Name: 당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 18 s
Description: 배우세요 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영법을 활용한 췌장 β-세포 질량 분포 분석 기법입니다. 계산 도구를 활용하여 대형 조직의 고해상도 이미징과 다중 채널 데이터 품질을 향상시키는 방법을 익히세요.

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박사 P.의 Lindström는 OB / OB 쥐를 제공하기 위해 인정하고 있습니다. J. Lehtonen는 편집에 도움 비디오 제작 및 J. 길버트와 도움을 인정합니다. (JS와 :이 연구는 당뇨병 연구소 재단 (AP), 아동 당뇨병 연구 재단 (AP 및 UA), 유럽위원회 (European Commission) (. CP-IP 228933-2 FP-7, 아니 부여 계약)의 보조금에 의해 지원되었다 UA), Kempe 재단, Umeå 대학과 UA로 스웨덴 연구 협의회

1. 샘플 준비 및 스캐닝 1.1 샘플 준비 이전 7에 설명 된대로 다음 절차는 본질적으로 수행됩니다. <ol><li> 췌장 수확. proteolytic 저하를 방지하기 위해 얼음처럼 차가운 PBS를 사용합니다. </li><li> 2-3 시간을위한 얼음에 PBS에서 4% PFA의 조직을 수정합니다. 엽이 고정에서 &quot;분산&quot;되어 있는지 확인하십시오. 이 재건 한 후 해부학 적 랜드 마크의 식별을 용이하게합니다. </li><li> 30 분에 초과 PBS에 씻으십시오. </li><li> 메탄올의 stepwise 췌장 (33, 66 %, 100 %), 15 분 / 단계를 탈수. 이 (단계 5 참조) 표백하는 동안 거품의 형성을 최소화하고 (7 단계 참조) 냉동 해동시 세포 파괴를 방지 할 수 있습니다. </li><li> H 2 O 2 : : DMSO는 내생 조직 형광을 해소하기 위해 24 시간에 대한 RT에서 2시 1분 3초 비율 버퍼를 표백 신선하게 조리 된 MeOH의 조직을 배양. 새로운 bleachi에 큰 샘플, 교류를위한또 다른 24 시간을위한 것이다 버퍼와 품다. </li><li> ON, 초과 MeOH에 씻으십시오. </li><li> -80에서 적어도 5주기위한 냉동 해동 ° C - RT 항체 침투를 촉진합니다. </li><li> TBST (33, 66 %, 100 %), 15 분 / 단계로 stepwise을 Rehydrate. </li><li> RT에서 12-24 시간 10 % 혈청 (바람직 보조 항체가 생성 된에서 동일한 종), 5 % DMSO와 0.01 % NaAz과 TBST에서 차단 </li><li> RT에서 48 시간에 대한 버퍼를 차단에 차 항체와 함께 배양, 큰 샘플 (여기서 사용하는 항체는 시약의 테이블에 나열되어 있습니다) 72 시간에 연장된다. </li><li> ON, 초과 TBST에 씻으십시오. </li><li> 48 시간에 휘황 복합 차 항체와 함께 배양, RT에서 큰 샘플 72 시간으로 연장된다. </li><li> ON, 초과 TBST에 씻으십시오. </li></ol> 1.2 다음 절차는 (그림 7 참조 아가로 오스에있는 샘플을 탑재하고 맞춤 제작 샘플 홀더에 첨부하는 방법에 대해 설명합니다) 스캔을 선택을 취소하기 전에. <ol><li> Hörnblad 외 3 3A 그림에 따라, 지라 십이지장과 위의 엽 (叶)을 분리합니다. 엽 사이의 관계는 더욱 Hörnblad 외 11 명확히하고 있습니다. </li><li> 1.5 % (w / V) DH 2 O, 필터의 낮은 녹는 온도 아가로 오스를 준비, 37로 냉각 할 수 있도록 ° C와 세제를 씻어과 얼음에 아가로 오스 - 삽입하기 전에 거품을 제거 할 DH 2 O의 조직을 씻어. </li><li> 샘플을 둘러싸고 아가로 오스 블록을 잘라서 샘플 및 아가로 오스의 기초 사이에 ~ 1cm 스페이서를 두십시오. 빛의 분산을 줄이기 위해 아가로 오스 블록의 날카로운 가장자리를 (≤ 90 °) 트림. </li><li> 시간이 각 단계 사이에 평형 수 있도록 MeOH (33, 66 %, 100 %)에서 stepwise 샘플을 탈수. 표본이 느낄 때 그것은 equilibrated로 간주됩니다. </li><li> 벤질 벤츠 : 벤질 알코올의 1시 2분 솔루션에 샘플을 지우기oate은 (BABB)는 투명해질 때까지. 추가 12 시간에 대한 Exchange BABB 솔루션과 품다. </li><li> 샘플 홀더에 지워 샘플을 배치하고 소유자의 플랜지에있는 교련 구멍을 통해 아가로 오스 스페이서를 통해 두 바늘을 삽입하여 고정하십시오. </li><li> BABB 소요되는 솔루션으로 가득한 큐벳에 스캐너 및 잠수함 거기에 샘플을 배치합니다. pancreata 일련의를 비교하면 동일한 배율은 모든 검사에 사용되어야합니다. 배율은 시리즈 최대 규모의 샘플에 최적화해야합니다. </li></ol> AR의 표본 1.3 위치 다음 프로토콜은 정확하게 COM-AR 알고리즘을 사용하여 샘​​플을 배치 할 수있는 절차에 대해 설명합니다. 투자 수익 (ROI)는 전체 표본을 포함하고있는 경우이 절차에만 적용 할 수 있습니다. 알고리즘에 대한 자세한 설명을 보려면 Cheddad 외 2 참조하시기 바랍니다. <ol><li> 봇 두 위치에서 시료의 이미지를 취득H 해부학 및 신호 채널. 가장 큰 프로젝션 공간과 90 ° (Z-축과 관련된)에서 2 순위를 표시하는 0 ° (X-축과 관련된)에 위치 1. 우리는 해부학을 시각화하기 위해 GFP 채널을 사용하고 있습니다. </li><li> 임계 투자 수익 (ROI)을에 해부학 적 이미지에 기대 - 극대화 (EM) 알고리즘을 적용합니다. </li><li> 0 °와 90 °의 계획 모두 2 단계에서 얻은 바이너리 이미지의 COM 포인트를 (X-좌표) 계산합니다. </li><li> 0 °와 신호 채널의 90 ° 이미지에 대한 3 단계에서 계산 확인 된 COM 포인트를 통과 수직선을 비교하십시오. </li><li> 참조 시야의 중심 라인은 샘플의 발견 COM 포인트 통과 수 있도록 샘플을 이동하는 등 4 단계에서 획득 한 이미지를 사용합니다. </li></ol> 1.4 스캐닝 <ol><li> satura 않고 가능한 잡음 비율이 가장 높은 신호를 달성하기 위해 노출 시간을 조정투영 이미지 팅은 어떤 공간을 갖추고 있습니다. 스캔 할 모든 채널에 대해 반복합니다. </li><li> 스캔 할 첫 번째 형광 채널에 대한 필터 설정을 선택합니다. 짧은 λ의 fluorophores에서 배출 더 λ와 fluorophores을 자극함으로써 사진 표백 원인이 될 수 있습니다. 이러한 가능성을 최소화하려면 먼저 긴 여기 λ와 형광를 스캔합니다. </li><li> 샘플을 조명하고 각 채널에 대한 수직 축을 따라 샘플을 회전, 360 ° 이상의 형광 신호를 수집하기 위해 셔터를 엽니 다. NIR-OPT 설정에 사용되는 단계 각도가 0.9입니다 °와 Bioptonics 3001 스캐너 0.45 °에. </li><li> 다음 채널에 대한 적절한 필터를 선택하고 위 진행합니다. </li></ol> 2. 전산 처리 및 재건 2.1 포스트 수집 misalignment 감지 및 수정 (A-값 조정) 프로젝션 단층 촬영에서는 일반적으로 필요합니다이전 재건에 회전 축을 따라 세부적으로 조정할 이미지의 위치로 예상에 후 정렬 값을 지정합니다. 그러나, 광학 축에 대한 카메라의 각도의 작은 수차 샘플의 길이를 따라 비 균일 A-값을 일으킬 수 있으며 따라서 기하학적 왜곡을 유도. 이러한 왜곡을 방지하기 위해 전체 표본을 통해 정확하고 통일 후 정렬 값 (A-값) 찾을 수 계산 방법 2를 적용 할 수 있습니다. <ol><li> 8 픽셀 높이 블록에 0에서 특정 신호의 예측 °와 180 °를 나누어 각 블록 사이의 X-축을 따라 이동합니다 (A-값) 계산하는 변형 이산 푸리에을 사용합니다. </li><li> 표본의 길이를 따라 X 축 교대의 경사를 설명 각도 θ &#39;을 계산하는 데 도움이, 그리고 회전 중심점을 찾기 위해 선형 최소 제곱 회귀을 적용합니다. </li><li> 모든 proje을 돌려 스캔하는 동안 misalignments에 대한 수정회전 중심점 주변의 ctions θ &#39;/ 2. </li></ol> 2.2 대비 제한된 적응 히스토그램 균등화 (CLAHE) 재건 및 / 또는 정량 평가에 대한 세분화하는 동안 &quot;아웃 thresholded&quot;할 위험이 아주 약한 신호를 전시 개체 (섬)의 탐지 및 세분화를 촉진하기 위해, CLAHE 알고리즘은 투영 이미지에 적용 할 수 있습니다. CLAHE 작업은 크게 두 강도 변환을 수행 : <ol><li> 지역 대비는 추정하고 투영 이미지의 겹치지 않는 블록 내에 관측소입니다. </li><li> 농도는 다음 쌍 선형 보간을 통해 블록 사이의 국경 지역에서 표준화되어 있습니다. </li></ol> 이름 대비 - 제한은 이미지에 포화 픽셀을 방지하도록 설정되어 클립 한도를 의미합니다. 이 프로토콜에서 MATLAB은 내장 기능 &quot;adapthisteq은&quot;기본 C와 함께 사용하고 적용<html> 0.01의 입술 제한 및 256의 타일 크기입니다. 참고 최적의 타일 크기는 경험적으로 테스트하고 분석 표본에 따라 달라질 수 있어야합니다. 알고리즘 및 예제에 대한 자세한 내용은 Hörnblad 외 3에서 찾을 수 있습니다. 참고! 위에서 열거 한 연산 처리 단계 표준 알고리즘을 기반으로하고 MATLAB (Mathworks)에서 실행됩니다 (COM-AR, A-값 조정 및 CLAHE 포함이 1.3-2.2 참조). 2.3 단층 재건 및 ISO 표면 렌더링 <ol><li> 필터링 백 프로젝션 알고리즘 사용하여 해결하고 표준화 된 이미지가 통일 misalignment 보상 및 동적 범위의 최적화를위한 최소한의 요건을 복원 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 모든 reconstructions는 NRecon 소프트웨어 (Skyscan), 버전 1.6.8 (에서 사용할 수있는 필터링 다시 투영 방법을 사용하여 수행됩니다= &quot;_blank&quot;&gt; http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). 병렬 빔 형상은 이미지 설정에서 구현되지 않는 참고 이미징 객체의 배율은 렌즈의 초점에서의 거리에 따라 달라집니다. 따라서 NRecon 소프트웨어에 투영 데이터 세트를 가져올 때 그것은 첨부에 소스 거리 (mm) 및 스캐너의 회전 방향 (반대 방향 입력 &quot;참조&quot;및 방향 입력 &quot;CW&quot;에 대한)에 올바른 개체를 포함하는 것이 중요합니다 재건하는 동안 콘 빔 유도 유물을 피하기 위해, 파일을 기록합니다. </li><li> 획득 가상 섹션의 스택을 시각화하고 정량화하기 위해 Imaris 또는 Volocity 등 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 3D ISO-표면을 생성합니다. </li></ol> 손쥐 작은 섬 절연 및 이식 절차를 검토 프로토콜 아래의 당뇨병 연구소의 잠복기 세포 처리 및 병진 모델 코어에​​서 수행하고 Miam 대학에 의해 승인되었습니다전 기관 동물 케어 및 사용위원회. 동물 연구 윤리위원회, 북부 스웨덴, 동물을 포함한 다른 모든 실험을 승인했습니다.

<ol><li>Sharpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+Assisted+Algorithms+for+Optical+Projection+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Med.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).</li>
<li>Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+optical+projection+tomography+imaging+reveals+lobular+heterogeneities+in+pancreatic+islet+and+beta-cell+mass+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution.</a> Islets. 3, 204-208 (2011).</li>
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<li>Ahlgren, U., Gotthardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+imaging+islets%3A+recent+advances+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).</li>
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<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54, 133-137 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

OPT 이미지에 대한 설명 기술 손쥐 췌장의 볼륨을 통해 공간 및 정량 매개 변수 추출 할 수 있습니다. mesoscopic 이미지 그것의 유형에 달성 해상도의 제한으로 인해 주목해야한다, 대부분의 이미징 modalities뿐, 큰 표본 낮은 해상도 (높은 해상도 CCD의 사용 OPT 스캔의 해상도를 증가해야하지만) . 따라서, 손상 췌장 마우스 엽의 평가에 대해, 현재의 기술은 비록 가까이 (약 15-20 μm) 7 단세포 해상도를 제공하지 않습니다. 하지만, 마우스 췌장에서 BCM 분포의 추출을위한 프로토콜은 잘 morphometry 3,13를 계산 예를 들어 포인트 획득 일치 이상 이것은 주목해야하는 데이터를 제공 한 CLAHE 프로토콜의 구현은 훨씬 더 많은 섬의 검출이 가능하지만, 이 섬은 일반적으로 작은 및 contribu하지테는 실질적으로 전체 β-세포 볼륨합니다. 참여 immunohistochemical 프로토콜 (최대 2 주) 비교적 긴하지만, 표본 준비 시간에 실제 손은 짧고 따라서 기술이 잘 동물 9 큰 무리들이 연구에 적합이다. heterogenic 유통 패턴의 가능성이 조사를 위해 초점을 경우, 그 치료는 고정에 관한 및 췌장 조직이 불리한 방식으로 고정되고, 평면 ( &quot;분산&quot;라고 방지하기 위해 설치 단계에서 촬영해야한다고 강조한다 조직의) 마운트는 이러한 평가를 용이하게 할 수 있도록 노력하여야한다. OPT를 수행 중요한 문제는 샘플의 COM은 회전 축에 고정하고 스캐닝 절차를 수행하는 동안, 각 수직 또는 수평으로 움직이지 않는 점이다. 따라서이 attachi을위한 안정적인 기계 설치 및 잘 작동 시스템을 가지고 필수적입니다NG 샘플. 우리는 새로운 마운트 (그림 7)를 구성하여이 문제를 해결. 병렬 구조는 우리 NIR-OPT 또는 뒷면과 기록 투영 이미지의 주변 물체의 앞에 위치 사이의 수직 변화로 감지되었습니다 Bioptonics 3001 스캐너에 대해 사실이 아닌. (2.3.1 참조) 각 스캐너의 로그 파일에 소스 거리에 객체를 조정함으로써 우리는 크게 우리의 데이터의 품질을 향상시킬 수 있으며 특히 중요하다 투영 이미지의 맨 가장자리에 기하학적 왜곡에 대한 수정하면 큰 표본을 평가. 현재 프로토콜에서 우리는 세 가지 특정 채널과 그대로 췌장 준비를 평가에 &quot;해부학&quot;채널의 시각화를 허용 필터 세트의 제안을 제공합니다. 분명히 이러한 설정은 fluores 모든 형태의과 마찬가지로 더 나은 비록 주어진 연구에 활용 fluorochromes에 맞게 조절 될 수센트 현미경은 신호 블리드 - 스루의 가능성 위험을주의 깊게 평가해야합니다. 750 나노 미터보다 기쁘게 생각합니다 fluorochromes과 인슐린이라는 섬의 연구는 아직 우리의 세트가 활용되는 금속 할로겐화물 램프를 사용하여 당사 수 없었습니다. 그것은 다른 광원 (예 : 다이오드 레이저)와 함께 해당 파장에서 더 높은 양자 효율 카메라가 더 NIR-OPT의 가능성을 높이고 더 높은 파장에서 이미징 할 수 있도록 수 수 있습니다. OPT 영상은 mm-cm 규모의 생물 의학 표본의 공간 및 정량 평가를위한 매우 다양한 기술입니다. 여기에 제시된 프로토콜 췌장 / 당뇨병 연구의 주요 목적으로 개발되었습니다 있지만 그들은 다른 종, 표본 유형 및 마커에 대한 연구로 번역 할 수 있어야한다. NIR-OPT 이미지 F, 그대로 췌장 준비에서 여러 별개의 채널을 시각화 할 수있는 가능성으로urther은 오래 대비 에이전트도 OPT에 의해 감지 형광를 운반하도록 설계 할 수 다른 이미징 modalities에 의해 비 침습적 평가를위한 대비 요원의 이해 특이성을 평가하는 도구로 잠재력을 보유하고 있습니다.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

β-세포를 생산 인슐린은 혈당 항상성을 제어 할 수있는 신체의 능력에 대한 열쇠입니다. 따라서 췌장 BCM 분포의 평가는 사전 임상 당뇨병 연구의 여러 분야에 필수적입니다. 예를 들어, 치료 정권의 평가에서, 질병에 대한 쥐 모델에서 내분비 세포 분화 또는 당뇨병 aetiology 연구에 타겟팅 된 유전자 절제의 영향은 종종 이러한 분석에 따라 달라집니다. 전통적으로, 평가 이러한 종류의 크기와 췌장의 복잡한 해부학 적 헌법으로 인해 수행하기 어려운 시간이 소요 stereological 접근 방법에 의존하고 있습니다. 현재의 대부분의 고해상도 이미징 방법은 (일반적으로 광학), 설치류에서 전체 췌장 이미징을 허용하기에 충분한 침투 깊이를 제공하지 않습니다. 반대로, 자신의 침투 깊이 (일반적으로 핵)에 의해 제한되지 않습니다 이미징 접근 방식은 전체 BCM 분포를 해결하기 위해 가난한 해상도로 제공하고 방해4,5 적절한 대비 요원의 부족에 의해. 광학 프로젝션 단층 촬영은 cm 규모 6 mm에 생명 표본의 고해상도 평가를 수있는 3D 영상 양상이다. 이에, 공간적 위치와 Langerhans의 섬을 표현 개인 인슐린의 볼륨에 대한 정보는 정상과 당뇨병 생쥐 3,7-10에서 췌장의 볼륨에 걸쳐 추출 할 수 있습니다. 현재 연구의 목적은 더 췌장 β-세포의 평가를위한이 기술의 능력을 향상하는 것입니다, 다른 조직, 다른 췌장 성분 (예 : 셀 형식을 침투 등)과의 관계에 대형의 이식의 내생 배포, 이전에 가능한 것 췌장 준비. 가까운 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 (NIR-OPT) 설치 프로토콜, 최대 샤프에 의해 설명 원본 설정에 따라 OPT 스캐너 아래에서 <e가까운 적외선 범위에서 영상에 적응 m&gt; 외 1, 설명 및 사용됩니다. 마우스 췌장 (BCM의 예)의 단일 채널 평가를 들어, SkyScan 3001 (Bioptonics) 스캐너를 사용할 수 있습니다. 650nm 위의 파장에서 수은 아크 램프보다 높은 여기 에너지를 제공하는 금속 할로겐화물 램프는 여기 빛을 공급하고 있습니다. 빛이 액체 빛이 가이드를 통해 전송됩니다. fluorochromes 및 NIR 형광 이미징 및 채널 분리 밴드 패스 필터의 유용한 조합은 그림 3에 표시됩니다. 방출 빛이 NIR 스펙트럼에서 높은 양자 효율, 다시 조명 CCD 카메라로 검출된다. OPT 스캔은 카메라를 제어 LabView 플랫폼 및 스테퍼 모터를 사용하여 자동화되어 있습니다. 그대로 쥐 pancreata, 보호 코팅은 거울 및 대형 큐벳의 크기 샘플을 지원하는 것은 사용됩니다. 마지막으로, 샘플 홀더 원치 않는 수직 movemen을 제거 그스캔하는 동안 샘플의 TS가 설계되었습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 메타놀 </td><td> Scharlau </td><td> ME03162500 </td><td></td></tr><tr><td> 30% H 2 O 2 </td><td> Scharlau </td><td> HI01362500 </td><td></td></tr><tr><td> 벤질 알코올 </td><td> Scharlau </td><td> AL01611000 </td><td></td></tr><tr><td> 벤질 벤조산 </td><td> Scharlau </td><td> BE01851000 </td><td></td></tr><tr><td> 저 meltingpoint 아가로 오스 </td><td> LONZA </td><td> 50,100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (PFA) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 158127 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D5879 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 - X100 </td><td&gt; 시그마 - 알드리치 </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 방지 aSMA-Cy3 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C6198 </td><td> 기본 항체 </td></tr><tr><td> 토끼 반에는 3 번 CD </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C7930 </td><td> 기본 항체 </td></tr><tr><td> 기니 돼지 방지 기능 </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td> 기본 항체 </td></tr><tr><td> 당나귀 반 GP-IRDye680 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32421 </td><td> 차 항체 </td></tr><tr><td> 염소 안티 RB-DyeLight750 </td><td> 열 과학 </td><td> 35,570 </td><td> 차 항체 </td></tr><tr><td> 염소 안티 GP-Alexa594 </td><td> 분자 프로브 </td><td> A-11076 </td><td> 차 항체 </td></tr><tr><td> 염소 안티 GP-Alexa488 </td><td> 분자 프로브 </td><td> A-11008 </td><td> 차 항체 </td></tr><tr><td> 염소 항GP-Alexa594 </td><td> 분자 프로브 </td><td> A-11012 </td><td> 차 항체 </td></tr><tr><td> 염소 안티 GP-Alexa680 </td><td> 분자 프로브 </td><td> A-21076 </td><td> 차 항체 </td></tr><tr><td> 염소 안티 GP-Alexa750 </td><td> 분자 프로브 </td><td> A-21039 </td><td> 차 항체 </td></tr><tr><td> OPT Skyscan 3001 </td><td> Bioptonics </td><td></td><td> OPT-스캐너 </td></tr><tr><td> Leica MZ FLIII </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td></td><td> Stereomicroscope </td></tr><tr><td> Leica 목표 0.5x </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> 10446157 </td><td></td></tr><tr><td> Leica 카메라 어댑터 1.0x </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> 10445930 </td><td></td></tr><tr><td> 할로겐화물 EL6000 금속 </td><td></td><td> 11504115 </td><td> Lightsource </td></tr><tr><td> 액체 라이트 가이드 </TD&gt; <td></td><td> 11504116 </td><td></td></tr><tr><td> 큐벳 </td><td> Hellma 웹 로그 분석 </td><td> 6030-OG </td><td> 55 X 55 X 52.5 mm </td></tr><tr><td> 거울 </td><td> 에드먼드 광학 </td><td> F68-334 </td><td> 50 X 50mm </td></tr><tr><td> ANDOR 상-M </td><td> ANDOR 기술 </td><td> DU934N-BV </td><td> 백 조명 CCD </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> 크로마 기술 </td><td> 41021 - MZFLIII </td><td> TXR, 알렉사 - 594, Cy3 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> 크로마 기술 </td><td> 41022 - MZFLIII </td><td> IRDye680, 알렉사-680 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> 크로마 기술 </td><td> 49037 - MZFLIII </td><td> Dylight750, 알렉사 - 750 </td></tr><tr><td> ProteinG - 세 파로스 비즈 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-0618-01 </td><td> 단백질 G 세 파로스 4 빠른 흐름 </td></tr><tr><td> 나트륨 Azide </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 08,591 </td><td> 나트륨 azide 0.1 M 솔루션 </td></tr></tbody></table>

당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

가까운 적외선 (NIR) 스펙트럼 이미징의 기능을 포함 OPT을 조절함으로써, 우리는 여기서 이러한 쥐의 췌장 등의 췌장 조직의 이미지를 큰 기관에 가능성을 설명하고, 채널의 수 (셀 유형) 5 월을 높이기 위해 단일 표본에서 공부합니다. , 게시물에 대한 2 / 개선 알고리즘 표본의 (우리의 경우에 췌장) 회전 축에서 질량 중심 (COM) (AR) 2의 1 / 정확한 위치 : 우리는 더 이상 제공 계산 도구의 숫자의 구현을 설명 - 정렬 단층 재건 2, 3 / OPT 기반 BCM의 결정 3 노이즈 비율로 신호를 높이기 위해 강도 균등화를위한 프로토콜 동안 기하학적 왜곡을 방지 튜닝. 또한, 우리는 이미지 수집하는 동안 표본의 의도 움직임에 대한 위험을 최소화 샘플 홀더를 설명합니다. 함께,이 프로토콜은 BCM 유통 및 oth의 평가를 가능하게어 기능 Langerhans의 개별 섬의 수준에 해상도로, 그대로 pancreata 또는 다른 장기 (췌장 이식의 연구에 등)의 볼륨을 통해 다운을 수행 할 수합니다.

현재 보고서에서 우리는 추출 및 NIR-OPT (그림 1)를 사용하여 쥐 pancreata의 BCM 데이터 (및 기타 조직)의 전산 처리를위한 프로토콜을 설명합니다. 그림 2에 도시 된 바와 같이, 췌장 표본에서 조직 autofluorescense대로 현저하게 NIR 스펙트럼에 감소 것으로 예상된다. Langerhans의 인슐린이라는 섬의 평가에 대한 비율 :이 소음에 대한 평균 신호 크게 증가 (N S)로 연결됩니다. 본 문서에 설명 된 스펙트럼의 NIR 부분의 이미지에 OPT의 적응으로 적어도 세 특정 채널이 충분한 S와 시각화 할 수 있습니다 : N 비율 뚜렷한와 손쥐 췌장의 볼륨을 통해 항체이라는 세포 유형의 평가를 사용하도록 설정 채널 분리 (그림 3과 4 참조). diabetogenic 프로세스 및 / 또는 일반적으로 BCM 평가 이미징에 적용, 기술은 따라서의 시각화 및 정량화이 가능주변 및 / 또는 세포 유형을 (그림 4 참조) 상호 작용에 관련된 인슐린 긍정적 인 부분입니다. 이러한 평가는 마우스 대응 (그림 5 참조)보다 3-5 배 큰 쥐 췌장 등의 이전보다 훨씬 더 큰 표본에 수행 할 수 NIR 범위에서 얻어진 증가 조직 침투 깊이 덕분에 있습니다. 에 관계없이 표시 또는 NIR 파장이 활용 여부, CLAHE의 구현은 크게 기술의 검출 감도 (그림 6 참조)를 증가시켜 다른 기원의 및 생리적 조건 중 BCM의 기반 평가를 선택 촉진 할 수 있습니다. 개발 된 샘플 홀더에 대한 청사진은 그림 7에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 흐름도는 mur의 BCM의 OPT 기반 분석을위한 중요한 단계를 묘사오프라인 췌장. 일반적인 마우스의 췌장을 평가하는 데 필요한 시간은 13~14일입니다. 스캔의 길이가 필요한 노출 시간 (일반적으로 약 1 시간)에 의존하는 반면 대부분의 시간은 조직 처리 및 immunohistochemical 얼룩 (10 일) 동안 소비되고, 조직 개간은 약 이일이 필요합니다. 이후 계산 처리는 일반적으로 하루 이내에 수행됩니다. 참고 상대적으로 긴 얼룩 프로토콜은 이상적 표본의 큰 양의 일괄 처리에 적합합니다. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" /> 그림 2. 다른 파장의 BCM 평가에 대한 잡음 비율로 신호. 인슐린와 fluorochrome - 복합 이차 항체의 칵테일 (알렉사 488, 594, 680 및 물들 마우스 십이지장 췌장 기억 상실증에 걸린,다른 파장의 N 비율 : 750), S를 결정하는 데 사용되었다. A, 이미지는 각 신호 채널에 대한 첫 번째 투영 프레임을 보여줍니다. 각 신호 채널 N : 평균 S를 설명하는 B, 그래프. 비율은 배경 강도 (exocrine 세포의 내생 조직 형광)로 나누어 평균 작은 섬 강도 (215 섬에 따라)으로 결정됩니다. C, S를 표시 그래프 : N 알렉사 594 채널 획득 : S로 표준화 각 채널의 개별 섬에 대한 N 비율. 방법 중 하나 ANOVA는 통계 분석에 사용되었다. 유의 수준은 ** P &lt;0.01에 해당하는 지적했다. (A) 1mm에 해당하는의 스케일 바는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg"/> 그림3. 채널 분리는.이 표에 나와있는 Alexafluor 염료와 복합 차 항체는 proteinG - 세 파로스 구슬에 별도로 고정되었다. B, 형광 구슬 그런 다음 아가로 오스 팬텀의 여러 영역에서 임베디드 및 지정된 필터를 사용하여 이미지로 하였다. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="그림 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg"/> 4 그림. 당뇨병 연구에 기반 다중 채널 이미지를 선택합니다. A, OPT는 비 비만 당뇨병 (NOD) 제 1 형 당뇨병에 대한 모델에서 췌장 (12 주, 십이지장 엽)의 ISO-표면 재건을 기반으로. 평활근 α-고를 (혈관, 붉은 색)과 3 번 CD (T-림프구에 침투, 녹색), 표본은 인슐린 (췌장 β-세포, 의사 색 파란색)에 얼룩이 있습니다. 사용하는 해당 보조 항체였다, Cy3, IRDye-680 각각 DyeLight-750.insets (는 A&#39;-A &#39;&#39; &#39;) 각각의 신호 채널을 보여줍니다. B, syngenic 섬과 이식 및 사후 이식 NIR-OPT 이주와 이미징 마우스 간 엽 (lobus 불길한 lateralis)의 OPT 이미지 (보기 날려). 인슐린 표현 섬은 파란색으로 pseuodocolored과 평활근 α-고를 긍정적 인 선박이 빨간색으로 있습니다. 방법은 혈관 네트워크에서 작은 섬 이식 분포 평가를 할 수 있습니다. 스케일 바 1mm에 해당합니다. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="그림 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" /> 그림 5. NIR-OPT 더 큰 표본의 이미지를 용이하게한다. 2 형 당뇨병 (9 개월 지라 엽)의 주커 지방산 모델에서 쥐 췌장에있는 BCM 배포판의 A, ISO-표면 렌더링, 쥐에서 이미지 표본에 가능성을 exemplifying NIR-OPT로 췌장 규모. 으로 결정이 기법에 의해 표시 엽은 마우스 대응보다 (V / V) ~ 6 배 큰이며, β-세포 볼륨 전체 소엽 볼륨의 1.32 %를 구성하는 Langerhans의 섬을 표현 10,139 인슐린을 비호. B, (A) 조직의 깊이에서 섬이 감지되는 도시의 깨진 라인에 해당하는 단층 절을 참조하십시오. C, 크기 참조로 표시 마우스 췌장 (8 주에서 지라 엽)에 BCM 배포판의 ISO-표면 렌더링. 표시 엽 누구의 β-세포 볼륨 전체 소엽 볼륨의 0.89 %를 구성하는 2,490 인슐린 표현 섬을 비호. pancreata는 Alexa594 복합 염소 안티 - GP (마우스) 각각 IRDye 680 복합 돈키 안티 - GP (쥐) 항체 다음 GP 방지 인슐린 물들입니다. 의 표본이 (AC) (C) 2mm에 해당하는에 크기와 규모 막대로 그려져있다. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="그림 6" fo:content 폭 = &quot;5in&quot;강한 : SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg&quot;/&gt; 6 그림. CLAHE는 OPT 영상으로 손쥐 췌장에 섬의 확인을 용이하게한다. AC, C57Bl / 6 마우스 췌장 (8 주에서 지라 엽)의 대표 ISO-표면 렌더링 OPT 이미지가 인슐린에 대한 분류. OPT 이미지 ISO-표면 reconstructions는 이전에 수행 된 (A, 의사 색 녹색)과 CLAHE 프로토콜 후에 (B, 의사 붉은 색) 적용되었습니다. C,의 정규화되지 않은 데이터의 오버레이 (A)와 (B)에 CLAHE 처리 데이터입니다. C&#39;-C 붉은는 &quot;섬&quot;, (A) 정규화되지 않은 및 CLAHE 가공 (B) 이미지의 대표 높은 배율 오버레이.으로의 존재에 의해 표시 &quot;CLAHE 스크립트가 작고 낮은 신호의 검출을 용이하게 강도 섬이 있습니다. 현재의 예에서 설명 된 표본은 (CLAHE 처리 이후) 해당 처리되지 않은 프로젝션 데이터를 기준으로 숫자가 1,057 섬 부이었다 1.74 mm 3 (의 볼륨과 2419 섬을 숨겨1.77 mm 3)의 볼륨 일. D와 E, 제어 (D)와 CLAHE 프로토콜을 구현 6개월에서 2 형 당뇨병 12 (E)의 OB / OB 마우스 모델에서 예 데이터입니다. OB / OB 췌장 (E)의 작은 섬 크기의 대규모 일반 증가합니다. 의 (D)와 (E) 췌장의 개요 (회색)은 조직 autofluorescence에서 신호를 기준으로합니다. C의 스케일 바는 AC 500 μm이다. C의 스케일 바는 &quot;C &#39;와 C&#39;. 스케일 바 E에가 1mm에 해당하는에 200 μm를 해당 (D)와 (AC) Hörnblad 외 3에서 적응에 (E). 이미지와를 사용하여 생성 된 Bioptonics 3001 스캐너. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. OPT의 표본의 첨부 파일 샘플 홀더는. 표본은 플랜지의 사전 교련 구멍을 통해 아가로 오스 스페이서를 통해 바늘을 삽입하여 고정된다. 홀더는를 통해 스테퍼 모터에 힌지입니다강력한 자석은 기지에 위치하고 있습니다. 이 설정은 불안정 접착제의 사용을 생략하고 스캔하는 동안 표본의 원치 않는 움직임을 방지 할 수 있습니다.

우리는 광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT)의 적응을 설명<sup&gt; 1</sup&gt; 가까운 적외선 스펙트럼 및 전산 도구의 숫자의 구현에 이미지 있습니다. 이 프로토콜은 큰 표본에서 췌장 β 세포 질량 (BCM)의 평가를 활성화 기술의 채널 용량을 증가시키고 OPT 데이터의 품질을 향상시킬 수 있습니다.

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

본 절차의 전반적인 목적은 설치류의 췌장 또는 islet 이식 조직 내 베타 세포 질량 분포에 대해 광학 투영 단층 촬영(optical projection tomography, OPT) 기반 평가를 수행하는 것입니다. 여기서는 더 큰 시료의 연구를 가능하게 하고, 상호작용하거나 인접한 세포 유형을 동시에 시각화하기 위해 근적외선 스펙트럼을 사용합니다. 이는 근적외선 감도 카메라, 고출력 광원 및 적절한 필터 세트를 갖춘 OPT 스캐너 장비를 통해 구현됩니다.검체는 먼저 분리 및 고정된 후, 호르몬 면역 염색을 거쳐 paraffin에 매립하고 광학적 투명화 과정을 진행합니다. 그 다음 맞춤 제작된 샘플 홀더에 부착합니다. 스캔 후 스캐너 내에서 정확한 중심 잡기를 보장하기 위해 반자동 위치 조정 도구가 사용됩니다.필요한 경우, 기계적 설정으로 인해 발생한 아티팩트를 보정하기 위해 투영 영상을 후처리합니다. 저강도 객체의 검출력을 높이기 위해 등화 알고리즘을 활용합니다. 마지막으로, 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 분할, 시각화 및 정량화를 수행합니다.인슐린을 생성하는 베타 세포는 혈당 항상성을 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 따라서 췌장 베타 세포 질량 분포에 대한 공간적 및 정량적 평가는 당뇨병 연구의 많은 분야에서 핵심적입니다. 본 비디오 프로토콜에서는 근적외선 영역에서의 이미징을 가능하게 하여 더 큰 췌장 조직체를 촬영할 수 있도록 개선한 광학 반응 단층 촬영법(optical reaction tomography, OPT)에 대해 설명합니다.또한 이는 단일 검체에서 더 광범위한 세포 유형을 연구할 수 있게 합니다. 더불어 췌장 영상 전반과 B 세포 질량 평가를 위해 최적화된 계산 도구 모음을 제시합니다. 특히, 근적외선 스펙트럼은 조직 내 빛 투과율이 가장 우수한 창입니다.OPT 이미징에서 스펙트럼의 이 영역에 접근하기 위해, 베타 세포 질량의 단일 SH 평가를 위해 동료들이 설명한 기존 OPT 스캐너에 여러 가지 수정 사항을 적용했습니다. 마우스 췌장의 경우, 일반적으로 Omic 3001 스캔을 사용합니다. 여기에는 수은 아크 램프보다 약 650 nanometers 파장에서 더 높은 들뜸 에너지를 제공하는 메탈 할라이드 램프를 통해 들뜸광을 조사합니다.빛은 들뜸 필터를 통과하기 전 액체 광가이드를 통해 전달됩니다. 채널 분리 항체를 평가하기 위해 본 프로토콜에서 사용된 필터들이 이 표에 제시되어 있습니다. 서로 다른 Alexa Fluor 염료가 접합된 항체들이 단백질 비드에 고정되었으며, 아가로스 팬텀의 서로 다른 평면에 삽입되었습니다.이미지를 통해 서로 다른 채널 간에 블리드 스루(bleed through)가 발생하지 않음을 확인할 수 있습니다. 방출된 빛은 근적외선 영역에서 양자 효율이 높은 후면 조사형 CCD 카메라로 검출합니다. 더 큰 샘플의 이미징을 용이하게 하기 위해, 스캐너에 더 큰 반사 거울과 뷰포트를 통합하여 시야각을 넓혔습니다.위의 영상에서 보이는 설정은 스캔 중에 시료를 회전시키는 스테퍼 모터입니다. 실험실 기반 프로그램이 스캔 과정 동안 카메라와 스테퍼 모터를 제어합니다. 단백질 분해를 방지하기 위해 췌장을 적출한 후 얼음처럼 차가운 PBS에 넣으십시오. 염색 및 스캔 절차를 방해할 수 있는 주변 지방과 막을 조심스럽게 제거하십시오.시료를 4% PFA에 담가 4°C에서 2~3시간 동안 고정합니다. 췌장이 접힌 상태로 고정되는 것을 방지하기 위해, 전장 마운트 면역 염색 전 고정 과정 동안 페트리 접시에서 펼쳐준 뒤, 과량의 PBS로 췌장을 세척합니다. 염색 절차는 베타 세포 질량 분포 평가를 위해 이전에 설명된 바와 같습니다.우리는 일반적으로 염색을 위해 돼지 신장, 항-인슐린 1차 항체 및 Alexa Fluor 접합 2차 항체의 조합을 사용합니다. 췌장의 세 가지 주요 엽을 분리하십시오. 이렇게 하면 각 엽에 대한 비교 평가가 용이해지며 더 높은 배율로 스캔할 수 있습니다.췌장을 물로 헹구고 agros에 담급니다. 기포를 제거하기 위함입니다. 췌장을 1.5% 저융점 agros에 매립하고 안착될 때까지 얼음 위에 둡니다.췌장을 폐쇄하며 agros 블로킹을 절단합니다. 샘플과 agros 바닥 사이에 약 1cm의 간격(spacer)을 남겨두십시오. 이 간격은 시료를 샘플 홀더에 고정하는 데 필요합니다.B 투명화 솔루션(Maurice.Clear로도 알려짐)으로 광학 투명화를 진행하기 전, 100% 메탄올에서 췌장을 탈수합니다. 샘플이 투명해질 때까지 투명화 과정을 진행합니다. B 솔루션은 대부분의 플라스틱을 용해하므로, 유리 병 사용을 권장합니다.메탄올의 모든 흔적을 제거하기 위해 B 용액을 두어 번 교체합니다. 이제 시료가 스캐닝 준비가 되었습니다. 스캐닝 중에 시료는 스텝 프로모터에 부착된 자석에 의해 운반됩니다.이를 통해 샘플을 X축과 설정된 축을 따라 슬라이딩할 수 있으며, 이는 시편의 스캔 전 정렬을 용이하게 합니다. 대부분의 OPT 프로토콜에서는 RO 블록을 샘플 홀더에 접착제로 고정하지만, 대부분의 접착제는 전구형 용액에 용해되어 샘플의 원치 않는 움직임을 유발할 수 있습니다. 따라서 접착제 사용을 배제한 홀더가 설계되었습니다.투명한 시료를 홀더에 배치하고, 홀더 플랜지에 미리 뚫린 구멍을 가이드 삼아 바늘 두 개를 조심스럽게 삽입하여 시료를 고정합니다. 시료를 스캐너에 넣고 BAB 용액에 침지시킵니다. 여기에 표시된 것은 카메라 노출 시간과 스텝 프로모터를 제어하고, 배율과 같은 실험 매개변수를 로그 파일 매개변수로 입력하는 데 사용되는 LabVIEW 기반 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스입니다.초점 조정과 필터 세트 교체는 현미경에서 수동으로 수행합니다. 배율을 선택하여 정지하십시오. GFP 필터를 사용하여 시료를 조명하고 실험실용 소프트웨어를 사용하여 미리보기 이미지를 표시하십시오.표본을 회전시켜 가장 넓은 부분을 찾습니다. 여러 개의 췌장 표본을 비교할 때는 모든 표본에 동일한 배율을 사용하십시오. 이 배율은 해당 시리즈 중 가장 큰 샘플을 기준으로 설정합니다. 그다음, 특정 신호를 나타내는 필터 세트로 변경하고 초점을 조절합니다.주의: 노출 시간은 시료의 어느 부분도 포화되지 않으면서 가능한 가장 높은 신호 대 잡음비를 얻을 수 있도록 선택해야 합니다. 췌장 베타 세포 질량 평가의 경우, 일반적으로 시료 전체가 관심 영역이 되므로 최적의 결과를 얻으려면 시료의 질량 중심(com)을 회전축에 정확하게 위치시켜야 합니다. commar 알고리즘은 시료의 질량 중심을 계산하고, 질량 중심을 회전축에 정렬하는 것을 돕는 참조 이미지를 제공합니다.X 좌표를 계산하려면, 우선 0도에서 GFP 채널의 스냅샷을 획득합니다. 그런 다음 필터를 교체하여 동일한 위치에서 특정 신호의 스냅샷을 획득합니다. 다음으로, GFP 이미지에 기댓값 최대화(expectation maximization) 알고리즘을 적용하여 관심 영역의 임계값을 설정하고, 임계 처리된 이미지에 질량 중심 계산을 적용한 뒤, 찾아낸 질량 중심점을 지나는 수직선을 특정 신호 이미지 위에 겹쳐 표시합니다.Z 좌표를 계산하기 위해 시료를 90도 회전시킨 후 이 단계들을 반복합니다. 마지막으로, 획득한 이미지에서 질량 중심점들을 구분하여 이를 기준으로 시료를 이동시켜, 시야의 중심선이 찾아낸 시료의 질량 중심점들을 통과하도록 합니다. 스캔이 완료되면, 재구성 전 회전축을 따라 이미지 위치를 미세 조정하기 위해 투영 이미지에 사후 정렬 값을 할당합니다.하지만 카메라가 광축을 향하는 각도에 약간의 오차가 발생하면 재구성 과정에서 기하학적 왜곡이 일어날 수 있습니다. 이러한 왜곡을 방지하기 위해 시편 스캔 후 정밀한 자유 변환 기반 정렬 방식인 FDA가 사용됩니다. FDA를 계산하기 위해 데이터 세트에서 두 개의 투영 영상을 추출합니다.이 투영 영상들은 0도에서의 특이 신호 F와 180도에서의 특이 신호 G입니다. 이미지 D는 F의 방향과 일치하도록 전치되었습니다. DFT 함수를 사용하여 두 투영 영상으로부터 이미지 전체의 8픽셀 높이 블록을 등록하며, X축을 따라 이동량을 측정하여 필요한 회전 각도를 계산하고, 동일한 스캔을 통해 획득한 모든 채널을 보정하기 위해 동일한 매개변수를 재사용합니다. COMMAR 알고리즘과 FTA의 기초에 대한 더 자세한 내용은 iLet 분할을 용이하게 하기 위해 AL에서 확인할 수 있습니다.투영 이미지에 대비 제한 적응형 히스토그램 평활화(contrast limited adaptive histogram equalization)가 적용됩니다. 본 프로토콜에서는 mat 내장 함수인 adapt hiss egg를 사용하였으며, 기본 클립 제한 값인 0.01과 256의 lytes를 적용하였습니다. 다만, 최적의 타일 크기는 실험적으로 테스트해야 하며 분석하는 시료에 따라 달라질 수 있습니다. 해당 알고리즘에 대한 더 자세한 내용과 예시는 home blood and shadow에서 확인할 수 있습니다.추가적으로, 정렬 보정 및 정규화된 데이터는 이제 단층 촬영 단면으로 재구성할 수 있습니다. 획득한 가상 단면 스택을 시각화하고 정량화하려면 S 또는 velocity와 같은 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 3D ISO 표면을 생성하십시오.이 그림은 Alexa Fluor 488, 594, 680 및 750을 포함한 형광색소 결합 2차 항체 칵테일로 인슐린 염색을 수행한 췌장 엽의 투영 뷰 하나를 보여줍니다. 스펙트럼의 근적외선 영역으로 이동할수록 신호 대 잡음비가 급격히 증가합니다. 이는 스펙트럼의 더 넓은 영역에 접근함으로써 각 신호 채널의 평균 신호 대 잡음비를 보여주는 이 그래프에서 더욱 분명하게 나타납니다.Near OPT 이미징은 단일 표본에서 분석 가능한 세포 유형의 범위를 넓혀줍니다. 이 영상은 1형 당뇨병의 비만형이 아닌 당뇨병 모델(non-obese diabetic model)의 췌장을 보여줍니다. 영상에서 인슐린을 생성하는 랑게르한스섬(islets of Langerhans)은 파란색으로, smooth muscle alpha actin을 발현하는 혈관은 빨간색으로, CD3가 라벨링된 침윤 T 림프구는 녹색으로 표시됩니다.근적외선 영역에서 조직 내 투과력이 증가한다는 점을 이용하여, 내인성 조직 자가형광을 기반으로 회색의 녹색 테아크린 유조직을 재구성하였습니다. O PT 이미징을 통해 이전보다 훨씬 더 큰 표본에서 베타 세포 질량 분포를 평가할 수 있게 되었습니다. 이 그림은 ER erdi six 80을 2차 항체로 사용하여 인슐린을 표지한 SER 비만 쥐 비장 엽 내의 아일렛 분포에 대한 ISO 표면 재구성을 보여줍니다.정확한 참조를 위해 마우스 비장 구체가 표시되어 있습니다. 이 이미지들은 개별 췌장 구체 내 베타 세포 질량 분포의 두 가지 서로 다른 등가면 재구성 결과를 나타내며, claw 처리를 하지 않았을 때의 산(acid)은 녹색으로, 알고리즘을 적용했을 때는 적색으로 나타납니다. 두 재구성 결과를 겹쳐함으로써, claw가 신호 강도가 낮은 작은 구멍(eyelet)들에 대해서도 분할을 용이하게 함을 보여줍니다.이들은 중첩 이미지에서만 빨간색으로 나타납니다. 저희는 방금 췌장 전체 부피와 개별 랑게르한스섬 수준에 이르기까지 베타 세포 질량의 공간적 및 정량적 정보를 추출하는 방법을 보여드렸습니다. 이러한 프로토콜은 근접 적외선 OPT에서의 베타 세포 또는 췌장 평가에만 국한되지 않으며, 제시된 계산 도구들 또한 다른 연구 분야로 전환하여 적용하는 것이 가능할 것입니다.행운을 빕니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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Medicine

의학

다음 프로토콜은 가상 슬라이스 이미지에 대한 췌장 해부 과정을 설명하고, 전체 췌장에있는 모든 GFP - 태그 베타 세포의 후속 부량.

마우스의 췌장 베타 세포 질량의 원위치 부량에서

immunohistochemically 스테인드 췌장 표본의 대규모 조달 및 분석의 새로운 컴퓨터를 이용한 방법에 설명되어 있습니다 : 전체 섹션 (1) 가상 슬라이스 캡처를, 대규모 데이터 (2) 질량 분석, 2D 가상 조각 (3) 재건 (4) 3D 아일릿 매핑, 그리고 (5) 수학 분석.

컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 췌장 아일릿 질량, 크기 유통과 건축의 부량

이 프로토콜은 하나가 당뇨병 치료를위한 잠재적인 치료 표적을 찾기 위해 기능성 베타 세포 질량을 조절 요소를 식별할 수 있습니다. 프로토콜은 adenoviruses과 유전자 발현의 조작에 따라 분리된 쥐의 islets에 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 간소화된 방법으로 구성되어 있습니다.

에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

여기에서는 β세포 증식에 대한 후속 면역형광 분석을 통해 배양에서 온전한 마우스 섬에 관심 부하가 있는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세구의 화합물을 생성하고 관리하는 방법론을 제시합니다. 이 방법은 후보 β세포 유사분열제의 효능을 측정하는 데 적합합니다.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

췌 장 섬 microvascular vasomotion 섬 혈액 분포를 조절 하 고 섬 β 세포의 생리 기능을 유지 합니다. 이 프로토콜은 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 의 기능 상태를 확인 하 고 췌 장 섬 미세 췌 장 관련 질병에의 기여를 평가 하는 레이저 도플러 모니터를 사용 하 여 설명 합니다.

레이저 도플러: 췌 장 섬 Microvascular Vasomotion에 Vivo에서 측정 하기 위한 도구

여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

이 프로토콜에서 췌장섬은 전용 다중 플랫폼 응용 프로그램에서 구현 된 계산 알고리즘을 사용하여 재구성되고 분석됩니다.

구조 및 기능 분석을위한 도구로서의 췌장섬의 전산 재구성

상패 생물학의 2 차원 분자 이미징을위한 intravascular 우리는 세부 새로운 가까운 적외선 형광 (NIRF)...

염증성 플라크의 적외선 형광 (NIRF) Intravascular 분자 이미징, Multimodal 접근 가까운 생체내에서 죽상 경화증의 영상을

배우세요 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영법을 활용한 췌장 β-세포 질량 분포 분석 기법입니다. 계산 도구를 활용하여 대형 조직의 고해상도 이미징과 다중 채널 데이터 품질을 향상시키는 방법을 익히세요.

당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근

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