Name: Perto Tomografia Projeção óptico infravermelho para avaliações de β-célula distribuição em massa em Pesquisa do Diabetes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 18 s
Description: Aprenda a adaptar a tomografia de projeção óptica no infravermelho próximo para avaliar a distribuição da massa de β-células pancreáticas em pesquisas sobre diabetes.

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Lindström Dr. P. é reconhecida por fornecer ob / ob. J. Lehtonen é reconhecido para a assistência com produção de vídeo e Gilbert J. ajuda com edição. Este estudo foi financiado por doações do Instituto de Pesquisa de Diabetes Foundation (AP), o Juvenile Diabetes Research Foundation (AP e UA), a Comissão Europeia (FP-7, Grant acordo não:. IP CP-228933-2) (JS e UA), as Fundações Kempe, Umeå University e do Conselho Sueco de Pesquisa para UA

1. Preparação de amostras e Digitalização 1,1 Preparação da amostra O procedimento seguinte é realizado essencialmente como descrito anteriormente 7. <ol><li> Colher o pâncreas. Use PBS gelado para evitar a degradação proteolítica. </li><li> Fixar o tecido em PFA a 4% em PBS em gelo durante 2-3 horas. Verifique se os lobos estão &quot;se espalhar&quot; durante a fixação. Isso irá facilitar a identificação de pontos anatômicos após a reconstrução. </li><li> Lavar com PBS em excesso durante 30 min. </li><li> Desidratar o pâncreas stepwise em metanol (33, 66%, 100%), 15 min / passo. Isto minimiza a formação de bolhas durante o branqueamento (ver passo 5) e impede a destruição das células durante a congelação-descongelação (ver passo 7). </li><li> Incubar o tecido em MeOH recentemente preparada: H 2 O 2: DMSO branqueamento tampão numa proporção de 02:01:03, à RT durante 24 h, para extinguir a fluorescência tecido endógeno. Para maiores amostras de troca, a nova bleachitampão ng e incubar durante uma outra hora 24. </li><li> Lavar com MeOH em excesso, ON. </li><li> Congelamento-descongelamento durante pelo menos 5 ciclos de -80 ° C - temperatura ambiente para facilitar a penetração dos anticorpos. </li><li> Reidratar stepwise volta para TBST (33, 66%, 100%), 15 min / passo. </li><li> Bloco em TBST com soro a 10% (de preferência com a mesma espécie na qual o anticorpo secundário foi gerado), DMSO a 5% e 0,01% Naaz durante 12-24 horas à temperatura ambiente </li><li> Incubar com anticorpo primário em tampão de bloqueio durante 48 h, à RT, estender a 72 horas para as amostras maiores (anticorpos usados ​​aqui são listados na tabela de reagentes). </li><li> Lavar em TBST excesso, ON. </li><li> Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluorescência durante 48 h, à RT, estender a 72 horas para as amostras maiores. </li><li> Lavar em TBST excesso, ON. </li></ol> 1,2 O procedimento a seguir descreve como montar a amostra em agarose e anexá-lo ao suporte de amostras feitos (ver Figura 7) Antes de optar digitalização. <ol><li> Separa-se os lóbulos do baço, gástrica e duodenal, de acordo com a Figura 3A em Hörnblad et al 3. A relação entre os lóbulos é clarificado em Hörnblad et al 11. </li><li> Prepare a 1,5% (w / v) de agarose de temperatura de fusão baixo em dH 2 O, filtro, deixar arrefecer até 37 ° C e lavar o tecido em dH 2 O, para lavar o detergente e remover as bolhas antes agarose-incorporação em gelo. </li><li> Cortar um bloco de agarose encerrando a sua amostra e deixar um espaçador de 1 cm ~ entre a amostra e a base da agarose. Aparar arestas vivas (≤ 90 °) do bloco de agarose para reduzir a dispersão da luz. </li><li> Desidratar a amostra por passos em MeOH (33, 66%, 100%), dando tempo para equilibrar entre cada passo. Quando a amostra se afunda é considerado para ser equilibrada. </li><li> Limpar a amostra em uma solução 1:2 de álcool benzílico: Benzyl Benzoato de metila (BABB) até que se torne transparente. Troca BABB solução e incubar durante uma hora adicional 12. </li><li> Posicionar a amostra limpa no suporte de amostras e fixá-lo através da inserção de 2 agulhas através do espaçador de agarose através dos orifícios perfurados na flange do suporte. </li><li> Coloque a amostra no scanner e mergulhe-o em uma tina cheia de BABB solução de compensação. Quando se comparam uma série de pâncreas a mesma ampliação deve ser usada para todas as análises. A ampliação deve ser optimizado para o maior amostra na série. </li></ol> 1,3 Posicionamento da amostra no AR O protocolo seguinte descreve o procedimento para posicionar com precisão uma amostra usando o algoritmo de COM-AR. Este procedimento só é aplicável quando o ROI inclui toda a amostra. Para descrições detalhadas dos algoritmos, consulte Cheddad et al 2. <ol><li> Aquisição de imagens da amostra em duas posições para both a anatomia e canais de sinalização. Posição 1 a 0 ° C (associado com o eixo X), apresentando a maior área de projecção, e a posição 2 a 90 ° (associadas com o eixo Z). Estamos usando o canal GFP para visualizar a anatomia. </li><li> Aplicar o algoritmo de Maximização da Expectação (EM) nas imagens de limiar anatomia do ROI. </li><li> Calcular os pontos de COM (coordenadas x) das imagens binárias obtidas no passo 2 para ambos os 0 ° e 90 ° projecções. </li><li> Sobrepor uma linha vertical que passa pelo ponto COM identificado calculado no passo 3 no ° 0 e 90 ° imagens do canal de sinal. </li><li> Utilizar as imagens obtidas no passo 4, como referências para mover a amostra de forma que a linha de centro do campo de visão passa pelos pontos COM encontrados da amostra. </li></ol> 1,4 Digitalização <ol><li> Ajuste o tempo de exposição para atingir o maior relação sinal-ruído possível sem saturaçãoting todas as áreas das imagens de projeção. Repita o procedimento para todos os canais a serem verificados. </li><li> Selecione o conjunto de filtro para o primeiro canal de fluorescência a ser digitalizada. Emissão de fluoróforos mais curtos λ pode excitar fluoróforos com mais λ e, assim, causar foto branqueamento. Para minimizar esta possibilidade, a varredura do fluoróforo com λ maior excitação primeiro. </li><li> Abrir o obturador para iluminar a amostra e recolher o sinal de fluorescência ao longo de 360 ​​°, rotação da amostra ao longo do eixo vertical de cada canal. O ângulo de passo utilizado para a configuração de NIR-OPT é de 0,9 ° C e durante o digitalizador Bioptonics 3001 0,45 °. </li><li> Selecione o filtro apropriado para o canal seguinte e proceda como acima. </li></ol> 2. Processamento Computacional e Reconstrução 2,1 detecção desalinhamento pós-aquisição e correção (Um valor-tuning) Na tomografia de projecção, é, em geral, necessárioatribuir um valor pós-alinhamento com as projeções para afinar a imagens posição ao longo do eixo de rotação antes da reconstrução. No entanto, um pequeno desvio no ângulo da câmara na direcção do eixo óptico pode causar não-uniforme de valores ao longo do comprimento da amostra e, assim, induzir distorções geométricas. Para evitar estas distorções, um método computacional para determinar o exato valor e unificada pós-alinhamento (um valor) durante toda a amostra pode ser aplicada 2. <ol><li> Use uma transformada discreta de Fourier para dividir uma projecção do sinal específico a 0 ° e 180 ° em blocos de 8 pixels de altura e calcular o deslocamento ao longo do eixo x (o valor-A) entre cada bloco. </li><li> Aplicar um mínimo de regressão linear quadrados para ajudar a calcular o ângulo θ &quot;, que descreve a inclinação do eixo x-deslocamento ao longo do comprimento da amostra, e para encontrar um ponto central de rotação. </li><li> Corrigir distorções durante a varredura, rodando tudo projeCÇÕES θ &#39;/ 2 em torno do ponto central de rotação. </li></ol> 2,2 Contraste equalização de histograma limitado adaptativo (CLAHE) Para facilitar a detecção e a segmentação de objectos (ilhéus) que exibem sinais muito fracos, os quais se encontram em risco de ser &quot;limiarizadas para fora&quot; durante a reconstrução e / ou a segmentação para avaliações quantitativas, de um algoritmo de CLAHE pode ser aplicado a imagens de projecção. A operação é realizada com CLAHE duas transformações intensidade principais: <ol><li> O contraste local é estimada e empatou dentro não sobrepostos blocos na imagem de projeção. </li><li> As intensidades são normalizados nas regiões fronteiriças entre blocos através da interpolação bilinear. </li></ol> O nome de contraste limitada refere-se ao limite de grampo, o qual é configurado para evitar saturação pixels na imagem. Neste protocolo, o MATLAB função interna &quot;adapthisteq&quot; foi usado e aplicado com o padrão c<html> limite de lábio de 0,01 e um tamanho de telha 256. Note, o tamanho da telha óptima deve ser testada empiricamente e pode variar de acordo com a amostra analisada. Mais detalhes sobre o algoritmo e os exemplos podem ser encontrados em Hörnblad et al 3. Nota: As etapas de processamento acima listados computacionais (incluindo-COM AR, ajustando um valor e CLAHE, consulte 1,3-2,2) são construídas sobre algoritmos padrão e são executadas no MATLAB (Mathworks). 2,3 reconstrução tomográfica e iso-superfície renderização <ol><li> Usando um algoritmo de filtrado de volta projeção, as imagens corrigidas e normalizados pode agora ser reconstruído com compensação de desalinhamento unificada e exigência mínima para a otimização de faixa dinâmica. Neste protocolo, todas as reconstruções são realizadas usando o método de projeção filtrada de volta disponível no software NRecon (SkyScan), versão 1.6.8 (= &quot;_blank&quot;&gt; Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Nota, a ampliação de um objecto com imagens depende da sua distância a partir do ponto focal da lente, a menos que a geometria de feixe paralelo é implementado na configuração de imagem. Portanto, quando a importação de um conjunto de dados de projeção para o software NRecon é importante incluir o objeto correto a distância da fonte (mm) e direção de rotação do scanner (para anti-horário de entrada &quot;cc&quot; e para a entrada no sentido horário &quot;cw&quot;) no acompanhamento arquivo de log, para evitar artefatos de feixe cônico induzidas durante a reconstrução. </li><li> Para visualizar e quantificar a pilha de seções virtuais obtidos, gerar 3D iso-superfícies utilizando software de processamento de imagem, como adequado ou Imaris Volocity. </li></ol> Isolamento de ilhotas murina e procedimentos de transplante foram realizados em Processamento de Diabetes Research Institute celular pré-clínica e Core Modelo Translational sob protocolos analisados ​​e aprovados pela Universidade de Miami Animal Care Institucional e Comitê de uso. O comitê de ética para pesquisas com animais, norte da Suécia, aprovou todos os outros experimentos envolvendo animais.

<ol><li>Sharpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+Assisted+Algorithms+for+Optical+Projection+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Med.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).</li>
<li>Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+optical+projection+tomography+imaging+reveals+lobular+heterogeneities+in+pancreatic+islet+and+beta-cell+mass+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution.</a> Islets. 3, 204-208 (2011).</li>
<li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+pancreas%3A+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).</li>
<li>Ahlgren, U., Gotthardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+imaging+islets%3A+recent+advances+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+islet-infiltrate+interactions+based+on+optical+projection+tomography+assessments+of+the+intact+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054070(2008).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+Three-Dimensional+Imaging+of+the+Insulitis-Induced+Destruction+of+beta-Cells+in+Murine+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+AMP-activated+protein+kinase+alpha1+and+alpha2+from+mouse+pancreatic+beta+cells+and+RIP2.Cre+neurons+suppresses+insulin+release+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo.</a> Diabetologia. 53, 924-936 (2010).</li>
<li>Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+spleen+formation+perturbs+morphogenesis+of+the+gastric+lobe+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas.</a> PLoS One. 6, e21753(2011).</li>
<li>Lindström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+the+Obese-Hyperglycemic+Mice+%28ob%2Fob+Mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+JOURNAL%22%5BJournal%5D)">The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice).</a> The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54, 133-137 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As técnicas descritas para a imagiologia OPT permite a extracção de parâmetros espaço-quantitativa em todo o volume do pâncreas murino. Devido às limitações na resolução alcançável para este tipo de mesoscópica imagiologia deve notar-se que, tal como para a maioria das modalidades de imagiologia, maior a amostra menor a resolução da (Embora a utilização de uma resolução mais alta CCD deve aumentar a resolução da digitalização OPT) . Assim, para a avaliação dos lóbulos intactos pancreáticas de rato, a técnica actualmente não fornece resolução única célula embora próximo (aproximadamente 15-20 mm) 7. Ainda assim, para a extracção de distribuição BCM no pâncreas de rato os protocolos proporcionam dados que corresponde bem mais do que as obtidas pelo ponto de contagem, por exemplo 3,13 a morfometria Deve notar-se que, embora a execução do protocolo CLAHE permite a detecção de um número significativamente maior ilhotas , estes ilhéus são geralmente menores e não contrite substancialmente para os totais de células β volumes. Os protocolos de imuno-histoquímica envolvidos são relativamente longos (até duas semanas), mas as mãos reais no tempo de preparação da amostra é pequeno e, portanto, a técnica é bem adequado para o estudo de grandes grupos de animais 9. Se o potencial de padrões de distribuição heterogêneas é um foco para a investigação, deve sublinhar-se que os cuidados devem ser tomados nas etapas sobre fixação e montagem para evitar que o tecido pancreático torna-se fixado de maneira desfavorável e um apartamento (&quot;se espalhar&quot; ) montagem do tecido deve ser buscado para facilitar tais avaliações. Uma questão importante no desempenho é que OPT COM a amostra é fixada no eixo de rotação e que não se move, na vertical ou na horizontal, durante o processo de digitalização. Portanto, é essencial ter uma configuração estável mecânico e um sistema que funcione bem para attaching a amostra. Resolvemos este problema através da construção de uma nova montagem (Figura 7). Geometria paralela não era verdade para o nosso NIR-OPT ou scanner Bioptonics 3001, que foi detectado como um deslocamento vertical entre a parte traseira e as posições da frente de objetos periféricos nas imagens gravadas de projeção. Ao ajustar o objeto a distância da fonte no arquivo de log do scanner respectivo (ver 2.3.1) que pode melhorar significativamente a qualidade de nossos dados e corrigir distorções geométricas nas bordas longe das imagens de projeção, que é de particular importância quando avaliar os espécimes maiores. No protocolo atual, nós fornecemos uma sugestão de conjuntos de filtros que permitem a visualização de três diferentes canais específicos e uma &quot;anatomia&quot; do canal nas avaliações de preparações pancreáticas intactos. Obviamente essas configurações pode ser modulada para melhor atender os fluorocromos utilizados para um determinado estudo, embora, como acontece com todas as formas de fluorescênciamicroscopia cento, o risco potencial de sinal de sangramento através deve ser cuidadosamente avaliada. O estudo das ilhotas de insulina marcados com fluorocromos que são excitados acima de 750 nm não foi ainda possível por nós usando a lâmpada de halogeneto de metal de que se utiliza o conjunto. É possível que a câmara com ainda maior eficiência quântica nos comprimentos de onda relevantes, em combinação com fontes de luz alternativas (por exemplo, lasers de diodo) pode aumentar o potencial de NIR-OPT adicional e permitir a imagiologia em comprimentos de onda mais elevados. OPT de imagem é uma técnica altamente versátil para avaliações espaciais e quantitativos da amostra biomédica na escala de milímetros cm. Embora os protocolos aqui apresentados foram desenvolvidos com a finalidade principal do pâncreas / diabetes de pesquisa que deverá ser possível traduzir a pesquisa sobre as outras espécies, tipos de amostras e os marcadores. Pelo potencial de visualizar vários canais distintos em preparações pancreáticas intactas, NIR-OPT imagem fUTRAS tem potencial como uma ferramenta para avaliar a especificidade de absorção de agentes de contraste destinados a avaliação não-invasiva de outras modalidades de imagem, desde que estes agentes de contraste podem ser concebidas para transportar também um fluoróforo detectável por OPT.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Produtoras de insulina β células são a chave para a capacidade do corpo para controlar a homeostase da glicose do sangue. Portanto, a avaliação da distribuição BCM pâncreas são fundamentais para muitas áreas de pesquisa pré-clínica diabetes. Na avaliação dos regimes terapêuticos, por exemplo, o impacto de ablação do gene alvo na diferenciação de células endócrinas ou estudos de etiologia diabetes em modelos de roedores para a doença muitas vezes dependem de tais análises. Tradicionalmente, esses tipos de avaliações basearam-se em demoradas abordagens estereológicas que são difíceis de realizar, devido ao tamanho e constituição anatómica complexa do pâncreas. Abordagens de resolução mais alta de imagem no presente (normalmente óptico), não fornecem a profundidade de penetração suficiente para permitir imagens de pâncreas em roedores. Por outro lado, as abordagens de imagem que não são limitadas pela sua profundidade de penetração (tipicamente nuclear) para proporcionar baixa resolução para resolver a distribuição BCM completo e são dificultadoscom a falta de agentes de contraste adequados 4,5. Tomografia projeção óptica é uma modalidade de imagem 3D que permite que as avaliações de alta resolução de amostras biomédicas na mm a escala de 6 centímetros. Por este meio, a informação sobre a posição espacial e volume do indivíduo expressar a insulina de ilhotas de Langerhans pode ser extraído todo o volume do pâncreas em ratos normais e diabéticos 3,7-10. O objectivo do estudo é o de melhorar ainda mais a capacidade desta técnica para a avaliação do pâncreas β células, a sua distribuição endógena, quando enxertado em outros tecidos, a sua relação com outros componentes do pâncreas (tal como os tipos de células infiltrantes) e em maior preparações de pâncreas do que era possível anteriormente. A tomografia de projeção óptico infravermelho próximo (NIR-OPT) de instalação No protocolos abaixo, um scanner de OPT com base no conjunto original se descrito por Sharpe <em&gt; et al 1, adaptado para imagiologia na gama do infravermelho próximo são descritos e utilizados. Para a avaliação de canal único, do pâncreas do rato (por exemplo, de BCM), a SkyScan 3001 scanner (Bioptonics) pode ser usado. Uma lâmpada de halogeneto de metal, que fornece a energia de excitação mais elevada do que uma lâmpada de arco de mercúrio a comprimentos de onda superiores a 650 nm, fornece a luz de excitação. A luz é transferida através de um guia de luz líquido. Uma combinação útil de fluorocromos e filtros passa banda para NIR fluorescência de imagem e separação de canais são mostrados na Figura 3. A luz emitida é detectada com uma câmara CCD de iluminação traseira, com elevada eficiência quântica no espectro NIR. A digitalização OPT é automatizado utilizando uma plataforma LabView que controla a câmera e motor de passo. Para suportar as amostras no tamanho de pâncreas de ratos intactos, um espelho de prata revestido e protegido numa cuvete grande é usado. Finalmente, um porta-amostras que elimina indesejadas movemen verticaists da amostra durante a análise foi concebida.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Scharlau </td><td> ME03162500 </td><td></td></tr><tr><td> 30% de H 2 O 2 </td><td> Scharlau </td><td> HI01362500 </td><td></td></tr><tr><td> Álcool benzílico </td><td> Scharlau </td><td> AL01611000 </td><td></td></tr><tr><td> Benzoato de benzilo </td><td> Scharlau </td><td> BE01851000 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose de baixo meltingpoint </td><td> LONZA </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído (PFA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 158127 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5879 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X100 </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Rato anti-Asma-Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6198 </td><td> O anticorpo primário </td></tr><tr><td> Coelho anti-CD3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7930 </td><td> O anticorpo primário </td></tr><tr><td> Cobaia anti-Ins </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td> O anticorpo primário </td></tr><tr><td> Donkey anti GP-IRDye680 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32421 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> De cabra anti-Rb DyeLight750 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 35570 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Cabra anti GP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11076 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Anti-cabra GP Alexa488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11008 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Anti cabraGP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11012 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Cabra anti GP-Alexa680 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21076 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> Cabra anti GP-Alexa750 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21039 </td><td> Anticorpo secundário </td></tr><tr><td> OPT SkyScan 3001 </td><td> Bioptonics </td><td></td><td> OPT-Scanner </td></tr><tr><td> Leica MZ FLIII </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Estereomicroscópio </td></tr><tr><td> Leica Objetivo 0.5x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10446157 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Camera adaptador 1.0x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10445930 </td><td></td></tr><tr><td> EL6000 HQI </td><td></td><td> 11504115 </td><td> Lightsource </td></tr><tr><td> Guia Liquid Light </td&gt; <td></td><td> 11504116 </td><td></td></tr><tr><td> Cuveta </td><td> Hellma Analytics </td><td> 6030-OG </td><td> 55 x 55 x 52,5 mm </td></tr><tr><td> Espelho </td><td> Edmund Optics </td><td> F68-334 </td><td> 50 x 50 mm </td></tr><tr><td> Andor Ikon-M </td><td> Andor Tecnologia </td><td> DU934N-BV </td><td> Retro-iluminado CCD </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 41.021-MZFLIII </td><td> TXR, Alexa-594, Cy3 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 41.022-MZFLIII </td><td> IRDye680, Alexa-680 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 49.037-MZFLIII </td><td> Dylight750, Alexa-750 </td></tr><tr><td> ProteinG Sepharose-esferas </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0618-01 </td><td> Protein G Sepharose 4 Fast Flow </td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08591 </td><td> Azida de sódio a 0,1 M solução </td></tr></tbody></table>

perto tomografia projeção óptico infravermelho para avaliações de β-célula distribuição em massa em pesquisa do diabetes

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Ao adaptar OPT para incluir a capacidade de formação de imagens de infravermelho próximo do espectro (NIR), que aqui ilustrar a possibilidade de corpos grandes de imagem de tecido pancreático, tais como o pâncreas de ratos, e para aumentar o número de canais (os tipos de células) que podem ser estudado em um único espécime. Iremos descrever a execução de um número de ferramentas computacionais que fornecem: posicionamento 1 / precisa do centro de um espécime (no nosso caso, o pâncreas) de massa (COM), o eixo de rotação (AR) 2; dois algoritmos / melhoradas para pós Alinhamento de ajuste que impede que as distorções geométricas durante a reconstrução tomográfica 2 e 3 / de um protocolo para aumentar a intensidade de equalização do sinal para relações de ruído nas determinações OPT baseados BCM 3. Além disso, descreve-se um suporte de amostras que minimiza o risco de movimentos involuntários do corpo de prova durante a aquisição de imagem. Juntos, estes protocolos permitem avaliações da distribuição BCM e othfuncionalidades er, a serem realizados em todo o volume do pâncreas ou de outros órgãos intactos (por exemplo, em estudos de transplante de ilhotas), com uma resolução até o nível de ilhotas de Langerhans individuais.

No relatório atual nós descrevemos um protocolo para a extração e processamento computacional de dados BCM em pâncreas de roedores (e outros tecidos) usando NIR-OPT (Figura 1). Como ilustrado na Figura 2, a partir de tecido autofluorescense espécime pancreática é a esperada redução acentuada no espectro NIR. Isto leva a um aumento significativo no sinal de média ao ruído (S: N) razão para a avaliação dos ilhéus de Langerhans de insulina rotuladas. Pelas adaptações de OPT de imagiologia, na parte do espectro NIR, tal como aqui descrito, pelo menos, três canais específicos podem ser visualizados com suficiente S: relação N para permitir a avaliação de tipos de anticorpos rotulados de células ao longo do volume do pâncreas murino com distinto canal de separação (ver a Figura 3 e 4). Aplicado a imagiologia de processos diabetogênicos e / ou avaliações de BCM, em geral, a técnica permite, assim, para a visualização e quantificação deáreas-insulina em relação à envolvente e / ou interagindo tipos de células (ver Figura 4). Estas considerações são, graças ao aumento da profundidade de penetração do tecido obtido na gama NIR possível realizar em amostras muito maiores do que anteriormente, incluindo o pâncreas de rato, que é 3-5 vezes maior do que o seu homólogo de rato (ver Figura 5). Independentemente do facto de comprimentos de onda visíveis ou NIR são utilizadas, a implementação de CLAHE pode facilitar significativamente OPT avaliações baseadas de BCM durante as diferentes condições genéticas e fisiológicas ao aumentar a sensibilidade de detecção da técnica (ver Figura 6). Um modelo para o suporte de amostras desenvolvido é mostrado na Figura 7. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fluxograma que descreve os passos críticos para OPT análises baseadas de BCM na murpâncreas ine. O tempo requerido para avaliar um pâncreas de rato normal é 13-14 dias. A maioria das vezes é consumida durante o processamento de tecidos e imunohistoquímica (10 dias), a limpeza de tecidos requer aproximadamente 2 dias enquanto que a duração do varrimento é dependente do tempo de exposição necessário (normalmente cerca de 1 hora). O processamento subsequente tipicamente computacional é realizada dentro de um dia. Note, o protocolo de coloração relativamente longo é idealmente adequada para o processamento em lotes de grandes quantidades de amostras. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" /> Figura 2. Sinal para relações de ruído para as avaliações de BCM em comprimentos de onda diferentes. Um rato do lobo duodenal do pâncreas, corado para a insulina e com um cocktail de fluorocromo-conjugados de anticorpos secundários (Alexa 488, 594, 680 e750), foi utilizada para determinar S: N proporções em comprimentos de onda diferentes. A Imagens, mostrar o quadro primeira projeção para cada canal de sinal. Gráfico B, que ilustra a média S: N, para cada canal de sinal. As proporções foram determinadas como a intensidade média da ilhota (com base em 215 ilhéus) dividida pela intensidade do fundo (a fluorescência tecido endógeno a partir do tecido exócrino). C, Gráfico mostrando S: proporções de N para os ilhéus individuais em cada um dos canais normalizados para o S: N obtidos para o canal 594 Alexa. Uma maneira ANOVA foi utilizado para análises estatísticas. Os níveis de significância indicados correspondem a ** p &lt;0,01. Barra de escala em (A) corresponde a 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg"/> Figura3. Separação de canais. A, anticorpos secundários conjugados com corantes Alexafluor listados na tabela foram imobilizados separadamente em proteinG-sepharose grânulos. B, As contas fluorescentes foram então embebidas em diferentes níveis de um fantasma de agarose e visualizados utilizando filtros indicados. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg"/> Figura 4. OPT imaging multicanal baseada na pesquisa da diabetes. A, OPT base iso-superfície de reconstrução de um pâncreas (12 semanas, lobo duodenal) do diabético não obeso (NOD) modelo de diabetes do tipo 1. O espécime é corado para a insulina (células islet β, pseudo cor azul); músculo liso α-actina (vasos sanguíneos, vermelho) e CD3 (linfócitos T infiltrantes, verde). Os anticorpos secundários utilizados foram correspondentes; Cy3, IRDye-680-750 e DyeLight respectivamente. Oinserções (A&#39;-A&#39;&#39; &#39;) mostram os canais de sinal individuais. B, OPT imagem (golpe de vista) de um lobo de fígado de rato (lateral lobus sinistros) enxertado com ilhotas singênicos e fotografada com duas semanas NIR-OPT após a transplantação. As ilhotas de insulina estão expressando pseuodocolored em azul e do músculo liso α-actina vasos positivos estão em vermelho. A abordagem permite avaliações da distribuição do enxerto ilhota dentro da rede vascular. Barras de escala correspondem a 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" /> Figura 5. NIR-OPT facilita a criação de imagens de espécimes de maiores dimensões. A, render Iso-superfície da distribuição BCM em pâncreas de rato a partir do modelo Zucker Fatty para a diabetes do tipo 2 (lóbulo esplénica em 9 meses), exemplificando a possibilidade de espécime imagem no rato escala de pâncreas por NIR-OPT. Conforme determinadopor esta técnica é apresentada no lobo ~ 6 vezes maior (v / v) do que o seu homólogo de rato e abriga 10.139 expressando insulina das ilhotas de Langerhans, cuja célula-β volume faz-se 1,32% do volume total lobular. B, secção Tomographic correspondente à linha a tracejado em (A) ilustra que ilhotas de todas as profundidades do tecido são detectados. C, Iso-superfície de processamento da distribuição BCM em pâncreas de rato (lobo esplénica em 8 semanas) exibido como uma referência de tamanho. O lóbulo exibida abriga 2.490 ilhotas de insulina que expressam cujas células β volume faz-se 0,89% do volume total lobular. O pâncreas estão manchadas com o GP anti-insulina seguido de Alexa594 conjugado de cabra anti-GP (mouse) e Donkey IRDye 680 conjugado anti-GP (rato) anticorpos respectivamente. Os espécimes em (AC) são representadas à escala e a barra de escala em (C) corresponde a 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:cONTEÚDO largura = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg /&quot; /&gt; Figura 6. CLAHE facilita a detecção de ilhotas do pâncreas murino por imagem OPT. AC, representante iso-superfície imagens OPT prestados de uma pâncreas do rato C57Bl / 6 (lobo esplênica em 8 semanas) marcada para a insulina. Iso-superfície reconstruções de imagens de OPT foram realizadas antes (A, verde pseudo colorida) e após o protocolo CLAHE foi aplicado (B, pseudo cor vermelha). C, sobreposição dos dados não normalizadas, em (A) e os dados processados ​​CLAHE em (B). C&#39;-C &quot;, sobreposição de ampliação elevada representativas dos não normalizados (A) e CLAHE processada (B) as imagens. Tal como mostrado pela presença de&quot; vermelho &quot;somente ilhotas, o script CLAHE facilita a detecção de sinal pequena e baixa ilhotas intensidade. No exemplo actual, o espécime descrito (após CLAHE processamento), continham 2.419 ilhotas com um volume de 1,74 mm 3 (Números com base nos dados correspondentes de projecção não transformados era 1.057 ilhotas with um volume de 1,77 mm 3). D e E, a partir de dados de exemplo de controlo (D) e o modelo de ratinho ob / ob para o diabetes tipo 2 12 (E), 6 meses de execução do protocolo CLAHE. Notar o aumento massivo no tamanho geral dos ilhéus pancreáticos ob / ob (E). Em (D) e (E) do esboço pâncreas (cinza) está baseado no sinal de autofluorescência de tecidos. Barra de escala em C é 500 mm em CA. Barra de escala em C &quot;corresponde 200 um em C &#39;e C&#39;&#39; bar. Escala em E corresponde a 1 mm em (D) e (E). Imagens em (AC) são adaptados de Hörnblad et al 3 e foram gerados utilizando o Bioptonics scanner de 3001. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Porta-amostras para a fixação das amostras OPT. O espécime é assegurado pela inserção de agulhas através do espaçador de agarose através dos orifícios pré-perfurados na flange. O suporte encontra-se articulado para o motor passo a passo através de umíman forte localizada na sua base. Esta configuração omite o uso de colas instáveis ​​e evita movimentos indesejados da amostra durante a análise.

Nós descrevemos a adaptação de tomografia projeção óptica (OPT)<sup&gt; 1</sup&gt; Para imagens no espectro infravermelho próximo, e da implementação de uma série de ferramentas computacionais. Estes protocolos permitem avaliações de massa pancreática β-célula (BCM) em amostras maiores, aumentar a capacidade de multicanal da técnica e aumentar a qualidade dos dados OPT.

Perto Tomografia Projeção óptico infravermelho para avaliações de β-célula distribuição em massa em Pesquisa do Diabetes

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar avaliações baseadas em tomografia de projeção óptica da distribuição da massa de células beta em roedores, pâncreas ou em tecidos que abrigam enxertos de ilhotas. Assim, o espectro no infravermelho próximo é utilizado para permitir estudos de espécimes maiores e possibilitar a visualização simultânea de tipos celulares interagentes ou vizinhos. Isso é alcançado com equipamentos, o scanner de TPO com uma câmera sensível ao infravermelho próximo, uma fonte de luz de alta potência e conjuntos adequados de filtros.O espécime é primeiro isolado, fixado e submetido à imuno-histoquímica hormonal antes de ser embutido em aros e clareado opticalmente. Em seguida, é fixado em um suporte de amostra feito sob medida. Uma ferramenta de posicionamento semi-automatizada é utilizada para garantir o correto alinhamento no centro do scanner após a aquisição de imagens.As imagens projetadas são submetidas a pós-processamento para corrigir artefatos introduzidos pela configuração mecânica, se necessário. Um algoritmo de equalização é utilizado para melhorar a detecção de objetos de baixa intensidade. Finalmente, são realizados segmentação, visualização e quantificação por meio de software de processamento de imagens.As células beta produtoras de insulina desempenham um papel fundamental na manutenção da hemostase da glicose sanguínea. Portanto, avaliações espaciais e quantitativas da distribuição da massa de células beta pancreáticas são essenciais para diversas áreas da pesquisa sobre diabetes. Neste protocolo em vídeo, descrevemos uma adaptação da tomografia por reação óptica ou OPT, que permite a obtenção de imagens na faixa do infravermelho próximo e, consequentemente, a possibilidade de imagens de tecidos pancreáticos maiores.Isso também permite que uma maior variedade de tipos celulares seja estudada em um único espécime. Apresentamos ainda uma compilação de ferramentas computacionais desenvolvidas e otimizadas para a OPT na imagem do pâncreas em geral, e para a avaliação da massa de células B. Em particular, o espectro próximo ao infravermelho é a janela mais favorável para a penetração da luz no tecido.Para obter acesso a esta parte do espectro na imagem de TOP, várias modificações foram feitas ao scanner original de TOP descrito por colegas de Sharpen para avaliações únicas de massa de células beta. Em pâncreas de camundongo, utilizamos rotineiramente o scanner Ômico 3001. A luz de excitação é fornecida por uma lâmpada de metal-halógena que fornece maior energia de excitação do que uma lâmpada de arco de mercúrio em comprimentos de onda de aproximadamente 650 nanômetros.A luz é transferida através de um guia de luz líquido antes de passar pelos filtros de excitação. Os filtros utilizados neste protocolo são apresentados nesta tabela para avaliar a separação de canais de anticorpos. Conjugados com diferentes corantes fluorescentes Alexa foram imobilizados em microesferas de proteína e incorporados em planos separados de um fantoma de agarose.As imagens demonstram que não há vazamento entre os diferentes canais. A luz emitida é detectada com uma câmera CCD com iluminação traseira e alta eficiência quântica no espectro do infravermelho próximo. Para facilitar a imagem de amostras maiores, o campo de visão é aumentado pela incorporação de um espelho refletor maior e vete no scanner.A montagem vista acima do vete é o motor de passo que rotaciona a amostra durante a varredura. Um programa baseado em laboratório U controla a câmera e o motor de passo durante a varredura, colete o pâncreas e PBS gelado para evitar a degradação proteica. Remova cuidadosamente a gordura e as membranas ao redor, que poderiam interferir no procedimento de coloração e varredura.Fixe a amostra em PFA 4% a quatro graus Celsius por duas a três horas. Para evitar estabilizar o pâncreas em uma forma dobrada, espalhe-o em uma placa de Petri durante a fixação antes da imunomarcação em montagem inteira e lave o pâncreas em excesso de PBS. O procedimento de coloração foi descrito anteriormente para a avaliação da distribuição da massa de células beta.Rotineiramente utilizamos uma combinação de rim de porco, anticorpos primários anti-insulina e anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor para a coloração. Separe os três lobos pancreáticos principais. Isso facilita a avaliação comparativa dos lobos e permite a digitalização em maior aumento.Lave o pâncreas em água e mergulhe-o em agarose. Para remover quaisquer bolhas. Incorpore o pâncreas em agarose com temperatura baixa de fusão a 1,5% e mantenha-o em repouso até sedimentar.Corte o gelo que bloqueia, fechando o pâncreas. Certifique-se de deixar um espaçador de aproximadamente um centímetro entre a amostra e a base do gelo. O espaçador é necessário para fixar o espécime no porta-amostras.Desidrate o pâncreas em metanol a cem por cento antes da clareamento óptico em solução B, também conhecida como Maurice.Clear. Clareie a amostra até ficar transparente. Como o isolante B dissolve a maior parte dos plásticos, recomenda-se o uso de um frasco de vidro.Substitua a solução B algumas vezes para remover todos os vestígios de metanol. Agora a amostra está pronta para a varredura. Durante a varredura, a amostra é transportada por um ímã fixado a um promotor de passo.Isso permite o deslizamento da amostra ao longo de seu eixo X e eixo de ajuste, o que facilita o alinhamento pré-escaneamento do espécime. Na maioria dos protocolos de OPT, o bloco RO é colado ao suporte da amostra, contudo a maioria das colas dissolve a lâmpada, o que pode resultar em movimentos indesejados da amostra. Por isso, foi desenvolvido um suporte que dispensa o uso de cola.Posicione a amostra transparente no suporte e fixe-a inserindo suavemente duas agulhas guiadas pelos furos pré-perfurados nas abas do suporte. Coloque a amostra no escâner e submerja-a na solução BAB. É mostrada aqui a interface gráfica do usuário para o software baseado em LabVIEW, que é usado para controlar o tempo de exposição da câmera, o promotor de passos e para inserir parâmetros experimentais nos parâmetros do arquivo de registro, como magnificação.Os ajustes focais e a troca dos conjuntos de filtros são realizados manualmente no microscópio. Pare ao selecionar a ampliação. Ilumine a amostra utilizando o filtro GFP e exiba uma imagem de visualização usando o software de uso laboratorial.Gire o espécime para encontrar sua parte mais larga. Observe que, ao comparar uma série de pâncreas, utilize a mesma ampliação para todos os espécimes. Este fator é definido com base na amostra maior da série. Em seguida, mude para o conjunto de filtros que exibe o sinal específico e ajuste o foco.Observe que o tempo de exposição deve ser escolhido para obter a maior razão sinal-ruído possível sem saturar nenhuma parte do espécime. Para avaliações da massa de células beta pancreáticas, todo o espécime é normalmente a região de interesse e, portanto, o centro de massa da amostra (com) deve ser posicionado com precisão sobre seu eixo de rotação para obter resultados ótimos. O algoritmo commar calcula o centro de massa da amostra e fornece uma imagem de referência que facilita o alinhamento do centro de massa com o eixo de rotação.Para calcular as coordenadas X, comece adquirindo uma imagem do canal GFP a zero graus. Em seguida, troque o filtro e adquira uma imagem do sinal específico na mesma posição. Aplique então um algoritmo de expectativa-maximização na imagem GFP para definir o limiar da região de interesse, realize um cálculo do centro de massa na imagem com limiar definido e sobreponha uma linha vertical que passe pelo ponto do centro de massa encontrado na imagem do sinal específico.Esses passos são repetidos para a amostra girada em 90 graus para calcular as coordenadas Z. Por fim, as imagens adquiridas que delimitam os pontos do centro de massa são usadas como referência para mover a amostra de modo que a linha central do campo de visão passe pelos pontos de centro de massa encontrados da amostra. Quando a varredura é concluída, um valor de alinhamento pós-escaneamento é atribuído às projeções para ajustar com precisão a posição das imagens ao longo do eixo de rotação antes da reconstrução.No entanto, uma pequena aberração no ângulo da câmera em relação ao eixo óptico pode causar distorções geométricas durante a reconstrução. Para evitar tais distorções, utiliza-se um alinhamento discreto baseado em transformação livre, o FDA, após a digitalização de um espécime. Duas projeções são recuperadas do conjunto de dados para calcular o FDA.Essas projeções são F, o sinal específico em zero grau, e G, o sinal específico em 180 graus. A imagem D é transposta de modo a corresponder à orientação de F. A função DFT é utilizada para registrar blocos de oito pixels de altura ao longo da imagem a partir das duas projeções, e as mudanças medidas ao longo do eixo X permitem calcular o ângulo de rotação necessário, reutilizando os mesmos parâmetros para corrigir todos os canais adquiridos por meio da mesma varredura. Mais detalhes sobre os fundamentos dos algoritmos COMMAR e FTA podem ser encontrados em AL para facilitar a segmentação de iLet.Uma equalização adaptativa de histograma com limite de contraste é aplicada nas imagens de projeção. Neste protocolo, foi utilizada e aplicada a função integrada do MatLab "adapthisteq", com o limite de corte padrão de 0,01 e blocos de 256. O tamanho ideal do bloco, no entanto, precisa ser testado empiricamente e pode variar conforme o espécime analisado. Mais detalhes sobre o algoritmo e exemplos podem ser encontrados em Home e Blood e Shadow.No acréscimo. Os dados alinhados, compensados e normalizados agora podem ser reconstruídos em seções tomográficas. Para visualizar e quantificar a pilha de seções virtuais obtidas, gere superfícies ISO 3D utilizando um software apropriado de processamento de imagens, como S ou velocidade.Esta figura mostra uma vista de projeção de um lobo pancreático corado para insulina com um coquetel de anticorpos secundários conjugados a fluorocromos, incluindo Alexa Fluor 4 88, 5 94, 6 80 e sete 50. A razão sinal-ruído aumenta drasticamente à medida que avançamos para a parte do infravermelho próximo do espectro. Isso é ainda mais ilustrado neste gráfico, que mostra a razão média entre sinal e ruído para cada canal de sinal ao acessarmos uma faixa mais ampla do espectro.A imagem próxima à OPT aumenta o alcance dos tipos celulares que podem ser analisados em um único espécime. Este vídeo mostra o pâncreas do modelo de diabetes não obeso para diabetes tipo 1. No vídeo, as ilhotas de Langerhans produtoras de insulina são azuis, os vasos sanguíneos que expressam actina alfa do músculo liso são vermelhos e os linfócitos T infiltrantes marcados com CD3 são destacados.O parênquima verde da teacrina em cinza é reconstruído com base na autofluorescência endógena do tecido, aproveitando a maior penetração da luz nos tecidos na faixa do infravermelho próximo. A imagem de TPO permite avaliações da distribuição da massa de células beta em espécimes muito maiores do que anteriormente possível. Esta figura mostra a reconstrução da superfície ISO da distribuição de ilhotas no lobo esplênico de um rato gordo SER marcado para insulina utilizando ER erdi seis 80 como anticorpo secundário.Uma esfera esplênica de camundongo é mostrada para referência precisa. Essas imagens correspondem a duas reconstruções diferentes de isosuperfície da distribuição da massa de células beta em uma esfera pancreática individual, nas quais o ácido aparece sem o processamento da garra em verde e quando o algoritmo foi aplicado em vermelho. Ao sobrepor as duas reconstruções, demonstra-se que a garra facilita a segmentação também para ilhotas com baixa intensidade de sinal.Estes são vistos como vermelhos apenas na imagem sobreposta. Acabamos de mostrar como extrair informações espaciais e quantitativas da massa de células beta em todo o volume do pâncreas e até o nível dos ilhotas de Langerhans individuais. Esses protocolos não se limitam à avaliação de células beta ou do pâncreas em OPT próximo ao limite, bem como as ferramentas computacionais apresentadas devem poder ser adaptadas a outras áreas de investigação.Boa sorte. Boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O protocolo a seguir descreve o processo de dissecção pancreática para imagens fatia virtual, e posterior quantificação de todos os GFP-tagged células beta no pâncreas inteiro.

Quantificação em situ da Missa das células beta pancreáticas em camundongos

Métodos assistidos por computador romance de grande escala de aquisição e análise de amostras de imunohistoquímica do pâncreas manchadas são descritos: (1) capturar Slice Virtual de toda a seção, (2) a análise em massa de dados em grande escala, (3) Reconstrução de 2D Slices Virtual ; (4) mapeamento 3D ilhéu, e (5) Análise Matemática.

Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

Este protocolo permite uma para identificar factores que modulam a massa de células funcional de beta para encontrar potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes. O protocolo é constituído por um método simplificado para avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos após a manipulação da expressão do gene com adenovírus.

Avaliação de replicação e função das células beta no Adenovirally transduzidas isoladas ilhotas de roedores

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Aqui, apresentamos metodologia para gerar e administrar compostos de microesferas de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) carregadas de interesse para ilhotas de camundongos intactas em cultura com subsequente análise de imunofluorescência da proliferação de células β. Este método é adequado para determinar a eficácia de mitógenos candidatos a β células.

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

Ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion regula distribuição de sangue ilhéu e mantém a função fisiológica das células β de ilhéu. Este protocolo descreve usando um monitor de laser Doppler para determinar o estado funcional das ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular na vivo e avaliar as contribuições da microcirculação de ilhotas pancreáticas para doenças relacionadas com o pâncreas.

Laser Doppler: Uma ferramenta para medir ilhota Pancreatic Microvascular Vasomotion In Vivo

Aqui, apresentamos um passivo de protocolo para seções de pâncreas humano imagem em três dimensões (3D) usando otimizado métodos de compensação. Este manuscrito demonstra estes procedimentos para compensação de óptica passiva seguido por imunofluorescência múltiplas coloração para identificar os elementos-chave das redes neurais sensoriais e autonômicas, que inervam ilhotas humanas.

Imagens 3D de alta resolução da rede Neuro-insular pâncreas humano

O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.

Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

Neste protocolo, as ilhotas pancreáticas são reconstruídas e analisadas usando algoritmos computacionais implementados em uma aplicação multiplataforma dedicada.

Reconstrução computacional de ilhotas pancreáticas como ferramenta de análise estrutural e funcional

Detalhamos um novo infravermelho próximo de fluorescência cateter (NIRF) para 2-dimensional imagem intravascular molecular da biologia...

In vivo Near Infrared fluorescência de imagem intravascular (NIRF) Molecular da placa inflamatória, uma Abordagem Multimodal para imagem da Aterosclerose

Aprenda a adaptar a tomografia de projeção óptica no infravermelho próximo para avaliar a distribuição da massa de β-células pancreáticas em pesquisas sobre diabetes.

Perto Tomografia Projeção óptico infravermelho para avaliações de β-célula distribuição em massa em Pesquisa do Diabetes

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