近红外光学投影层析成像技术在糖尿病研究β细胞质量分布的评估

该程序的总体目标是对啮齿动物、胰腺或带有孔眼移植物的组织中的 β 细胞质量分布进行基于光学投影断层扫描的评估。因此，近红外光谱用于研究更大的标本，并允许同时可视化相互作用或相邻的细胞类型。这是通过设备、带有近红外敏感相机的 OPT 扫描仪、高功率光源和适当的滤光片组来实现的。

首先对标本进行分离、固定和激素免疫染色，然后再将其嵌入 aros 中并进行光学透明化。然后将其连接到定制的样品架上。使用半自动定位工具确保扫描后扫描仪正确居中。

如果需要，投影图像会进行后处理，以校正机械设置引入的伪影。采用均衡算法来改进对低强度物体的检测。最后，使用图像处理软件进行分割、可视化和量化。

产生胰岛素的 β 细胞在维持血糖止血中起着关键作用。因此，胰腺 β 细胞质量分布的空间和定量评估是糖尿病研究许多领域的关键。在这个视频协议中，我们描述了一种光学反应断层扫描或 OPT 的改编，它能够在近红外范围内成像，从而有可能对胰腺组织的更大身体进行成像。

它还允许在单个样本中研究更大范围的细胞类型。我们进一步介绍了为一般胰腺成像和 B 细胞质量评估开发的优化 OPT 的计算工具的汇编。特别是，近红外光谱是组织中光渗透的最有利窗口。

为了在 O PT 成像中访问这部分光谱，对 sharpen 同事描述的原始 OPT 扫描仪进行了许多修改，用于 β 细胞质量的单次 SH 评估。在小鼠胰腺中，我们通常使用 Omic 3001 扫描。激发光由金属 haa 灯施加，在波长约为 650 纳米时提供比汞弧灯更高的激发能量。

光在通过激发滤光片之前通过液体光导传输。本方案中使用的过滤器显示在下表中，用于评估通道分离抗体。与不同的 Alexa 地板染料偶联，固定在蛋白珠上，并包埋在 agros 模型的单独平面中。

这些图像表明，不同通道之间没有渗漏。发射的光由背照式 CCD 相机检测，该相机在近红外光谱中具有高量子效率。为了便于对较大的样品进行成像，通过在扫描仪中加入更大的反射镜和 vete 来增加视野。

在扫描过程中旋转样品的步进电机是设置。基于实验室 U 的程序在扫描过程中控制相机和步进电机，收获胰腺和冰冷的 PBS 以避免子子降解。小心去除周围的脂肪和膜，否则可能会干扰染色和扫描程序。

将样品在 4 摄氏度的 4% PFA 中固定 2 到 3 小时。为避免将胰腺稳定为折叠形状，请在固定期间将其喷在培养皿中，然后进行全安装免疫染色，用过量的 PBS 洗涤胰腺。之前已经描述了用于评估 β 细胞质量分布的染色程序。

我们通常依赖于肾猪、抗胰岛素、一抗和 Alexa Fluor 偶联的染色二抗的组合。分离三个主要胰叶。这有助于对叶进行比较评估，并允许以更高的放大倍率进行扫描。

用水冲洗胰腺并将其浸泡在 agros 中。去除任何气泡。将胰腺埋入 1.5% 的低熔融温度下，并保持眼睛直到沉淀。

切断 agros 阻塞，关闭胰腺。确保在样品和研磨剂底部之间留出大约 1 厘米的垫片。需要垫片将样品固定到样品架中。

在 B 透明溶液（也称为 Maurice.Clear）中进行光学透明化之前，在 100% 甲醇中脱水胰腺。清除样品直至透明。由于 B isol 大多数塑料，建议使用 A 玻璃瓶。

更换 B 溶液几次以去除所有痕量甲醇。现在样本已准备好进行扫描。在扫描过程中，样品由连接到阶梯促进剂的磁铁携带。

这允许样品沿其 X 轴和设定轴滑动，从而促进样品的扫描前对准。在大多数 OPT 方案中，RO 模块粘在样品架上，但大多数线索会溶解球，这可能导致样品发生不必要的移动。因此，设计了一个省略使用 view 的支架。

将透明样品放入支架中，并在支架法兰上的预钻孔引导下轻轻插入两根针头来固定样品。将样品放入扫描仪中，然后将其浸入 BAB 溶液中。此处显示的是基于实验室视图的软件的图形用户界面，用于控制相机曝光时间、步长促进剂，以及将实验参数输入到日志文件参数（如放大倍率）中。

焦点调整和滤光片组的更换是在显微镜上手动进行的。通过选择放大倍数停止。使用 GFP 滤光片照亮样品，并使用实验室使用软件显示预览图像。

旋转标本以找到其最宽的部分注释在比较一系列胰腺时，对所有标本使用相同的放大倍率。此因子基于序列中较大的样本设置。接下来，更改为显示特定信号的滤波器集并调整焦距。

请注意，曝光时间应选择尽可能高的信噪比，而不会使样品的任何部分饱和。为了评估胰腺 β 细胞质量，整个标本通常是感兴趣的区域，因此样品质心 com 应精确定位在其旋转轴上，以获得最佳结果。commar 算法计算样本质心并提供参考图像，以便于在旋转轴上对齐质心。

要计算 X 坐标，首先要获取 GFP 通道在零度的快照。然后切换滤波器并获取同一位置特定信号的快照。接下来，在 GFP 图像上应用期望最大化算法以对感兴趣区域进行阈值处理，在阈值图像上应用质心计算，在特定信号的图像上叠加一条穿过找到的质心点的垂直线。

对旋转 90 度的样品重复这些步骤以计算 Z 坐标。最后，使用描绘质心点的采集图像作为参考来移动样品，使视场的中心线穿过找到的样品质心点。扫描完成后，将为投影分配一个后对齐值，以便在重建之前沿旋转轴微调图像位置。

然而，相机朝向光轴的角度的微小像差会导致重建过程中的几何变形。为避免这种扭曲，在扫描标本后使用基于离散变换的对准。从数据集中检索两个投影以计算 FDA。

这些投影是 F （零度处的特定信号） 和 G （180 度处的特定信号）。图像 D 被转置，使其与 F 的方向相匹配，DFT 函数用于从两个投影在整个图像中注册八个像素高度块，并且测量沿 X 轴移动以计算必要的旋转角度，重复使用相同的参数来校正通过同一扫描获得的所有通道。有关 COMMAR 和 FTA 算法基础的更多见解，请参阅 AL 以促进 iLet 分割。

在投影图像上应用对比度受限的自适应直方图均衡爪。在该协议中，使用并应用了垫子内置功能 adapt hiss egg，默认剪辑限制为 0.01，lytes 为 256。然而，最佳轮胎尺寸需要根据经验进行测试，并且可能会因分析的样本而异，有关算法的更多详细信息和示例可以在 Home Blood and Shadow 中找到。

在 add.现在可以将对齐补偿和归一化数据重建为断层扫描切片。为了可视化和量化获得的虚拟截面堆栈，使用合适的图像处理软件（如 S 或速度）生成 3D ISO 表面。

该图显示了胰叶用荧光染料偶联二抗混合物（包括 Alexa Fluor 4 88、5 94、6 80 和 7 50）进行胰岛素染色的投影视图。当我们向光谱的近红外部分移动时，信号音调比急剧增加。此图进一步说明了这一点，通过访问更广泛的频谱部分，显示了每个信号通道的平均信噪比。

近 OPT 成像增加了可在单个样本中分析的细胞类型范围。该视频展示了 1 型糖尿病的非肥胖糖尿病模型的胰腺。在视频中，朗格汉斯产生胰岛素的胰岛是蓝色的，表达 α 肌动蛋白的血管是红色的，CD 3 标记的浸润性 T 淋巴细胞。

灰色的绿色茶黄实质是通过利用在近红外范围内增加的生命外显率，基于内源性组织自发荧光重建的。O PT 成像能够评估比以前大得多的标本中的 β 细胞质量分布。该图显示了使用 ER erdi six 80 作为二抗标记胰岛素的 SER 脂肪大鼠脾叶中孔眼分布的 ISO 表面重建。

显示了小鼠脾球以供精确参考。这些图像对应于单个胰腺球中 β 细胞质量分布的两种不同的等值面重建，绿色是酸在没有爪处理的情况下出现的，而红色是应用算法时。通过叠加这两个重建，表明 claw 也有助于低信号强度孔眼的分割。

这些仅在叠加图像中显示为红色。我们刚刚向您展示了如何提取整个神经元胰腺体积中 β 细胞质量的空间和定量信息，直至朗格汉斯单个孔的水平。这些协议不仅限于 β 细胞或近受损 OPT 胰腺的评估，以及提出的计算工具应该可以转化为其他研究领域。

祝你好运。祝你的实验好运。