تقنية التعقيم في العلوم البيئية

1. التحضير للعمل المعقم

1. احصل على عناصر معدات الوقاية الشخصية التالية وقم بتطبيقها: معطف المختبر ، قفازات اللاتكس أو النتريل (خالية من الدموع أو الثقوب) ، ونظارات السلامة ( الشكل 1 ). للسلامة في حالة استخدام اللهب المكشوف ، اربطي الشعر الطويل للخلف.
   
   الشكل 1: معدات الوقاية الشخصية: معطف مختبر وقفازات لاتكس ونظارات واقية.
2. الجانب الثاني المهم من تقنية التعقيم هو التعقيم والتخزين المناسبين للوسائط / الكواشف لاستخدامها في المختبر. قم بإعداد وسط المرق السائل ( على سبيل المثال ، مرق الصويا المحمص) والوسائط القائمة على أجار ( على سبيل المثال ، R2A) عن طريق وزن الكمية المناسبة من مسحوق القاعدة المجفف ، والذي يضاف إلى الكمية المناسبة من الماء منزوع الأيونات.
3. بالنسبة لوسط المرق ، قم بإذابة المسحوق على صفيحة ساخنة مع تطبيق حرارة منخفضة ، وقم بتوزيع السائل إما بأحجام 100 مل في قوارير زجاجية لولبية ، أو بأحجام 10 مل في أنابيب اختبار زجاجية لولبية. باستخدام قضيب تقليب مغناطيسي ، حرك وسط الاغاروز على الطبق الساخن حتى يذوب المسحوق تماما.
4. قم بتطبيق شريط الأوتوكلاف على الحاويات، وقم بتعقيم الوسائط وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ( على سبيل المثال: ، 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية) ( الشكلان 2 و 3). لاحظ أن لون الخطوط على شريط الأوتوكلاف يجب أن يتغير من الأبيض (ما قبل الأوتوكلاف) إلى الأسود (ما بعد الأوتوكلاف). على الرغم من أن تغير اللون يشير بشكل عام إلى أن التعقيم كان ناجحا ، إلا أنه يمكن إجراء فحوصات العقم باستخدام مجموعات شريط البوغ للتحقق من عملية التعقيم.
   
   الشكل 2: شريط الأوتوكلاف الذي يتم تطبيقه على المواد.
   
   الشكل 3: لاحظ تغيير لون الخطوط على شريط الأوتوكلاف من الأبيض (ما قبل الأوتوكلاف) إلى الأسود (ما بعد الأوتوكلاف).
5. قم بتبريد المرق السائل إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم احفظه في درجة حرارة الغرفة أو قم بتبريده عند 4 درجات مئوية.
6. قم بتبريد وسط الاغاروز عن طريق وضع الحاوية في حمام مائي مضبوطة على ~ 50 درجة مئوية. بمجرد أن تبرد ، يمكن سكب الوسائط في أطباق بتري المعقمة. اترك الوسط يبرد ويتصلب ، ثم قم بتجميعه للتخزين تحت درجات الحرارة المحددة من قبل الشركة المصنعة.
7. هناك عدة أنواع من وسائط الاستزراع التي لا يمكن تعقيمها لأن درجات الحرارة المرتفعة تؤدي إلى تدهور المكونات المهمة. يتطلب تعقيمها تعقيما بالترشيح باستخدام نظام ترشيح فراغي يستخدم مرشحا 0.22 ميكرومتر ، متبوعا بالتخزين في درجة الحرارة المناسبة.
8. قبل القيام بالعمل على سطح الطاولة ، قم بتطهير السطح باستخدام محلول مناسب ( على سبيل المثال ، مبيض 500 جزء في المليون). هذا يقلل من خطر نقل الملوثات من سطح العمل إلى المزارع والوسائط المعقمة.
9. لإنشاء حقل معقم ، قم بتشغيل موقد بنسن. نوع اللهب الأنسب لتعقيم حلقات تلقيح المعادن هو لهب أزرق كثيف ، مع ملاحظة مخروط أزرق نهائي في المنتصف ( الشكل 4 ).
   
   الشكل 4: نقل البكتيريا من صفيحة بتري واحدة تظهر نمو عزلة مستنبتة إلى صفيحة بتري أخرى غير ملقحة تحتوي على وسط نمو قائم على أجار.
10. مرر حلقة التلقيح ببطء عبر الجزء الأكثر سخونة من اللهب (طرف المخروط الأزرق). يجب أن تتحول الحلقة إلى اللون الأحمر لغرض التعقيم.

2. عمليات النقل البكتيرية: من صفيحة بتري إلى صفيحة بتري

1. أحد سيناريوهات نقل البكتيريا هو من صفيحة بتري تعرض نمو عزلة مستنبتة إلى صفيحة بتري أخرى معقمة تحتوي على وسط نمو قائم على أجار.
2. للبدء ، افتح صفيحة بتري التي تحتوي على المزرعة البكتيرية النقية قليلا ، واضغط برفق على حلقة التلقيح الساخنة والمعقمة على سطح الأجار.
3. استرجع مستعمرة معزولة واحدة من سطح اللوحة باستخدام حلقة التلقيح المبردة ، وأغلق لوحة بتري.
4. قم بإجراء خط للعزل باستخدام صفيحة بتري جديدة تحتوي على وسط استزراع ، مع فتح الغطاء قليلا.
5. لكل جزء من خط العزل (3 إجمالي لكل لوحة) ، قم بتعقيم حلقة التلقيح باللهب قبل الاستخدام مباشرة. أيضا ، قم بتعقيم الحلقة باللهب بعد إجراء الخط النهائي مباشرة من أجل منع تلوث سطح المقعد وكاعتبار للآخرين في المختبر الذين قد يستخدمون حلقات التلقيح أو يتلامسون معها لاحقا.
6. ضع الألواح المخططة في حاضنة للنمو طوال الليل.

3. عمليات النقل البكتيرية: من ثقافة المرق إلى صفيحة بتري

1. السيناريو الثاني لنقل البكتيريا هو من ثقافة المرق التي تظهر نموا ، كما لوحظ بشكل عام من خلال التعكر ، إلى صفيحة بتري معقمة تحتوي على وسط نمو.
2. قم بإزالة الغطاء من أنبوب الاختبار (أو القارورة) الذي يحتوي على الثقافة البكتيرية النقية ، وقم بتمرير فتحة الحاوية 2-3x عبر الجزء الأكثر سخونة من اللهب. لمنع التلوث ، لا تضع الغطاء على سطح الطاولة.
3. قم بخفض حلقة التلقيح المعقمة بحذر في الأنبوب / القارورة ، واضغط برفق على جانب الحاوية لتبرد قبل إدخالها في مزرعة المرق.
4. قم بإزالة حلقة واحدة من ثقافة المرق ( الشكل 5 ) ، واستبدل الغطاء على الفور.
   
   الشكل 5: حلقة واحدة من ثقافة المرق.
5. قم بإجراء خط للعزل باستخدام صفيحة بتري جديدة تحتوي على وسط استزراع ، مع الغطاء مفتوحا قليلا.
6. لكل جزء من الخط (3 إجمالي لكل لوحة) ، قم بتعقيم حلقة التلقيح باللهب قبل الاستخدام مباشرة. أيضا ، قم بتعقيم الحلقة باللهب بعد إجراء الخط النهائي مباشرة من أجل منع تلوث سطح المقعد وكاعتبار للآخرين في المختبر الذين قد يستخدمون حلقات التلقيح لاحقا.
7. ضع الألواح المخططة للعزل في حاضنة للنمو طوال الليل.

4. التحويلات البكتيرية: من صفيحة بتري مع النمو إلى وسط سائل معقم

1. السيناريو الثالث لنقل البكتيريا هو من صفيحة بتري تحتوي على خط ثقافة معزول إلى أنبوب / قارورة تحتوي على وسط نمو سائل معقم.
2. افتح صفيحة بتري قليلا التي تحتوي على المزرعة البكتيرية النقية ، وقم بتبريد حلقة التلقيح الساخنة عن طريق النقر عليها برفق على سطح الأجار.
3. استرجع مستعمرة معزولة واحدة من سطح اللوحة باستخدام حلقة التلقيح المبردة ، وأغلق لوحة بتري.
4. قم بإزالة الغطاء من أنبوب الاختبار (أو القارورة) الذي يحتوي على وسط نمو السائل المعقم ، وقم بتمرير فتحة الحاوية من 2 إلى 3 مرات عبر الجزء الأكثر سخونة من اللهب. لمنع التلوث ، لا تضع الغطاء على سطح الطاولة .
5. قم بخفض المستعمرة المستخرجة بعناية في وسط المرق السائل ، وحرك الحلقة برفق لتحرير البكتيريا. استبدل الغطاء على الفور.
6. تعقيم حلقة التلقيح باللهب من أجل منع تلوث سطح المقعد وكاعتبار للآخرين في المختبر الذين قد يستخدمون حلقات التلقيح لاحقا.
7. ضع القارورة في حاضنة للنمو طوال الليل.
8. قم بإزالة القارورة من الحضانة في اليوم التالي. قم بإجراء سلسلة تخفيف من أجل تعداد الثقافة.
9. ضع التخفيفات من السلسلة على وسائط ثقافة الاغاروز ، واحتضن الألواح طوال الليل.
10. قم بإزالة الألواح في اليوم التالي ، وراقب أي تلوث.

5. عمليات النقل البكتيرية: من ثقافة المرق إلى وسط نمو السائل المعقم

1. السيناريو الرابع لنقل البكتيريا هو من ثقافة المرق التي تظهر نموا إلى أنبوب / قارورة تحتوي على وسط نمو سائل معقم.
2. قم بإزالة الغطاء من أنبوب الاختبار (أو القارورة) التي تحتوي على الثقافة البكتيرية النقية ، وقم بتمرير فتحة الحاوية مرتين عبر الجزء الأكثر سخونة من اللهب. لمنع التلوث ، لا تضع الغطاء على سطح الطاولة.
3. اخفض حلقة التلقيح بحذر في الأنبوب / القارورة ، واضغط برفق على جانب الحاوية لتبرد قبل إدخالها في مزرعة المرق.
4. قم بإزالة حلقة واحدة من ثقافة المرق ، واستبدل الغطاء على الفور.
5. قم بإزالة الغطاء من أنبوب الاختبار (أو القارورة) الذي يحتوي على وسط نمو السائل المعقم ، وقم بتمرير فتحة الحاوية مرتين عبر الجزء الأكثر سخونة من اللهب . لمنع التلوث ، لا تضع الغطاء على سطح الطاولة.
6. قم بخفض الحلقة المستخرجة بعناية في وسط المرق السائل المعقم ، وقم بتحريك الحلقة برفق لإطلاق البكتيريا. استبدل الغطاء على الفور.
7. تعقيم حلقة التلقيح باللهب ( الشكل 6 ) من أجل منع تلوث سطح المقعد وكاعتبار للآخرين في المختبر الذين قد يستخدمون حلقات التلقيح لاحقا.
   
   الشكل 6: حلقة التلقيح التي تتحول إلى اللون الأحمر الساخن أثناء تعقيمها بموقد بنسن.
8. ضع القارورة في حاضنة للنمو طوال الليل.
9. قم بإزالة القارورة من الحضانة في اليوم التالي. قم بإجراء سلسلة تخفيف من أجل تعداد الثقافة.
10. ضع التخفيفات من السلسلة على وسائط ثقافة الاغاروز ، واحتضن الألواح طوال الليل.
11. قم بإزالة الألواح في اليوم التالي ، وراقب أي تلوث.