Name: 近红外光学投影层析成像技术在糖尿病研究β细胞质量分布的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 18 s
Description: 了解近红外光学投影层析成像技术如何评估胰腺β细胞质量分布。该方法结合计算工具增强多通道成像能力，为糖尿病研究提供高分辨率三维可视化分析手段。

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感谢 P. Lindström 博士提供 ob/ob 小鼠。感谢 J. Lehtonen 在视频制作方面的协助，以及 J. Gilbert 在编辑工作中的帮助。本研究得到了糖尿病研究研究所基金会（A.P.）、青少年糖尿病研究基金会（A.P. 和 U.A.）、欧洲委员会（FP-7，资助协议编号：CP-IP 228933-2）（J.S. 和 U.A.）、Kempe 基金会、Umeå 大学以及瑞典研究理事会向 U.A. 提供的资助支持。

1. 样品制备与扫描
1.1 样品制备
以下操作步骤基本如先前所述7。
<ol>
	<li>取胰腺组织。使用冰冻的 PBS 以避免蛋白降解。</li>
	<li>将组织在冰上用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 固定 2–3 小时。确保在固定过程中胰腺小叶&#34;充分展开&#34;，这有助于在后续重建后识别解剖学标志。</li>
	<li>用大量 PBS 洗涤 30 分钟。</li>
	<li>将胰腺逐步脱水：甲醇（33%、66%、100%），每步 15 分钟。此步骤可最大限度减少漂白过程中（见步骤 5）气泡的形成，并防止冻融过程中（见步骤 7）细胞结构破坏。</li>
	<li>将组织置于新配制的甲醇:二甲基亚砜:D2O2 漂白缓冲液（体积比 2:1:3）中，室温孵育 24 小时，以淬灭组织内源性荧光。对于较大的样本，更换新鲜漂白缓冲液并再孵育 24 小时。</li>
	<li>用大量甲醇洗涤，过夜。</li>
	<li>在 -80 °C 至室温之间进行至少 5 个冻融循环，以促进抗体渗透。</li>
	<li>逐步用 TBST 重新水化（33%、66%、100%），每步 15 分钟。</li>
	<li>在 TBST 中加入 10% 血清（优先选择与二抗来源相同的物种）、5% DMSO 和 0.01% 叠氮化钠，室温封闭 12–24 小时。</li>
	<li>将组织在封闭缓冲液中与一抗孵育 48 小时，室温；对于较大样本，延长至 72 小时（所用抗体列于试剂表中）。</li>
	<li>用大量 TBST 洗涤，过夜。</li>
	<li>与荧光标记的二抗在室温下孵育 48 小时，较大样本可延长至 72 小时。</li>
	<li>用大量 TBST 洗涤，过夜。</li>
</ol>
1.2
以下步骤描述了在进行光学投影断层扫描（OPT）之前，如何将样品包埋在琼脂糖中并将其固定到定制的样品 holder 上（见图7）。
<ol>
	<li>根据脾脏、十二指肠和胃叶进行分离 图 3A 在 Hörnblad 等3Hörnblad 中进一步阐明了叶之间的关系 等11.</li>
	<li>制备 1.5% (w/v) 低熔点琼脂糖溶液于 dH₂O 中2O，过滤，冷却至 37 °C，用 dH₂O 冲洗组织2在冰上进行琼脂糖包埋前，用 O 洗去洗涤剂并去除气泡。</li>
	<li>切下包含样品的琼脂糖块，并在样品与琼脂糖底部之间保留约1 cm的间隔。修整琼脂糖块的尖锐边缘（≤ 90°），以减少光散射。</li>
	<li>逐步用甲醇（33%、66%、100%）对样品进行脱水处理，每一步之间留出足够时间使其充分平衡。当样本沉入底部时，视为已达到平衡。</li>
	<li>用苯甲醇:苯甲酸苄酯（BABB）1:2 溶液清除样本，直至样本变得透明。更换 BABB 溶液，继续孵育 12 小时。</li>
	<li>将透明化处理后的样本置于样本架中，并通过样本架法兰上的钻孔，将两根针穿过琼脂糖间隔物以固定样本。</li>
	<li>将样本放入扫描仪，并浸入装有BABB透明化溶液的比色皿中。在比较一系列胰腺样本时，所有扫描应使用相同的放大倍数。放大倍数应根据该系列中最大的样本进行优化。</li>
</ol>
1.3 在AR处对样本进行定位
以下方案描述了使用COM-AR算法精确定位样本的步骤。该程序仅在感兴趣区域（ROI）包含整个标本时适用。有关算法的详细描述，请参见Cheddad et al2。
<ol>
	<li>在解剖结构通道和信号通道中，分别获取样本在两个位置的图像：位置1 为 0°（对应于 X 轴），显示最大的投影面积；位置2 为 90°（对应于 Z 轴）。我们使用 GFP 通道来观察解剖结构。</li>
	<li>对解剖结构图像应用期望最大化（EM）算法，以分割出感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>计算第 2 步中获得的二值化图像在 0° 和 90° 投影下的质心（COM）点（x 坐标）。</li>
	<li>在信号通道的 0° 和 90° 图像上，叠加一条穿过第 3 步计算出的 COM 点的垂直线。</li>
	<li>以第 4 步获得的图像作为参考，移动样本，使视场的中心线穿过样本的 COM 点。</li>
</ol>
1.4 扫描
<ol>
	<li>调整曝光时间，以在不使投影图像任何区域饱和的前提下，获得尽可能高的信噪比。对所有待扫描通道重复此步骤。</li>
	<li>选择首个待扫描荧光通道的滤光片组。较短波长（λ）荧光染料的发射光可能激发较长波长荧光染料，从而导致光漂白。为尽量避免此情况，应优先扫描激发波长（λ）最长的荧光染料。</li>
	<li>打开快门以照射样品，并沿360°采集荧光信号，每个通道扫描时均绕垂直轴旋转样品。NIR-OPT系统的步进角度为0.9°，Bioptonics 3001扫描仪的步进角度为0.45°。</li>
	<li>为下一个通道选择适当的滤光片，并按上述步骤继续操作。</li>
</ol>
2. 计算处理与重建
2.1 采集后错位检测与校正（A值调谐）
在投影断层成像中，通常需要为投影图像分配一个后对齐值（post-alignment value），以在重建前微调图像沿旋转轴的位置。然而，相机相对于光轴的角度存在微小偏差时，可能导致样品沿长度方向上的A值不均匀，从而引起几何畸变。为避免此类畸变，可采用一种计算方法，以在整个样品范围内确定准确且统一的后对齐值（A值）2。
<ol>
	<li>使用离散傅里叶变换将0°和180°处特定信号的投影划分为高度为8个像素的块，并计算每个块沿x轴方向（A值）的偏移量。</li>
	<li>应用线性最小二乘回归法计算角度θ'，该角度描述了沿样品长度方向x轴偏移的变化斜率，并用于确定旋转中心点。</li>
	<li>通过将所有投影围绕旋转中心点旋转θ'/2，校正扫描过程中的错位问题。</li>
</ol>
2.2 对比度受限的自适应直方图均衡化（CLAHE）
为了促进对信号极弱的物体（胰岛）进行检测和分割，避免这些物体在重建和/或定量评估的分割过程中因信号过弱而被&#34;阈值过滤掉&#34;，可对投影图像应用CLAHE算法。CLAHE操作包含两个主要的强度变换步骤：
<ol>
	<li>在投影图像的非重叠块内估计并均衡局部对比度。</li>
	<li>然后通过双线性插值对块间边界区域的强度进行归一化。</li>
</ol>
“对比度受限”这一名称指的是剪切限值，该限值的设定旨在避免图像中像素的饱和。在本实验方案中，使用了 MATLAB 内置函数&#34;adapthisteq&#34;，并采用默认的剪切限值 0.01 和分块大小 256 进行处理。需要注意的是，最佳分块大小需通过实验经验确定，可能因所分析的样本不同而有所变化。有关该算法的更多细节和示例，可参见 Hörnblad et al3。
注意！ 上述列出的计算处理步骤（包括 COM-AR、A-值调优和 CLAHE，见 1.3-2.2 节）基于标准算法，使用 MATLAB（Mathworks）执行。
2.3 断层重建与等值面渲染
<ol>
	<li>使用滤波反投影算法，现在可对校正并归一化的图像进行重建，实现统一的错位补偿，并最小化对动态范围优化的需求。在本方案中，所有重建均使用 NRecon 软件（Skyscan）1.6.8 版本中提供的滤波反投影方法完成（<a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm" target="_blank">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a>）。需要注意的是，成像物体的放大倍数取决于其与镜头焦点之间的距离，除非成像系统中采用了平行束几何结构。因此，在将投影数据集导入 NRecon 软件时，必须在配套的日志文件中正确填写物体到光源的距离（mm）以及扫描仪的旋转方向（逆时针输入为 &#34;cc&#34;，顺时针输入为 &#34;cw&#34;），以避免重建过程中产生锥束伪影。</li>
	<li>为可视化和量化所获得的虚拟切片堆栈，可使用合适的图像处理软件（如 Imaris 或 Volocity）生成三维等值面。</li>
</ol>
小鼠胰岛分离和移植操作在迈阿密大学机构动物护理和使用委员会审查并批准的方案下，于糖尿病研究所的临床前细胞处理与转化模型核心实验室进行。瑞典北部动物研究伦理委员会批准了所有其他涉及动物的实验。

<ol><li>Sharpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+Assisted+Algorithms+for+Optical+Projection+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Med.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).</li>
<li>Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+optical+projection+tomography+imaging+reveals+lobular+heterogeneities+in+pancreatic+islet+and+beta-cell+mass+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution.</a> Islets. 3, 204-208 (2011).</li>
<li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+pancreas%3A+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).</li>
<li>Ahlgren, U., Gotthardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+imaging+islets%3A+recent+advances+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+islet-infiltrate+interactions+based+on+optical+projection+tomography+assessments+of+the+intact+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054070(2008).</li>
<li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+Three-Dimensional+Imaging+of+the+Insulitis-Induced+Destruction+of+beta-Cells+in+Murine+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+AMP-activated+protein+kinase+alpha1+and+alpha2+from+mouse+pancreatic+beta+cells+and+RIP2.Cre+neurons+suppresses+insulin+release+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo.</a> Diabetologia. 53, 924-936 (2010).</li>
<li>Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+spleen+formation+perturbs+morphogenesis+of+the+gastric+lobe+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas.</a> PLoS One. 6, e21753(2011).</li>
<li>Lindström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+the+Obese-Hyperglycemic+Mice+%28ob%2Fob+Mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+JOURNAL%22%5BJournal%5D)">The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice).</a> The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54, 133-137 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

所描述的OPT成像技术能够提取小鼠胰腺整个体积内的空间和定量参数。由于此类介观成像可达到的分辨率存在局限性，需要注意的是，与其他大多数成像方式类似，样本越大，分辨率越低（尽管使用更高分辨率的CCD可提高OPT扫描的分辨率）。因此，目前在评估完整的小鼠胰腺叶时，该技术尚无法实现单细胞分辨率，但已接近该水平（约15–20 μm）7然而，对于小鼠胰腺中 BCM 分布的提取，这些方案所提供的数据与通过以下方法获得的数据高度吻合 例如 点计数形态测量法3,13 需要注意的是，尽管应用CLAHE方案能够检测到显著更多的胰岛，但这些胰岛通常较小，对总体β细胞体积的贡献并不显著。
免疫组织化学实验方案相对较长（最长可达两周），但实际用于样本制备的操作时间较短，因此该技术非常适合用于大规模动物群体的研究9。如果研究关注的是异质性分布模式的可能性，则需特别强调在固定和封片步骤中应格外小心，避免胰腺组织以不利的方式被固定，应尽量制备平坦（“铺开”）的组织封片，以利于此类评估。
进行 OPT 实验时的一个重要问题是，样品的质心（COM）必须固定在旋转轴上，并且在扫描过程中不能发生垂直或水平移动。因此，拥有一个稳定的机械装置以及一个功能良好的样品固定系统至关重要。我们通过设计一个新的安装装置解决了这一问题（图7）。
对于我们的NIR-OPT或Bioptonics 3001扫描仪而言，平行几何并不成立，这表现为投影图像中周边物体前后位置之间存在垂直偏移。通过调整相应扫描仪日志文件中的物体到光源距离（见2.3.1节），我们能够显著提高数据质量，并校正投影图像远边缘处的几何畸变，这在评估较大样本时尤为重要。
在本实验方案中，我们推荐了一组滤光片，可用于在完整胰腺标本的评估中同时观察三个不同的特异性通道以及一个“解剖结构”通道。显然，这些设置可根据特定研究中所使用的荧光染料进行调整，但与所有荧光显微技术一样，必须仔细评估信号串扰的潜在风险。由于我们所使用的设备配备的是金属卤化物灯，目前尚无法实现对胰岛素标记的胰岛进行激发波长高于750 nm的荧光染料成像。未来若采用在相关波长范围内具有更高量子效率的相机，并结合其他光源（例如半导体激光器），可能进一步提升近红外光学投影断层成像（NIR-OPT）的潜力，并实现更长波长范围内的成像。
光学投影断层成像（OPT）是一种高度通用的技术，可用于在毫米至厘米尺度上对生物医学标本进行空间和定量评估。尽管本文介绍的实验方案主要是为胰腺/糖尿病研究而开发，但其应可推广应用于其他物种、标本类型及标记物的研究。由于能够在完整的胰腺样本中同时可视化多个不同的通道，近红外OPT成像还有望作为一种工具，用于评估旨在通过其他成像方式实现无创检测的对比剂的摄取特异性，前提是这些对比剂可被设计为同时携带一个可通过OPT检测的荧光团。

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

产生胰岛素的β细胞对于机体调控血糖稳态至关重要。因此，对胰腺β细胞质量（BCM）分布的评估在多种临床前糖尿病研究领域中具有重要意义。例如，在治疗方案的评价中，靶向基因敲除对内分泌细胞分化的影响，或在啮齿类动物糖尿病模型中对疾病病因的研究，往往依赖于此类分析。传统上，这类评估依赖于耗时的体视学方法，由于胰腺体积较大且解剖结构复杂，这些方法难以实施。目前大多数高分辨率成像技术（通常为光学成像）穿透深度不足，无法实现对啮齿类动物全胰腺的成像。相反，不受穿透深度限制的成像方法（通常为核成像）分辨率过低，难以解析完整的β细胞质量分布，且受限于缺乏合适的对比剂4,5。
光学投影断层成像是一个三维成像方式，可在毫米至厘米尺度上对生物医学样本进行高分辨率评估6。由此，可在正常和糖尿病小鼠的整个胰腺体积内提取出表达胰岛素的朗格汉斯胰岛的空间位置和体积信息3,7-10。本研究的目的是进一步提升该技术在评估胰腺β细胞方面的能力，包括其在移植到其他组织后的内源性分布、与其他胰腺组分（如浸润性细胞类型）的关系，以及在比以往更大的胰腺样本中的应用。
近红外光学投影断层扫描（NIR-OPT）装置
在以下方案中，描述并使用了一种基于Sharpe et al1最初描述的设置、并经改造用于近红外范围成像的OPT扫描仪。对于小鼠胰腺的单通道评估（例如 BCM），可使用SkyScan 3001（Bioptonics）扫描仪。
提供激发光的是金属卤化物灯，其在波长超过650 nm时提供的激发能量高于汞弧灯。激发光通过液体光导传输。适用于近红外荧光成像和通道分离的荧光染料与带通滤光片的实用组合如图3所示。发射光由背照式CCD相机检测，该相机在近红外光谱范围内具有高量子效率。OPT扫描采用LabView平台实现自动化，该平台控制相机和步进电机。为支撑完整大鼠胰腺大小的样品，使用了带保护层的镀银反射镜和大型比色皿。最后，设计了一种样品支架，可在扫描过程中消除样品不必要的垂直移动。

<table><tbody><tr><td>甲醇</td><td>Scharlau</td><td>ME03162500</td><td></td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scharlau</td><td>HI01362500</td><td></td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Scharlau</td><td>AL01611000</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯</td><td>Scharlau</td><td>BE01851000</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>LONZA</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100（Triton-X100）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗α-SMA-Cy3抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td>一抗</td></tr><tr><td>兔抗CD3抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7930</td><td>一抗</td></tr><tr><td>豚鼠抗胰岛素抗体（Ins）</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td>一抗</td></tr><tr><td>驴抗豚鼠IgG-IRDye680标记二抗</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32421</td><td>二抗</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG-DyeLight750标记二抗</td><td>Thermo Scientific</td><td>35570</td><td>二抗</td></tr><tr><td>山羊抗豚鼠IgG-Alexa594标记二抗</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11076</td><td>二抗</td></tr><tr><td>山羊抗豚鼠IgG-Alexa488标记二抗</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11008</td><td>二抗</td></tr><tr><td>山羊抗豚鼠IgG-Alexa594标记二抗</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11012</td><td>二抗</td></tr><tr><td>山羊抗豚鼠IgG-Alexa680标记二抗</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21076</td><td>二抗</td></tr><tr><td>山羊抗豚鼠IgG-Alexa750标记二抗</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21039</td><td>二抗</td></tr><tr><td>OPT Skyscan 3001</td><td>Bioptonics</td><td></td><td>OPT扫描仪</td></tr><tr><td>Leica MZ FLIII</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>Leica 0.5倍物镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>10446157</td><td></td></tr><tr><td>Leica 1.0倍相机适配器</td><td>Leica Microsystems</td><td>10445930</td><td></td></tr><tr><td>EL6000金属卤化物光源</td><td></td><td>11504115</td><td>光源</td></tr><tr><td>液体光导管</td><td></td><td>11504116</td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Hellma Analytics</td><td>6030-OG</td><td>55 × 55 × 52.5 mm</td></tr><tr><td>反射镜</td><td>Edmund Optics</td><td>F68-334</td><td>50 × 50 mm</td></tr><tr><td>Andor Ikon-M</td><td>Andor Technology</td><td>DU934N-BV</td><td>背照式CCD相机</td></tr><tr><td>滤光片组</td><td>Chroma Technology</td><td>41021-MZFLIII</td><td>TXR、Alexa-594、Cy3</td></tr><tr><td>滤光片组</td><td>Chroma Technology</td><td>41022-MZFLIII</td><td>IRDye680、Alexa-680</td></tr><tr><td>滤光片组</td><td>Chroma Technology</td><td>49037-MZFLIII</td><td>Dylight750、Alexa-750</td></tr><tr><td>Protein G-Sepharose微球</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-01</td><td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08591</td><td>0.1 M 叠氮化钠溶液</td></tr></tbody></table>

近红外光学投影断层成像用于糖尿病研究中β细胞质量分布的评估

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

通过改进光学投影断层扫描技术（OPT），使其具备近红外（NIR）光谱成像能力，本文展示了对较大体积胰腺组织（如大鼠胰腺）进行成像的可能性，并可在单个样本中增加可检测的通道数（细胞类型）。我们进一步描述了一系列计算工具的实现方法，这些工具可提供：1/ 精确定位样本（本研究中为胰腺）的质心（COM）于旋转轴（AR）上2；2/ 改进的比对后调谐算法，可在断层重建过程中防止几何畸变2 以及3/一种用于强度均衡的方案，以提高基于OPT的BCM测定中的信噪比3此外，我们描述了一种样本支架，可最大限度降低成像过程中标本意外移动的风险。结合这些方案，能够对完整胰腺或其他器官全体积内的β细胞团（BCM）分布及其他特征进行评估。例如 在胰岛移植研究中，分辨率可达到单个朗格汉斯胰岛的水平。

在本报告中，我们描述了一种利用近红外光学投影断层成像技术（NIR-OPT）从啮齿类动物胰腺（及其他组织）中提取并进行计算处理β细胞质量（BCM）数据的实验方案（图1）。如图2所示，胰腺样本在近红外光谱范围内的组织自发荧光显著降低，从而显著提高了检测胰岛素标记的朗格汉斯胰岛时的平均信噪比（S:N）。通过将光学投影断层成像技术（OPT）优化用于近红外光谱范围内的成像（如本文所述），可在整个小鼠胰腺体积内实现至少三个特异性通道的清晰分离与可视化，且各通道均具有足够的信噪比（见图3和图4）。该技术应用于糖尿病发生过程的成像和/或常规β细胞质量（BCM）评估时，可实现胰岛素阳性区域与其周围及相互作用细胞类型的共定位可视化与定量分析（见图4）。由于近红外光谱范围内的组织穿透深度显著增加，此类分析现可在比以往更大尺寸的样本中进行，包括体积为小鼠胰腺3至5倍的大鼠胰腺（见图5）。无论使用可见光还是近红外波长，CLAHE算法的应用均可通过提高检测灵敏度，显著促进在不同遗传和生理条件下基于OPT的β细胞质量（BCM）评估（见图6）。所开发样品支架的设计蓝图如图7所示。
<img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="光学断层成像流程图；包括近红外光学断层扫描（NIR-OPT）和计算分析步骤。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 小鼠胰腺中基于OPT的胰岛β细胞（BCM）分析关键步骤流程图。 评估一个典型小鼠胰腺所需时间为13至14天。其中大部分时间用于组织处理和免疫组织化学染色（约10天），组织透明化过程约需2天，而扫描时长则取决于所需的曝光时间（通常约为1小时）。后续的计算处理通常在一天内完成。需要注意的是，这一相对较长的染色流程非常适合对大量样本进行批量处理。
<img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="胰岛细胞中荧光染料的信噪比分析、显微镜图像及比较图数据。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 不同波长下胰岛素分泌细胞质量（BCM）评估的信噪比。 使用经胰岛素染色并用多种荧光染料标记的二抗混合物（Alexa 488、594、680 和 750）染色的小鼠十二指肠胰腺叶，用于测定不同波长下的信噪比（S:N）。A，图像显示每个信号通道的第一投影帧。B，图表展示每个信号通道的平均信噪比。信噪比通过胰岛平均强度（基于215个胰岛）除以背景强度（外分泌组织的内源性组织荧光）计算得出。C，图表显示各通道中单个胰岛的信噪比，归一化至Alexa 594通道测得的信噪比。统计分析采用单因素方差分析（One way ANOVA）。显著性水平表示为 **p&lt;0.01。A图中的比例尺对应1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="荧光染料组合表及荧光滤光片组实验结果；激发光、发射光" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 通道分离。 A，列于表格中的Alexafluor染料标记的二抗分别固定在Protein G-Sepharose珠上。B，随后将荧光珠嵌入琼脂糖仿体的不同深度，并使用指定滤光片进行成像。
<img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="NOD 胰腺和肝脏带胰岛移植物，三维可视化，CD3、胰岛素、α-SMA 染色分析。" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 基于 OPT 的多通道成像在糖尿病研究中的应用。A，来自1型糖尿病非肥胖糖尿病（NOD）模型的胰腺（12周龄，十二指肠叶）的基于OPT的等表面重建图像。样本经胰岛素（胰岛β细胞，伪彩为蓝色）、平滑肌α-肌动蛋白（血管，红色）和CD3（浸润性T淋巴细胞，绿色）染色。所用相应二抗分别为Cy3、IRDye-680和DyeLight-750。插图（A'–A'''）显示各单独信号通道。B，经同基因胰岛移植后两周，采用近红外OPT对小鼠肝脏（左外叶，lobus sinister lateralis）进行成像的OPT图像（放大视图）。表达胰岛素的胰岛伪彩为蓝色，平滑肌α-actin阳性的血管为红色。该方法可实现对胰岛移植物在血管网络内分布情况的评估。比例尺对应1 mm。
<img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="大鼠和小鼠脾叶分析；断层切片，细胞分布显微成像。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 近红外光学投影断层成像（NIR-OPT）可实现对较大样本的成像。 A，来自2型糖尿病Zucker Fatty模型大鼠胰腺中胰岛β细胞质量（BCM）分布的等表面渲染图（9个月龄脾叶），展示了NIR-OPT技术对大鼠胰腺尺度样本进行成像的能力。根据该技术测定，所示脾叶体积约为同源小鼠脾叶的6倍（v/v），并含有10139个表达胰岛素的朗格汉斯胰岛，其β细胞体积占整个小叶总体积的1.32%。B，对应于（A）中断裂线位置的断层切片，显示组织各深度的胰岛均被检测到。C，小鼠胰腺（8周龄脾叶）中BCM分布的等表面渲染图，作为尺寸参照。所示小叶含有2490个表达胰岛素的胰岛，其β细胞体积占小叶总体积的0.89%。大鼠和小鼠胰腺样本分别使用GP抗胰岛素抗体染色，继而使用Alexa594标记的山羊抗GP（小鼠）和IRDye 680标记的驴抗GP（大鼠）抗体。图（A–C）按相同比例显示，（C）中的比例尺对应2 mm。
<img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="使用CLAHE进行细胞图像分析。非归一化与CLAHE处理后的荧光显微镜结果对比。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. CLAHE通过OPT成像促进小鼠胰腺中胰岛的检测。 A-C，C57Bl/6小鼠胰腺（8周龄脾叶）胰岛素标记的代表性等表面渲染OPT图像。在应用CLAHE协议之前（A，伪彩为绿色）和之后（B，伪彩为红色）分别进行了OPT图像的等表面重建。C，未归一化数据（A）与CLAHE处理后数据（B）的叠加图像。C'-C"，未归一化（A）与CLAHE处理后（B）图像的代表性高倍放大叠加图。如图中“仅呈红色”的胰岛所示，CLAHE脚本有助于检测体积小且信号强度低的胰岛。在本示例中，经CLAHE处理后的样本含有2419个胰岛，总体积为1.74 mm3（基于相应未处理投影数据的统计结果为1057个胰岛，总体积为1.77 mm3）。D和E，对照组（D）与2型糖尿病ob/ob小鼠模型12在6月龄时应用CLAHE协议获得的示例数据（E）。注意ob/ob小鼠胰腺中胰岛尺寸显著普遍增大（E）。图（D）和（E）中胰腺轮廓（灰色）基于组织自发荧光信号生成。C图中的比例尺在A-C中代表500 μm。C"图中的比例尺在C'和C''中代表200 μm。E图中的比例尺在（D）和（E）中代表1 mm。图（A-C）改编自Hörnblad et al3，使用Bioptonics 3001扫描仪生成。
<img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="加工件尺寸；金属部件，测量示意图；工程图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 用于固定OPT样本的样本夹持器。 通过法兰上的预钻孔将针插入琼脂糖间隔层中，从而固定样本。夹持器底部装有强磁铁，可与步进电机铰接。该装置避免了使用不稳定的胶水，防止扫描过程中样本发生不必要的移动。

我们描述了光学投影断层成像技术（optical projection tomography, OPT）1 在近红外光谱成像中的改进，以及多种计算工具的应用。这些方案能够对较大样本中的胰腺β细胞质量（BCM）进行评估，提升该技术的多通道成像能力，并提高OPT数据的质量。

通过改进光学投影断层成像技术（OPT）以具备近红外（NIR）光谱成像能力，我们在此展示了对较大生物样本进行成像的可能性……

本实验的总体目标是利用光学投影断层成像技术，对啮齿类动物胰腺或含有胰岛移植组织的样本中的β细胞质量分布进行评估。通过使用近红外光谱，可实现对较大样本的研究，并能够同时可视化观察相互作用或邻近的细胞类型。该技术依赖于配备近红外敏感相机、高功率光源以及合适滤光片组的光学投影断层扫描仪（OPT扫描仪）来实现。首先分离样本，固定后进行激素免疫染色，然后将其包埋于 aros 中并进行光学透明化处理。随后将样本固定在定制的样品 holder 上。使用半自动定位工具确保扫描后样本在扫描仪中正确居中。如有需要，可对投影图像进行后期处理，以校正由机械装置引入的伪影。采用均衡化算法以增强低强度物体的检测效果。最后，利用图像处理软件进行分割、可视化及定量分析。产生胰岛素的β细胞在维持血糖稳态中发挥关键作用。因此，对胰腺β细胞质量分布进行空间和定量评估是糖尿病研究多个领域的重要基础。在本视频方案中，我们描述了一种光学投影断层成像技术（OPT）的改进方法，该方法可实现近红外范围内的成像，从而有望对更大体积的胰腺组织进行成像。它还使得在单个样本中能够研究更广泛的细胞类型。我们进一步提供了一系列计算工具，这些工具经过优化，可用于胰腺成像以及β细胞质量的评估。特别是，近红外光谱是光在组织中穿透的最佳波段。为了在O PT成像中获取该光谱范围的数据，我们对Sharpen同事最初描述的OPT扫描仪进行了多项改进，用于小鼠胰腺中β细胞质量的单次SH评估。我们常规使用Omic 3001扫描仪。激发光由金属卤素灯提供，其在约650纳米波长处的激发能量高于汞弧灯。光线首先通过液体光导，然后穿过激发滤光片。本方案中使用的滤光片如本表所示，用于评估通道分离抗体。与不同Alexa荧光染料偶联的抗体被固定在蛋白微球上，并嵌入琼脂仿体的不同层面中。图像表明不同通道之间不存在串色现象。发射光由背照式CCD相机检测，该相机在近红外光谱范围内具有高量子效率。为了便于对较大样品进行成像，通过在扫描仪中集成更大的反射镜和vete，扩大了视场。如上所示，位于样本上方的装置是步进电机，用于在扫描过程中旋转样本。扫描期间，由基于LabVIEW的程序控制相机和步进电机。采集胰腺组织后立即置于冰上预冷的PBS中，以防止蛋白质降解。仔细去除周围可能干扰染色和扫描过程的脂肪和膜结构。在4°C条件下，使用4% PFA固定样本2至3小时。为避免胰腺在折叠状态下被稳定，可在固定期间将其喷入培养皿中，以便在全组织免疫染色前展开；随后用过量PBS洗涤胰腺。该染色步骤此前已用于评估β细胞质量分布。我们常规依赖猪肾、抗胰岛素一抗以及 Alexa Fluor 标记的二抗进行染色。分离胰腺的三个主要叶。这有助于对各叶进行比较评估，并允许在更高放大倍数下进行扫描。用水冲洗胰腺，并将其浸泡在琼脂中以去除任何气泡。将胰腺包埋于1.5%低熔点琼脂中，并置于冰上直至凝固。切开琼脂块，封闭胰腺。确保样本与琼脂块底部之间留出约一厘米的间隔。该间隔对于将样本固定到样品 holder 中是必需的。在使用B透明溶液（也称为Maurice.Clear）进行光学透明处理之前，先用100%甲醇对胰腺进行脱水处理。将样本透明化至透明状态。由于B溶液会溶解大多数塑料，建议使用玻璃瓶。更换几次 B 溶液以彻底去除甲醇残留。现在样品已准备好进行扫描。扫描过程中，样品由连接在步进推进器上的磁铁带动移动。这允许样品沿其 X 轴和设定轴滑动，从而便于扫描前对样本进行对齐。在大多数 OPT 方案中，RO 块被粘接到样品 holder 上，但大多数胶水会溶解灯泡，这可能导致样品发生不期望的移动。因此，设计了一种无需使用胶水的 holder。将透明样品置于样品 holder 中，并通过导引 holder 法兰上预钻孔的两个针头轻轻插入以固定样品。将样品放入扫描仪中，并浸入 BAB 溶液中。图中所示为基于 LabVIEW 的软件图形用户界面，用于控制相机曝光时间、步进驱动器，并输入实验参数以记录到日志文件中，例如放大倍数等参数。在显微镜上手动进行焦点调节和滤光片组更换。选择放大倍数后停止。使用GFP滤光片照射样本，并通过实验室专用软件显示预览图像。旋转样本以找到其最宽的部分；在比较一系列胰腺样本时，需对所有样本使用相同的放大倍数。该因素应基于系列中较大的样本设定。接着，切换至显示特定信号的滤光片组，并调节焦距。注意，曝光时间应选择为在不使样本任何部分达到饱和的前提下，尽可能获得最高的信噪比。对于胰岛β细胞质量的评估，通常将整个样本作为感兴趣区域，因此应精确地将样本的质心（com）置于其旋转轴上，以获得最佳结果。commar算法可计算样本的质心，并提供一幅参考图像，有助于将质心对准旋转轴。为计算 X 坐标，首先在 0 度位置获取 GFP 通道的图像快照。然后切换滤光片，在相同位置获取特异性信号的图像快照。接着，对 GFP 图像应用期望最大化算法以分割出感兴趣区域，对分割后的图像进行质心计算，并在特异性信号图像上叠加一条通过所确定质心点的垂直线。对样品旋转90度后的图像重复上述步骤，以计算Z坐标。最后，利用所获取的图像中界定出的质心点作为参考，移动样品，使视野的中心线通过所确定的样品质心点。当扫描完成后，会为投影图像分配一个后对齐值，以在重建前微调图像沿旋转轴方向的位置。然而，相机相对于光轴的角度存在微小偏差时，会在重建过程中引起几何畸变。为避免此类畸变，在扫描样本后需采用基于离散自由变换的对齐方法——FDA。从数据集中提取两个投影图像以计算 FDA。这些投影分别为零度时的特异性信号 F 和 180 度时的特异性信号 G。图像 D 经过转置处理，使其方向与 F 保持一致。利用 DFT 函数在整幅图像中对来自两个投影的八像素高度的区块进行配准，并沿 X 轴测量位移，以计算所需的旋转角度，并重复使用相同的参数来校正通过同一扫描获取的所有通道。有关 COMMAR 和 FTA 算法基础的更多详细信息，可参见 AL，以促进 iLet 分割。对投影图像应用了带对比度限制的自适应直方图均衡化算法。在本方案中，使用了 MATLAB 内置函数 adapt hiss egg，并采用默认的剪切限值 0.01 和 256 级灰度。然而，最佳的 tile 尺寸需要通过实验进行测试，且可能因所分析的样本不同而有所变化。有关该算法的更多详细信息和示例，可参见 home blood 和 shadow。添加后，经过配准校正和归一化的数据现在可重建为断层扫描切片。为了可视化和量化所获得的虚拟切片堆栈，可使用合适的图像处理软件（如 S 或 velocity）生成三维等值面。该图展示了一个胰腺叶的单个投影图像，其中使用包含 Alexa Fluor 488、594、680 和 750 的荧光染料标记的二抗混合物对胰岛素进行染色。随着我们向光谱的近红外区域移动，信号与背景噪声比显著提高。此图进一步说明了这一点，显示了通过获取更宽光谱范围，每个信号通道的平均信噪比情况。近红外光学投影断层成像技术扩大了单个样本中可分析的细胞类型范围。本视频展示了1型糖尿病非肥胖糖尿病小鼠模型的胰腺组织。在视频中，产生胰岛素的朗格汉斯岛呈蓝色，表达平滑肌α-肌动蛋白的血管呈红色，而CD3标记的浸润性T淋巴细胞也可见。基于内源性组织自发荧光，利用近红外光在组织中更强的穿透能力，重建出灰色背景下的绿色茶碱实质。光学投影断层成像（O PT）技术使得对更大样本中β细胞质量分布的评估成为可能。该图显示了使用ER erdi six 80作为二抗标记胰岛素后，SER肥胖大鼠脾叶中胰岛分布的ISO表面重建图像。显示了一个小鼠脾脏球状结构以供精确定位。这些图像对应于单个胰腺球状结构中β细胞团分布的两种不同等值面重建：绿色显示的是未经爪状处理的酸性区域，红色显示的是应用算法后的结果。通过叠加这两种重建图像，可以证明爪状处理有助于对低信号强度的胰岛进行分割。这些仅在叠加图像中显示为红色。我们刚刚向您展示了如何提取整个神经胰腺体积中β细胞团的空间和定量信息，直至朗格汉斯岛单个胰岛的水平。这些方案不仅限于对β细胞或胰腺的评估，在接近受损的OPT情况下，所介绍的计算工具也应可应用于其他研究领域。祝你好运。祝你的实验顺利。

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