement d&#39;un objet imagé dépend de sa distance par rapport au point focal de la lentille à moins géométrie du faisceau parallèle est mis en œuvre dans l&#39;installation d&#39;imagerie. Par conséquent, lors de l&#39;importation d&#39;un ensemble de données de projection pour le logiciel NRecon il est important d&#39;inclure le bon objet à distance de la source (mm) et le sens de rotation du scanner (pour le compteur d&#39;entrée &quot;cc&quot; aiguilles d&#39;une montre et dans le sens horaire pour l&#39;entrée &quot;cw&quot;) dans l&#39;accompagnement log, pour éviter les artefacts faisceau conique induites lors de la reconstruction. </li><li> Pour visualiser et de quantifier l&#39;empilement des sections virtuelles obtenues, générer 3D iso-surfaces à l&#39;aide du logiciel de traitement d&#39;image approprié tel que Imaris ou Volocity. </li></ol> D&#39;isolement des îlots murins et procédures de transplantation ont été effectuées à Traitement de la recherche sur le diabète Institut cellulaire préclinique et Core Model translationnelle en vertu de protocoles examinés et approuvés par l&#39;Université de Miami des soins aux animaux et du Comité utilisation. Le comité d&#39;éthique pour la recherche sur les animaux, nord de la Suède, a approuvé toutes les autres expériences impliquant des animaux.

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<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54, 133-137 (2005).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les techniques décrites pour OPT imagerie permet l&#39;extraction de paramètres spatiaux et quantitative dans tout le volume du pancréas murin. En raison de limitations dans la résolution possible pour ce type d&#39;imagerie mésoscopique il convient de noter que, comme pour la plupart des modalités d&#39;imagerie, plus l&#39;échantillon inférieur le la résolution (Bien que l&#39;utilisation d&#39;une résolution plus élevée CCD devrait augmenter la résolution de la numérisation OPT) . Ainsi, pour l&#39;évaluation de la souris intactes lobes du pancréas, de la technique à l&#39;heure actuelle ne fournit pas la résolution cellule unique bien que proche (environ 15-20 um) 7. Pourtant, pour l&#39;extraction de la distribution BCM dans le pancréas de souris les protocoles ont fourni des données qui correspondent à plus que bien ceux obtenus par exemple le point de comptage morphométrie 3,13 Il convient de noter que, bien que la mise en œuvre du protocole CLAHE permet la détection d&#39;îlots significativement plus , ces îlots sont généralement plus petits et ne contrite essentiellement aux β-ensemble de cellules volumes. Les protocoles immunohistochimiques impliqués sont relativement longues (jusqu&#39;à deux semaines), mais les mains réelles sur le temps de préparation de l&#39;échantillon est court et donc la technique est bien adaptée à l&#39;étude de grandes cohortes d&#39;animaux 9. Si le potentiel des modes de distribution hétérogènes est une priorité pour l&#39;enquête, il convient de souligner que des précautions doivent être prises dans les étapes concernant la fixation et le montage pour éviter que le tissu pancréatique est fixé de manière défavorable et un plat (&quot;étalée&quot; ) de montage du tissu faudrait s&#39;efforcer de faciliter de telles évaluations. Une question importante lors de l&#39;exécution OPT, c&#39;est que COM de l&#39;échantillon est fixé à l&#39;axe de rotation et qu&#39;il ne bouge pas, verticalement ou horizontalement, au cours de la procédure de numérisation. Par conséquent, il est essentiel d&#39;avoir une configuration mécanique stable et un système qui fonctionne bien pour attaching de l&#39;échantillon. Nous avons résolu ce problème en construisant une nouvelle monture (Figure 7). Géométrie parallèle n&#39;était pas le cas de notre NIR-OPT ou Bioptonics 3001 scanner, qui a été détecté comme un décalage vertical entre les positions arrière et avant des objets périphériques dans les images de projection enregistrées. En ajustant l&#39;objet à distance de la source dans le fichier journal du scanner respectif (voir 2.3.1) nous avons pu améliorer considérablement la qualité de nos données et de corriger les distorsions géométriques sur les bords loin des images de projection, ce qui est particulièrement important lorsque évaluer les plus grands spécimens. Dans le protocole actuel, nous fournissons une suggestion de jeux de filtres qui permettent de visualiser des trois différents canaux spécifiques et une «anatomie» de canaux dans les évaluations des préparations pancréatiques intacts. Bien entendu, ces paramètres peuvent être modulés pour mieux répondre aux fluorochromes utilisés pour une étude donnée même si, comme toutes les formes de fluorescencemicroscopie cent, le danger potentiel du signal transpercement doit être soigneusement évaluée. L&#39;étude des îlots d&#39;insuline marquées avec des fluorochromes qui sont excités au-dessus de 750 nm n&#39;a pas encore été possible de nous en utilisant le lampe aux halogénures métalliques que notre jeu utilise le haut. Il est possible que d&#39;un appareil photo avec une efficacité quantique encore plus élevée dans les longueurs d&#39;onde pertinentes en combinaison avec d&#39;autres sources lumineuses (diodes laser, par exemple) pourraient augmenter le potentiel de NIR-OPT loin et permettre à l&#39;imagerie des longueurs d&#39;onde encore plus élevés. OPT est une technique d&#39;imagerie très polyvalent pour les évaluations spatiales et quantitatives des échantillons biomédicaux à l&#39;échelle mm-cm. Bien que les protocoles présentés ici ont été développées dans le but principal du pancréas / recherche sur le diabète, ils devrait être possible de traduire la recherche sur d&#39;autres espèces, les types d&#39;échantillons et des marqueurs. Par la possibilité de visualiser plusieurs chaînes distinctes dans des préparations pancréatiques intacts, NIR-OPT imagerie futres a le potentiel comme outil pour évaluer la spécificité absorption d&#39;agents de contraste destinés à l&#39;évaluation non invasive par d&#39;autres modalités d&#39;imagerie, pour autant que ces agents de contraste pourrait être conçu pour transporter aussi un fluorophore détectable par l&#39;OPT.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Le productrices d&#39;insuline des cellules β sont essentiels pour la capacité du corps à contrôler l&#39;homéostasie du glucose sanguin. Par conséquent, l&#39;évaluation de la distribution BCM pancréas sont indispensables pour de nombreux domaines de recherche sur le diabète pré-clinique. Dans les évaluations de régimes thérapeutiques, par exemple, l&#39;impact de l&#39;ablation génique ciblée sur la différenciation des cellules endocrines ou des études d&#39;étiologie du diabète dans des modèles rongeurs de la maladie dépendent souvent de telles analyses. Traditionnellement, ce type d&#39;évaluation se sont appuyés sur fastidieuses démarches stéréologiques qui sont difficiles à réaliser en raison de la taille et la complexité constitution anatomique du pancréas. La plupart des approches d&#39;imagerie haute résolution à l&#39;heure actuelle (en général, optique), ne fournissent pas de profondeur de pénétration suffisante pour permettre l&#39;imagerie du pancréas entier chez les rongeurs. A l&#39;inverse, des méthodes d&#39;imagerie qui ne sont pas limités par leur profondeur de pénétration (typiquement nucléaire) fournir à faible résolution pour résoudre la distribution BCM plein et sont entravéspar le manque d&#39;agents de contraste suffisants 4,5. Tomographie optique de projection est une modalité d&#39;imagerie 3D qui permet des évaluations à haute résolution d&#39;échantillons biomédicaux sur la mm à l&#39;échelle 6 cm. Par la présente, des informations sur la position dans l&#39;espace et le volume de l&#39;insuline individu exprimant des îlots de Langerhans peut être extrait à travers le volume du pancréas chez les souris normales et 3,7-10 diabétique. L&#39;objectif de la présente étude consiste à renforcer la capacité de cette technique pour l&#39;évaluation de la β-cellules pancréatiques; leur répartition endogène, lorsqu&#39;ils sont greffés dans d&#39;autres tissus, leur relation avec les constituants du pancréas (tels que l&#39;infiltration types de cellules) et dans les grandes préparations pancréatiques qu&#39;auparavant. La proximité de la tomographie optique de projection infrarouge (NIR-OPT) de configuration Dans le dessous de protocoles, d&#39;un scanner basé sur la TPO en place d&#39;original décrit par Sharpe <em&gt; 1 et al, adapté pour l&#39;imagerie dans l&#39;infrarouge proche est décrit et utilisé. Pour l&#39;évaluation de canal unique du pancréas de la souris (par exemple de BCM), le SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner peut être utilisé. Lampe à halogénure métallique qui fournit de l&#39;énergie d&#39;excitation plus élevée qu&#39;une lampe à arc au mercure à des longueurs d&#39;onde 650 nm au-dessus, fournit la lumière d&#39;excitation. La lumière est transmise à travers un guide de lumière liquide. Une combinaison de fluorochromes utiles et des filtres passe-bande pour NIR imagerie par fluorescence et la séparation des canaux est représenté sur la figure 3. La lumière émise est détectée avec une caméra CCD rétro-éclairé, avec un rendement quantique élevé dans le spectre proche infrarouge. Le balayage OPT est automatisé à l&#39;aide d&#39;une plate-forme LabVIEW qui contrôle la caméra et moteur pas à pas. Pour soutenir les échantillons de la taille de pancréas de rat intact, un miroir d&#39;argent revêtu protégé et une cuvette large est utilisé. Enfin, un porte-échantillon qui élimine les indésirables movemen verticalests de l&#39;échantillon pendant le balayage a été conçu.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Méthanol </td><td> Scharlau </td><td> ME03162500 </td><td></td></tr><tr><td> 30% de H 2 O 2 </td><td> Scharlau </td><td> HI01362500 </td><td></td></tr><tr><td> Alcool benzylique </td><td> Scharlau </td><td> AL01611000 </td><td></td></tr><tr><td> Benzyl Benzoate </td><td> Scharlau </td><td> BE01851000 </td><td></td></tr><tr><td> Faible point de fusion d&#39;agarose </td><td> LONZA </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde (PFA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 158127 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5879 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-asma-Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6198 </td><td> L&#39;anticorps primaire </td></tr><tr><td> Lapin anti-CD3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7930 </td><td> L&#39;anticorps primaire </td></tr><tr><td> Guinée Pig anti-Ins </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td> L&#39;anticorps primaire </td></tr><tr><td> Âne anti-GP IRDye680 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32421 </td><td> Anticorps secondaire </td></tr><tr><td> De chèvre anti-Rb DyeLight750 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 35570 </td><td> Anticorps secondaire </td></tr><tr><td> De chèvre anti-GP Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11076 </td><td> Anticorps secondaire </td></tr><tr><td> De chèvre anti-GP Alexa488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11008 </td><td> Anticorps secondaire </td></tr><tr><td> Chèvre antiGP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11012 </td><td> Anticorps secondaire </td></tr><tr><td> De chèvre anti-GP Alexa680 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21076 </td><td> Anticorps secondaire </td></tr><tr><td> De chèvre anti-GP Alexa750 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21039 </td><td> Anticorps secondaire </td></tr><tr><td> OPT Skyscan 3001 </td><td> Bioptonics </td><td></td><td> OPT-Scanner </td></tr><tr><td> Leica MZ FLIII </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Stéréomicroscope </td></tr><tr><td> Objectif 0.5x Leica </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10446157 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Camera adaptateur 1.0x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10445930 </td><td></td></tr><tr><td> EL6000 halogénures métalliques </td><td></td><td> 11504115 </td><td> Lightsource </td></tr><tr><td> Guide Liquid Light </td&gt; <td></td><td> 11504116 </td><td></td></tr><tr><td> Cuvette </td><td> Hellma Analytics </td><td> 6030-OG </td><td> 55 x 55 x 52,5 mm </td></tr><tr><td> Miroir </td><td> Edmund Optics </td><td> F68-334 </td><td> 50 x 50 mm </td></tr><tr><td> Andor Ikon-M </td><td> Andor Technology </td><td> DU934N-BV </td><td> CCD rétro-éclairé </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Technologie Chroma </td><td> 41021-MZFLIII </td><td> TXR, Alexa-594, Cy3 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Technologie Chroma </td><td> 41022-MZFLIII </td><td> IRDye680, Alexa-680 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Technologie Chroma </td><td> 49037-MZFLIII </td><td> Dylight750, Alexa-750 </td></tr><tr><td> ProteinG-Sepharose perles </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0618-01 </td><td> Protéine G Sepharose 4 Fast Flow </td></tr><tr><td> D&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08591 </td><td> L&#39;azoture de sodium solution 0,1 M </td></tr></tbody></table>

près de tomographie optique de projection infrarouge pour l&#39;évaluation de la distribution de masse β-cellulaire en recherche sur le diabète

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

En adaptant OPT pour inclure la capacité de formation d&#39;image dans le proche infrarouge (NIR) du spectre, on illustre ici la possibilité d&#39;organes d&#39;image agrandie de tissu pancréatique, tels que le pancréas de rat, et à augmenter le nombre de canaux (types cellulaires) qui peut être étudiée dans un échantillon unique. En outre, nous décrivons la mise en œuvre d&#39;un certain nombre d&#39;outils informatiques qui fournissent: positionnement 1 / précision (dans notre cas, le pancréas) un spécimen du centre de masse (COM) à l&#39;axe de rotation (AR) 2; 2 algorithmes / améliorées pour poste -alignement de réglage qui empêche les distorsions géométriques lors de la reconstruction tomographique 2 et 3 / un protocole d&#39;égalisation pour augmenter l&#39;intensité de rapports signal sur bruit dans des déterminations fondées sur BCM OPT 3. En outre, nous décrivons un porte-échantillon qui minimise le risque pour les mouvements involontaires de l&#39;échantillon lors de l&#39;acquisition. Ensemble, ces protocoles permettent l&#39;évaluation de la distribution BCM et OTHcaractéristiques euh, à effectuer tout le volume du pancréas intact ou d&#39;autres organes (par exemple, dans les études sur la transplantation d&#39;îlots), avec une résolution allant jusqu&#39;au niveau des îlots de Langerhans. individuels

Dans le présent rapport, nous décrivons un protocole pour l&#39;extraction et le traitement informatique des données BCM dans les pancréas (rongeurs et d&#39;autres tissus) à l&#39;aide NIR-OPT (Figure 1). Comme l&#39;illustre la figure 2, autofluorescense tissu de spécimen du pancréas est comme prévu nettement diminué dans le spectre NIR. Cela conduit à une augmentation significative de la moyenne du signal à bruit (S: N) pour l&#39;évaluation de l&#39;insuline des îlots de Langerhans marqués. Par les adaptations de l&#39;OPT à l&#39;imagerie dans la partie proche infrarouge du spectre, comme décrit ici, au moins trois canaux spécifiques peuvent être visualisées avec suffisamment S: rapport N pour permettre l&#39;évaluation des types d&#39;anticorps cellulaires marqués dans tout le volume du pancréas de souris avec distinct séparation des canaux (voir Figure 3 et 4). Appliquée à l&#39;imagerie des processus diabétogène et / ou évaluations BCM en général, la technique permet donc la visualisation et la quantification desdomaines d&#39;insuline positifs par rapport à environnant et / ou d&#39;interagir types de cellules (voir figure 4). De telles évaluations sont grâce à la profondeur de pénétration tissulaire accrue obtenue dans le proche infrarouge possible d&#39;effectuer des spécimens beaucoup plus grandes que par le passé, y compris le pancréas de rat, qui est 3-5 fois plus grand que son homologue de la souris (voir figure 5). Indépendamment du fait que des longueurs d&#39;onde visibles ou NIR sont utilisés, la mise en œuvre de CLAHE peut faciliter considérablement OPT évaluations fondées sur des BCM au cours des différentes conditions génétiques et physiologiques en augmentant la sensibilité de détection de la technique (voir Figure 6). Un plan pour le porte-échantillon est développé montre la figure 7. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Organigramme illustrant les étapes essentielles pour OPT analyses basées sur des BCM dans le murine du pancréas. Le temps nécessaire pour évaluer un pancréas de souris typique est 13-14 jours. La majorité du temps est consommé pendant le traitement des tissus et la coloration immunohistochimique (10 jours), la compensation des tissus nécessite environ 2 jours, alors que la longueur de la numérisation dépend du temps d&#39;exposition nécessaire (normalement environ 1 heure). Le traitement ultérieur calcul s&#39;effectue en général dans une journée. Notez que le protocole de coloration relativement long est idéal pour le traitement par lots de plus grandes quantités de spécimens. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" /> Figure 2. Rapport signal sur bruit pour les évaluations de la BCM à différentes longueurs d&#39;onde. Un lobe du pancréas de souris duodénal, colorées pour l&#39;insuline et d&#39;un cocktail d&#39;anticorps conjugués au fluorochrome secondaire (Alexa 488, 594, 680 et750), a été utilisée pour déterminer S: N élevés à différentes longueurs d&#39;onde. Les images montrent le châssis, première projection pour chaque canal de signal. B, graphique illustrant la moyenne S: N pour chaque canal de signal. Les rapports ont été déterminés comme l&#39;intensité moyenne des îlots (sur la base de 215 îlots), divisée par l&#39;intensité de fond (la fluorescence tissu endogène à partir du tissu exocrine). C, S Graphique montrant: N élevés pour les îlots individuels dans chaque canal normalisé à l&#39;indice composé S: S obtenus pour le canal Alexa 594. Une analyse de la variance manière a été utilisé pour les analyses statistiques. Les seuils de signification indiqués correspondent à ** p &lt;0,01. La barre d&#39;échelle en (A) correspond à 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg"/> Figure3. Séparation des canaux. A, anticorps secondaires conjugués avec des colorants AlexaFluor répertoriés dans le tableau ont été immobilisés séparément sur ​​proteinG-sépharose perles. B, les billes fluorescentes ont été ensuite incorporé à différents niveaux dans un fantôme d&#39;agarose et imagé en utilisant des filtres indiqués. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="Figure 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg"/> Figure 4. OPT imagerie multicanal basé en recherche sur le diabète. A, OPT base iso-surface reconstruction d&#39;un pancréas (12 semaines, le lobe duodénal) du diabétique non obèse (NOD) modèle de diabète de type 1. Le spécimen est coloré d&#39;insuline (îlots β-cellules, pseudo couleur bleue); muscle lisse α-actine (vaisseaux sanguins, rouge) et CD3 (infiltration de lymphocytes T, vert). Les anticorps secondaires correspondants étaient utilisés; Cy3, IRDye-680 et DyeLight-750 respectivement. Laencarts (A&#39;-A &#39;&#39;&#39;) montrent les canaux de signaux individuels. B, image OPT (blow up vue) d&#39;un lobe de foie de souris (lateralis lobe sinistres) greffé avec des îlots syngéniques et imagé avec NIR-OPT deux semaines suivant la transplantation. Les îlots d&#39;insuline exprimant pseuodocolored sont en bleu et le muscle lisse α-actine vaisseaux positifs sont en rouge. Cette approche permet l&#39;évaluation de la distribution de greffe d&#39;îlots au sein du réseau vasculaire. Barres d&#39;échelle correspond à 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="Figure 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" /> Figure 5. NIR-OPT facilite la visualisation des grands spécimens. A, Iso-surface de rendu de la distribution BCM dans un pancréas de rat à partir du modèle Zucker gras diabète de type 2 (lobe splénique à 9 mois), ce qui illustre la possibilité de spécimen image sur le rat l&#39;échelle du pancréas par NIR-OPT. Tel que déterminépar cette technique, le lobe est affiché ~ 6 fois plus grande (v / v) que son homologue de souris et abrite 10139 insuline des îlots de Langerhans exprimant dont β-cellule de volume représente 1,32% du volume total lobulaire. B, coupe tomographique correspondant à la ligne en pointillés dans (A) ce qui montre que tous les îlots de fond du tissu est détectée. C, Iso-surface de rendu de la distribution BCM dans un pancréas de souris (lobe splénique à 8 semaines) s&#39;affiche comme une référence de taille. Le lobe affiché abrite 2490 îlots d&#39;insuline exprimant dont β-cellule de volume représente 0,89% du volume total lobulaire. Le pancréas sont colorées avec GP anti-insuline suivie par Alexa594 conjugué anticorps de chèvre anti-GP (souris) et 680 IRDye âne conjugué anti-GP (rat) anticorps respectivement. Les spécimens (AC) sont représentés à l&#39;échelle et la barre d&#39;échelle en (C) correspond à 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="Figure 6" fo:contenu-width = &quot;5po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg&quot; /&gt; Figure 6. CLAHE facilite la détection d&#39;îlots dans le pancréas de souris par imagerie OPT. AC, Représentant iso-surface des images OPT rendus d&#39;un C57Bl / 6 pancréas de souris (lobe splénique à 8 semaines) marqué à l&#39;insuline. Iso-surface reconstructions d&#39;images OPT ont été réalisées avant (A, vert pseudo couleur) et après le protocole a été appliqué CLAHE (B, pseudo couleur rouge). C, superposition des données non normalisées dans (A) et les données traitées en CLAHE (B). C&#39;-C &quot;, Représentant superposition fort grossissement des non-normalisés (A) et CLAHE transformés (B) images. Comme l&#39;a montré la présence de&quot; rouge &quot;îlots seulement, le script CLAHE facilite la détection du signal de petite et basse îlots d&#39;intensité. Dans l&#39;exemple actuel le spécimen représenté (après traitement CLAHE) abritait 2419 îlots avec un volume de 1,74 mm 3 (Les chiffres sont fondés sur les données correspondantes de projection non transformés a 1057 îlots wie un volume de 1,77 mm 3). D et E, Exemple de données de commande (D) et le modèle de la souris ob / ob diabète de type 2 12 (E) à 6 mois de mise en œuvre du protocole CLAHE. Notez l&#39;augmentation massive générale de la taille des îlots dans le pancréas ob / ob (E). Dans (D) et (E) le contour du pancréas (gris) est basée sur le signal d&#39;autofluorescence de tissu. La barre d&#39;échelle en C est de 500 um en AC. La barre d&#39;échelle en C »correspond à 200 um C &#39;et C&#39;&#39;. Barre d&#39;échelle en E correspond à 1 mm (D) et (E). Images à (AC) sont adaptés de Hörnblad et al 3 et ont été générées à l&#39;aide de la 3001 Bioptonics scanner. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="Figure 7" /> Figure 7. Porte-échantillons pour la fixation d&#39;échantillons OPT. L&#39;échantillon est fixé par l&#39;insertion d&#39;aiguilles à travers l&#39;entretoise d&#39;agarose par des trous pré-percés dans les brides. Le support est articulé sur le moteur pas à pas par l&#39;intermédiaire d&#39;unpuissant aimant situé à sa base. Cette configuration omet l&#39;utilisation de colles instables et empêche les mouvements indésirables de l&#39;échantillon pendant le balayage.

Nous décrivons l&#39;adaptation de la tomographie optique de projection (OPT)<sup&gt; 1</sup&gt; À l&#39;imagerie dans le proche infrarouge, et la mise en œuvre d&#39;un certain nombre d&#39;outils informatiques. Ces protocoles permettent l&#39;évaluation des β du pancréas masse des cellules (BCM) chez les grands spécimens, d&#39;augmenter la capacité de la technique multicanal et augmenter la qualité des données OPT.

Près de tomographie optique de projection infrarouge pour l&#39;évaluation de la distribution de masse β-cellulaire en recherche sur le diabète

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer des évaluations par tomographie par projection optique de la distribution de la masse des cellules bêta chez les rongeurs, dans le pancréas ou dans les tissus contenant des greffons d'îlots. Le spectre proche infrarouge est ainsi utilisé pour permettre l'étude de spécimens plus volumineux et de visualiser simultanément des types cellulaires interagissant ou adjacents. Ceci est rendu possible grâce à un équipement, le scanner OPT, muni d'une caméra sensible au proche infrarouge, d'une source lumineuse puissante et de jeux de filtres appropriés.L'échantillon est d'abord isolé, fixé et soumis à une immunomarquage hormonal avant d'être inclus dans de l'aros et rendu transparent sur le plan optique. Il est ensuite fixé sur un support d'échantillon sur mesure. Un outil de positionnement semi-automatisé est utilisé pour garantir un centrage correct dans le scanner après la numérisation.Les images projetées sont post-traitées pour corriger les artefacts introduits par le dispositif mécanique, si nécessaire. Un algorithme d'égalisation est utilisé pour améliorer la détection des objets de faible intensité. Enfin, la segmentation, la visualisation et la quantification sont réalisées à l'aide d'un logiciel de traitement d'images.Les cellules bêta productrices d'insuline jouent un rôle central dans le maintien de l'homéostasie du glucose sanguin. Par conséquent, les évaluations spatiales et quantitatives de la distribution de la masse des cellules bêta pancréatiques sont essentielles à de nombreux domaines de la recherche sur le diabète. Dans ce protocole vidéo, nous décrivons une adaptation de la tomographie par réaction optique, ou OPT, qui permet l'imagerie dans le proche infrarouge et, par conséquent, la possibilité d'observer des échantillons plus volumineux de tissu pancréatique.Il permet également d'étudier une plus grande variété de types cellulaires sur un seul spécimen. Nous présentons en outre une compilation d'outils informatiques développés et optimisés pour l’OPT destinée à l'imagerie du pancréas en général, ainsi qu'à l'évaluation de la masse des cellules B. En particulier, le spectre proche infrarouge constitue la fenêtre la plus favorable à la pénétration de la lumière dans le tissu.Pour accéder à cette partie du spectre dans l'imagerie OPT, plusieurs modifications ont été apportées au scanner OPT d'origine décrit par Sharpen et ses collègues pour l'évaluation unique de la masse des cellules bêta. Chez le pancréas de souris, nous utilisons couramment le scanner Omic 3001. La lumière d'excitation est fournie par une lampe métal halogénure qui délivre une énergie d'excitation plus élevée qu'une lampe à arc au mercure à des longueurs d'onde d'environ 650 nanomètres.La lumière est transférée à travers un guide de lumière liquide avant de traverser les filtres d'excitation. Les filtres utilisés dans ce protocole sont indiqués dans ce tableau afin d'évaluer la séparation des canaux des anticorps. Des anticorps conjugués à différentes fluorochromes Alexa ont été immobilisés sur des billes protéiques et intégrés dans des plans distincts d'un fantôme en agarose.Les images montrent qu'il n'y a pas de recouvrement entre les différents canaux. La lumière émise est détectée à l'aide d'une caméra CCD à éclairement arrière, possédant une efficacité quantique élevée dans le spectre proche infrarouge. Pour faciliter l'imagerie d'échantillons plus grands, le champ de vision est agrandi en intégrant un miroir réflecteur plus grand et un vete dans le scanner.Le dispositif situé au-dessus du vete est le moteur pas à pas qui fait tourner l'échantillon pendant le balayage. Un programme basé sur LabU contrôle la caméra et le moteur pas à pas pendant le balayage. Prélève le pancréas dans du PBS froid sur glace pour éviter la dégradation protéolytique. Retire soigneusement les tissus adipeux et les membranes environnants qui pourraient sinon interférer avec la coloration et la procédure de balayage.Fixez l'échantillon dans du PFA à 4 % à quatre degrés Celsius pendant deux à trois heures. Pour éviter de stabiliser le pancréas dans une forme repliée, rincez-le dans une boîte de Pétri pendant la fixation, avant la coloration immuno-histochimique en montage entier, puis lavez le pancréas abondamment dans du PBS. La procédure de coloration a déjà été décrite précédemment pour l'évaluation de la distribution de la masse des cellules bêta.Nous utilisons couramment une combinaison d'anticorps primaires dirigés contre l'insuline provenant de rein de porc et d'anticorps secondaires conjugués à la fluorochrome Alexa Fluor pour la coloration. Séparer les trois lobes pancréatiques principaux. Cela facilite l'évaluation comparative des lobes et permet un balayage à un grossissement plus élevé.Rincez le pancréas à l'eau et faites-le tremper dans de l'agarose. Pour éliminer les bulles éventuelles. Incorporez le pancréas dans de l'agarose à 1,5 % à bas point de fusion et laissez reposer jusqu'à ce que le milieu soit stabilisé.Couper l'agarose en bloquant, en fermant le pancréas. Veillez à laisser un espace d'environ un centimètre entre l'échantillon et la base de l'agarose. Cet espace est nécessaire pour fixer l'échantillon dans le porte-échantillon.Déshydrater le pancréas dans du méthanol à cent pour cent avant la clarification optique dans une solution de clarification B, également connue sous le nom de Maurice.Clear. Clarifier l'échantillon jusqu'à ce qu'il devienne transparent. Étant donné que le B isol la plupart des plastiques, un flacon en verre est recommandé.Changez la solution B plusieurs fois pour éliminer toutes les traces de méthanol. L'échantillon est maintenant prêt pour l'analyse. Pendant l'analyse, l'échantillon est déplacé par un aimant fixé à un pas à pas.Cela permet le glissement de l'échantillon le long de son axe X et de l'axe de réglage, ce qui facilite l'alignement préalable au balayage. Dans la plupart des protocoles OPT, le bloc RO est collé sur le porte-échantillon, mais la plupart des colles dissolvent l'ampoule, ce qui peut entraîner des déplacements indésirables de l'échantillon. Un porte-échantillon évitant l'utilisation de colle a donc été conçu.Positionnez l'échantillon transparent dans le porte-échantillon et fixez-le en insérant délicatement deux aiguilles guidées par les trous pré-percés dans les brides du support. Placez l'échantillon dans le scanner et immergez-le dans la solution BAB. On voit ici l'interface utilisateur d'un logiciel basé sur LabVIEW, utilisé pour régler le temps d'exposition de la caméra, le pas du moteur pas à pas, et pour saisir les paramètres expérimentaux dans les paramètres du fichier journal, tels que le grossissement.Les réglages focaux et le changement des jeux de filtres sont effectués manuellement sur le microscope. Arrêtez en sélectionnant le grossissement. Illuminez l'échantillon à l'aide du filtre GFP et affichez une image préliminaire à l'aide du logiciel prévu à cet effet.Effectuez une rotation de l'échantillon afin de trouver sa partie la plus large. Remarquez que lors de la comparaison d'une série de pancréas, il faut utiliser le même grossissement pour tous les échantillons. Ce facteur est défini d'après l'échantillon le plus grand de la série. Ensuite, passez au jeu de filtres qui affiche le signal spécifique et ajustez la mise au point.Remarque : le temps d'exposition doit être choisi de manière à obtenir le rapport signal sur bruit le plus élevé possible sans saturer aucune partie de l'échantillon. Pour l'évaluation de la masse des cellules bêta pancréatiques, l'échantillon entier constitue normalement la région d'intérêt ; par conséquent, le centre de masse de l'échantillon (com) doit être positionné avec précision sur son axe de rotation afin d'obtenir des résultats optimaux. L'algorithme commar calcule le centre de masse de l'échantillon et fournit une image de référence qui facilite l'alignement du centre de masse sur l'axe de rotation.Pour calculer les coordonnées X, commencez par acquérir une image du canal GFP à zéro degré. Ensuite, changez de filtre et acquérez une image du signal spécifique à la même position. Appliquez ensuite un algorithme d'espérance-maximisation sur l'image GFP afin de seuiller la région d'intérêt, appliquez un calcul du centre de masse sur l'image seuillée, puis superposez une ligne verticale passant par le point du centre de masse trouvé sur l'image du signal spécifique.Ces étapes sont répétées pour l'échantillon tourné de 90 degrés afin de calculer les coordonnées Z. Enfin, les images acquises, délimitant les points du centre de masse, sont utilisées comme référence pour déplacer l'échantillon de sorte que la ligne médiane du champ de vision passe par les points du centre de masse trouvés de l'échantillon. Lorsque le balayage est terminé, une valeur de post-alignement est attribuée aux projections afin d'ajuster finement la position des images le long de l'axe de rotation avant la reconstruction.Cependant, une légère aberration de l'angle de la caméra par rapport à l'axe optique peut provoquer des distorsions géométriques lors de la reconstruction. Pour éviter de telles distorsions, un alignement discret basé sur une transformation libre, appelé FDA, est utilisé après l'analyse d'un échantillon. Deux projections sont extraites du jeu de données afin de calculer le FDA.Ces projections sont F, le signal spécifique à zéro degré, et G, le signal spécifique à 180 degrés. L'image D est transposée afin de correspondre à l'orientation de F. La fonction DFT est utilisée pour enregistrer des blocs de huit pixels de hauteur à travers l'image à partir des deux projections, et mesurer les décalages le long de l'axe X afin de calculer l'angle de rotation nécessaire, puis réutiliser les mêmes paramètres pour corriger tous les canaux acquis par le même balayage. Des informations supplémentaires sur les fondements des algorithmes COMMAR et FTA sont disponibles dans AL afin de faciliter la segmentation iLet.Une méthode d'égalisation adaptative d'histogramme à limite de contraste est appliquée sur les images de projection. Dans ce protocole, la fonction intégrée de MATLAB « adapt hiss egg » a été utilisée avec une limite de recadrage par défaut de 0,01 et un nombre de niveaux de 256. La taille de tuile optimale, toutefois, doit être testée empiriquement et peut varier selon l'échantillon analysé. Des informations plus détaillées sur l'algorithme ainsi que des exemples sont disponibles dans Home Blood et Shadow.À l'étape suivante. Les données alignées, compensées et normalisées peuvent désormais être reconstruites en sections tomographiques. Pour visualiser et quantifier la pile de sections virtuelles obtenue, générez des surfaces ISO 3D à l'aide d'un logiciel de traitement d'images approprié, tel que S ou velocity.Cette figure montre une vue de projection d'un lobe pancréatique coloré pour l'insuline à l'aide d'un cocktail d'anticorps secondaires conjugués à des fluorochromes, incluant Alexa Fluor 4 88, 5 94, 6 80 et sept 50. Le rapport signal sur bruit augmente considérablement lorsque l'on se déplace vers la partie proche infrarouge du spectre. Cela est davantage illustré dans ce graphique, qui présente le rapport moyen signal sur bruit pour chaque canal de signal en ayant accès à une partie plus large du spectre.L'imagerie en proche infrarouge augmente la gamme de types cellulaires pouvant être analysés dans un seul spécimen. Cette vidéo montre le pancréas du modèle de diabète non obèse, utilisé pour le diabète de type 1. Sur la vidéo, les îlots de Langerhans producteurs d'insuline apparaissent en bleu, les vaisseaux sanguins exprimant l'actine alpha du muscle lisse en rouge, et les lymphocytes T infiltrants marqués par l'anticorps anti-CD3.Le parenchyme vert de théacrine dans la zone grise est reconstruit à partir de l'autofluorescence tissulaire endogène en tirant parti de la pénétration accrue dans les tissus dans le domaine proche infrarouge. L'imagerie O PT permet d'évaluer la distribution de la masse des cellules bêta dans des échantillons beaucoup plus grands que ce qui était possible auparavant. Cette figure montre la reconstruction en surface ISO de la distribution des îlots dans le lobe splénique d'un rat obèse SER marqué pour l'insuline à l'aide d'ER erdi six 80 comme anticorps secondaire.Un globe splénique de souris est montré à titre de référence précis. Ces images correspondent à deux reconstructions différentes d'isosurfaces de la distribution de la masse des cellules bêta dans un globe pancréatique individuel, l'acide apparaissant sans traitement par griffe en vert, et lorsque l'algorithme a été appliqué en rouge. En superposant les deux reconstructions, on démontre que la griffe facilite la segmentation même pour les îlots de faible intensité de signal.Ces éléments apparaissent en rouge uniquement sur l'image superposée. Nous venons de vous montrer comment extraire des informations spatiales et quantitatives sur la masse des cellules bêta à travers tout le volume du pancréas et jusqu'au niveau des îlots individuels de Langerhans. Ces protocoles ne se limitent pas à l'évaluation des cellules bêta ou du pancréas en conditions proches de l'OPT altérée ; les outils informatiques présentés devraient également pouvoir être adaptés à d'autres domaines d'investigation.Bonne chance. Bonne chance dans vos expériences.

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Le protocole suivant décrit le processus de dissection pancréatique pour imagerie en coupes virtuelles, et la quantification ultérieure de tous les GFP-taggés cellules bêta dans le pancréas entier.

Dans la quantification in situ des cellules bêta pancréatiques chez des souris de masse

Méthodes assistées par ordinateur du roman achats à grande échelle et d'analyse des échantillons pancréatiques immunohistochimiquement colorées sont décrites: (1) la capture Slice virtuelle de toute la section, l'analyse de masse (2) de données à grande échelle; (3) la reconstruction de la 2D tranches virtuelles (4); cartographie des îlots 3D, et (5) L'analyse mathématique.

Assistée par ordinateur à grande échelle de visualisation et quantification de la messe des îlots pancréatiques, distribution de taille et d&#39;architecture

Ce protocole permet d'identifier les facteurs qui modulent fonctionnelle masse des cellules bêta de trouver des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du diabète. Le protocole consiste en une méthode simplifiée pour évaluer la réplication des îlots et la fonction des cellules bêta des îlots de Langerhans isolés de rat après la manipulation de l'expression des gènes par des adénovirus.

Les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans Adenovirally transduites isolées

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Ici, nous présentons une méthodologie pour générer et administrer un composé de microsphères poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) chargées d’intérêt à des îlots de souris intacts en culture, avec analyse ultérieure par immunofluorescence de la prolifération des cellules β. Cette méthode convient pour déterminer l’efficacité des mitogènes β cellules candidates.

Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Utilisation Biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) Microsphères

Îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire régule la distribution de sang îlot et maintient la fonction physiologique des cellules β des îlots. Ce protocole décrit en utilisant un moniteur Doppler laser pour déterminer l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire in vivo et d’évaluer les contributions de la microcirculation des îlots pancréatiques de maladies liées au pancréas.

Laser Doppler : Un outil pour mesurer les îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire In Vivo

Nous présentons ici un passif de protocole aux sections pancréas humain image en trois dimensions (3D) à l’aide en optimisé méthodes de compensation. Ce manuscrit montre ces procédures de compensation optique passive, suivie par plusieurs immunofluorescence souillant pour identifier les éléments clés des réseaux neurones autonomes et sensitifs innervant les îlots humains.

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Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.

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Dans ce protocole, les îlots pancréatiques sont reconstruits et analysés à l’aide d’algorithmes de calcul implémentés dans une application multiplateforme dédiée.

Reconstruction computationnelle des îlots pancréatiques comme outil d’analyse structurelle et fonctionnelle

Nous détaillons un nouveau proche infrarouge fluorescence (NIRF) cathéter pour deux dimensions d'imagerie moléculaire de la biologie de plaque...

In vivo par fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF) intravasculaire d&#39;imagerie moléculaire de la plaque inflammatoire, une approche multimodale d&#39;imagerie de l&#39;athérosclérose

Découvrez la tomographie optique de projection infrarouge pour évaluer la masse de cellules bêta pancréatiques. Cette méthode computationnelle améliore l'imagerie multicanal et la qualité des données pour la recherche sur le diabète.

Près de tomographie optique de projection infrarouge pour lévaluation de la distribution de masse β-cellulaire en recherche sur le diabète (Vidéo) | JoVE Journal

Près de tomographie optique de projection infrarouge pour l'évaluation de la distribution de masse β-cellulaire en recherche sur le diabète

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