تلطيخ الجرام للبكتيريا من المصادر البيئية

يسمح تلطيخ الجرام بالتصور السريع للتشكل البكتيري والتمييز الخلوي الواسع من مجموعة واسعة من العينات البيئية. لتلطيخ البكتيريا ، يتم وضع مسحة موحدة على جانب زجاجي وتترك حتى تجف. بعد تثبيت اللطاخة بالحرارة ، يتم تطبيق البنفسج الكريستالي.

يشطف عامل إزالة اللون البنفسجي البلوري من الخلايا سالبة الجرام ، ولكن ليس الخلايا موجبة الجرام. تستخدم صبغة ثانية ، عادة السافرانين ، كبقعة خلفية لتصور الخلايا سالبة الجرام. بمجرد تلطيخها ، يمكن تقييم الخلايا من حيث مورفولوجيا الخلية وحجمها وترتيبها ، مثل السلاسل أو العناقيد.

سيوضح هذا الفيديو كيفية تحضير عينة بيئية ، وعزل الأنواع البكتيرية الموجودة فيها ، وإجراء صبغة جرام على المستعمرات المعزولة

يسمح تلطيخ الجرام بتصنيف معظم البكتيريا إلى فئتين هيكليتين واسعتين: إيجابية الجرام وسالبة الجرام. في حين أن كلتا الفئتين لهما غشاء بلازما فوسفوليبيد أساسي ، فإن بنية الجدار الخلوي تختلف اختلافا كبيرا. يتكون جدار الخلية موجبة الجرام بشكل أساسي من طبقة سميكة من الببتيدوغليكان ، وهو بوليمر يتكون من السكريات والأحماض الأمينية. تحتوي جدران الخلايا سالبة الجرام على طبقة أرق من الببتيدوغليكان ، محصورة بين غشاء دهني ثان. يحتوي هذا الغشاء الخارجي عادة على عديدات السكاريد الدهنية.

يرتبط البنفسج البلوري موجب الشحنة بشكل ضعيف بجدار الخلية البكتيرية سالب الشحنة. يشكل اليود في الجرام مركبا غير قابل للذوبان مع صبغة البنفسج البلورية ، وبالتالي تثبيته في جدار الخلية.

أثناء خطوة إزالة اللون ، يتم تجفيف الببتيدوغليكان في الخلايا موجبة الجرام ، مما يتسبب في تقلصه وحبس مجمعات اليود البنفسجي البلوري. في الخلايا سالبة الجرام ، يضر عامل إزالة اللون بالغشاء الخارجي ، مما يزيد من مساميته. هذا يسمح بغسل مجمعات اليود البنفسجي الكريستالي.

الآن بعد أن فهمت المبادئ الكامنة وراء تلطيخ بكتيريا التربة بالجرام ، دعنا نرى العملية التي يتم إجراؤها على بكتيريا التربة في المختبر.

بعد جمع عينة من التربة في الحقل ، أحضرها إلى المختبر لتحليلها. صقل العينة بغربال ، ووزن 10 جم من التربة المنخلة - باستخدام ميزان تحليلي.

خفف العينة إلى 95 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات والدوامة للخلط. قم بإجراء 1 إلى 10 تخفيفات إضافية ، دوامة بين كل تخفيف. نقل حصص ما لا يقل عن 3 تخفيفات متتالية ، على تكرار ألواح الاغاروز منخفضة المغذيات.

بعد تعقيم لهب الإيثانول وتبريد قضيب زجاجي منحني عن طريق النقر على الوسائط ، انشر العينة على سطح الألواح. احتضان اللوحات في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة لمدة 3 إلى 5 أيام ، حدد أعلى تخفيف مع 30 إلى 300 مستعمرة منفصلة. باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، حدد المستعمرات ذات الأهمية للعزل.

ضع المستعمرة على قسم واحد من طبق جديد. تعقيم الحلقة بين الخطوط ، قم بعمل خطوط متتالية بنمط متعرج على كل قسم من اللوحة للسماح بالعزل اللاحق للمستعمرات المفردة المنفصلة. احتضن الألواح لمدة 1 إلى 2 أيام في درجة حرارة الغرفة.

لبدء تحضير اللطاحات البكتيرية ، قم بتوصيل مشبك بشريحة زجاجية تم تنظيفها مسبقا لسهولة التعامل معها. لكل مسحة بكتيرية ، قم بتنظيف حلقة التلقيح وتعقيمها باللهب. ضع 2 حلقات من الماء المقطر المعقم في وسط الشريحة.

بعد تعقيم الحلقة مرة أخرى ، قم بإزالة كمية صغيرة من الثقافة من مستعمرة معزولة ، واخلطها مع الماء الموجود على الشريحة. من المهم تبريد الحلقة قبل لمس المزرعة عن طريق النقر على جزء غير متلقيح من الأجار عدة مرات. يجب أن تشبه اللطاخة الحليب المخفف. اترك الشريحة تجف في درجة حرارة الغرفة. بعد التجفيف ، قم بإصلاح اللطاخة بالحرارة عن طريق تمريرها بسرعة عبر اللهب.

بمجرد أن تجف ، ضعي الماصة البنفسجي الكريستالي على اللطاخة ، واتركيها لمدة 2-3 دقائق. اشطف الشريحة بعناية بالماء المقطر عن طريق توجيه التدفق المباشر نحو الجزء العلوي من الشريحة، مما يسمح للماء بالتدفق برفق لأسفل. لا توجه تدفق المياه مباشرة إلى اللطاخة.

قم بتغطية الشريحة باليود غرام. بعد 2 دقيقة ، اشطفها برفق بالماء المقطر. قم بإزالة لون الشريحة بنسبة 95٪ من الإيثانول حتى تختفي البقعة. اشطفه على الفور بالماء المقطر. سيؤدي ذلك إلى الحد من الإفراط في إزالة لون اللطاخة.

أضف السافرانين كبقعة مضادة للمسحة لمدة 30 ثانية. سيؤدي ذلك إلى تلطيخ أي خلايا سالبة الجرام موجودة. اشطفيه برفق بالماء المقطر وجففيه بورق ماص. راقب الشريحة الناتجة بالمجهر. استخدم هدف الطاقة المنخفضة أولا لإجراء تعديلات خشنة والعثور على جزء مثالي من اللطاخة قبل الانتقال إلى مجال الرؤية الأصغر للتكبيرات الأعلى.

بعد مزيد من التصوير وضبط اللطاخة بهدف طاقة متوسطة ، أضف زيت الغمر مباشرة إلى اللطاخة. الزيت ضروري لأهداف الطاقة العالية التي ستوفر أفضل الصور المجهرية. ستظهر البكتيريا موجبة الجرام باللون الأزرق أو الأرجواني ، بينما تكون الخلايا سالبة الجرام حمراء أو وردية. بالإضافة إلى بنية جدار الخلية ، يتم توضيح الشكل والترتيب من الصور المجهرية الناتجة.

تعد قدرة تلطيخ الجرام على دراسة البكتيريا نوعيا مهمة لمجموعة واسعة من المجالات العلمية.

التربة هي مجرد واحدة من المصادر البيئية التي يمكن من خلالها عزل البكتيريا وتحليلها. لمياه الشرب ، يجب تعديل تحضير العينة. يمكن سحب عينات من ماء الصنبور من صنبور ، وطلاءها على وسائط النمو التي تسهل نمو مستعمرات بكتيرية متنوعة غير متجانسة. عند الطلاء على وسط مثل R2A ، تكون العملية متطابقة تقريبا مع إجراء التربة.

بالنسبة لبعض تقنيات تحديد البكتيريا ، تعتمد المعلمات على نوع جدار الخلية للبكتيريا ذات الأهمية. في هذا المثال ، تم اختبار دم مريض إنتان وتبين أنه يؤوي بكتيريا موجبة الجرام.

باستخدام هذه المعلومات ، تم اختيار مجسات الحمض النووي الببتيد الخاصة بالأنواع والتي من شأنها أن ترتبط بالحمض النووي الريبي للخلايا. كانت هذه المجسات مرتبطة بأصباغ الفلورسنت التي تم استخدامها لتحديد الأنواع الموجودة.

بسبب الاختلافات الأساسية في البنية الخلوية موجبة الجرام والسالبة ، فإن البكتيريا لها استجابات فريدة للمركبات الأخرى إلى جانب البنفسجي البلوري. سعت هذه التجربة إلى عزل المطثية العسيرة ، وهي بكتيريا موجبة الجرام ، من عينات البراز. تمت إضافة السيكلوسيرين ، الذي يمنع نمو الخلايا سالبة الجرام ، إلى صفيحة أجار. تم عزل الخلايا موجبة الجرام التي نمت على اللوحة عبر طرق أخرى.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE عن تلطيخ Gram للدراسات البيئية. يجب أن تفهم الآن فوائد العملية وكيفية أداء هذه التقنية والاستفادة من النتائج. شكرا للمشاهدة!