تستخدم الملصقات الأيضية للتحقيق في التحولات والتعديلات الكيميائية الحيوية التي تحدث في الخلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظائر كيميائية تحاكي بنية الجزيئات الحيوية الطبيعية. تستخدم الخلايا نظائرها في عملياتها الكيميائية الحيوية الذاتية ، وتنتج مركبات مصنفة. يسمح الملصق بدمج علامات الكشف والتقارب ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتوضيح مسارات التمثيل الغذائي باستخدام تقنيات تحليلية كيميائية حيوية أخرى ، مثل SDS-PAGE و NMR.
يقدم هذا الفيديو مفاهيم وضع العلامات الأيضية ويظهر إجراءين عامين. الأول يستخدم وضع العلامات النظيرية لتوصيف فسفرة البروتين. يغطي الثاني وضع العلامات التفاعلية الضوئية لتوصيف تفاعل البروتين والبروتين داخل كما يتم تقديم ثلاثة تطبيقات لوضع العلامات الأيضية: وضع العلامات على المواد النباتية ، ووضع العلامات على الحمض النووي الريبي لقياس الحركية ووضع العلامات على الجليكان في الأجنة النامية.
تستخدم الملصقات الأيضية للتحقيق في التحولات والتعديلات الكيميائية الحيوية التي تحدث في الخلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظائر كيميائية تحاكي بنية الجزيئات الحيوية الطبيعية. تستخدم الخلايا نظائرها في عملياتها الكيميائية الحيوية الذاتية ، وتنتج مركبات مصنفة. يسمح الملصق بدمج علامات الكشف والتقارب ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتوضيح مسارات التمثيل الغذائي باستخدام تقنيات تحليلية كيميائية حيوية أخرى ، مثل SDS-PAGE و NMR.
يقدم هذا الفيديو مفاهيم وضع العلامات الأيضية ويظهر إجراءين عامين. الأول يستخدم وضع العلامات النظيرية لتوصيف فسفرة البروتين. يغطي الثاني وضع العلامات التفاعلية الضوئية لتوصيف تفاعل البروتين والبروتين داخل كما يتم تقديم ثلاثة تطبيقات لوضع العلامات الأيضية: وضع العلامات على المواد النباتية ، ووضع العلامات على الحمض النووي الريبي لقياس الحركية ووضع العلامات على الجليكان في الأجنة النامية.
يستخدم وضع العلامات الأيضية للتحقيق في آلية الخلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظائر كيميائية لاستكشاف التحولات والتعديلات الكيميائية الحيوية التي تحدث. سيعرض هذا الفيديو مبادئ وضع العلامات الأيضية ، وإجراءات وضع العلامات النظيرية النموذجية والتفاعلية الضوئية ، وبعض التطبيقات.
يمكن إجراء وضع العلامات الأيضية باستخدام عدد من الاستراتيجيات. سنصف هنا الملصقات النظيرية والتفاعلية الضوئية والمتعامدة الحيوية.
يتم إجراء وضع العلامات النظيرية باستخدام نظائر هيكلية متطابقة كيميائيا مع نظيراتها الطبيعية ، ولكن تحتوي على نظائر غير شائعة مدمجة في هيكلها. في هذا التناظرية L-lysine ، يتم استبدال ذرات الكربون والنيتروجين بالكربون 13 والنيتروجين 15. الخلايا المزروعة في وجود نظائر نظائرية ستدمجها في هياكلها الكيميائية الحيوية. يتم جمع المستقلبات من الخلايا وتنقيتها لتحليلها. يتم تحليل العينات ذات النظائر المستقرة باستخدام تقنيات مثل قياس الطيف الكتلي أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. يتم تحليل العينات ذات الملصقات المشعة باستخدام عد التلألؤ السائل وأفلام الأشعة السينية ، والتي سيتم إظهارها في بروتوكول وضع العلامات النظيرية.
الملصقات التفاعلية الضوئية هي مجموعات وظيفية مدمجة في البروتينات ، والتي تكون مستقرة حتى تتعرض للأشعة فوق البنفسجية. تشكل المجموعة الوظيفية جذريا تفاعليا يرتبط بأقرب بروتين. مثال شائع ، L-photo-leucine ، يحتوي على حلقة ديازيرين ، وهي عبارة عن رابط متشابك تفاعلي ضوئي. على عكس وضع العلامات النظيرية ، هناك بعض الاختلاف الكيميائي بين نظائرها الكيميائية التفاعلية للضوء ونظيراتها الطبيعية. قد تدمج الخلايا بشكل تفضيلي مركبات طبيعية على نظائرها. لذلك ، من المهم إجراء وضع العلامات التفاعلية للصور في وسط خال من المركب الذي يتم تقليده. بمجرد تعرضها للأشعة فوق البنفسجية ، تصبح المجموعات التفاعلية الضوئية في البروتين المسمى غير مستقرة وشديدة التفاعل ، مما يؤدي إلى ارتباطها بالبروتينات المتفاعلة ، مما يؤدي إلى تكوين مركب بروتيني تعمل المجمعات المتشابكة كلقطات يمكن تحليلها بعد ذلك باستخدام SDS-PAGE وطرق قياس الطيف الكتلي. يوفر هذا نظرة ثاقبة حول التفاعلات التي تحدث في مسار التمثيل الغذائي من خلال تحديد أنواع التفاعل وكيفية تفاعلها من خلال تحديد مواقع الربط.
تستخدم استراتيجيات وضع العلامات المتعامدة الحيوية نظائر ذات مجموعات وظيفية صغيرة ليس لها تفاعل يذكر أو معدوم مع الجزيئات الحيوية الطبيعية. على سبيل المثال ، الأزيدات عبارة عن مجموعات وظيفية صغيرة ، يقال إن تفاعلها متعامد مع التفاعلات الكيميائية الحيوية. في ربط Staudinger ، تهاجم مجموعة الفوسفين مجموعة azido. ينتج عن هذا حالة انتقالية تتفاعل داخل الجزيئية مع إستر قريب ، مما ينتج عنه ترابط مرتبط بالأمين. يمكن ربط المجموعات الوظيفية المتعامدة الحيوية المدمجة في الجزيئات الحيوية بعلامات الكشف مثل المجموعات الوظيفية الفلورية وعلامات التقارب مثل المستضدات.
الآن بعد أن تمت مناقشة بعض المفاهيم والاستراتيجيات الخاصة بوضع العلامات الأيضية ، دعونا نلقي نظرة على العملية في المختبر.
تتمثل الخطوة الأولى في تجربة وضع العلامات الأيضية في جمع البروتين محل الاهتمام. للقيام بذلك ، تزرع الخلايا على طبق ، ويتم استخدام طريقة التعبير لتعزيز تخليق البروتين المطلوب. في هذا المثال ، يتم التعبير عن الكينازات المتكررة الغنية بالليوسين ، أو LRRK. يستخدم فوسفات ثنائي الصوديوم ، الذي يحتوي على الفوسفور المشع -32 ، كنظير. يجب اتخاذ التدابير المناسبة للحماية من الإشعاع المؤين. ويشمل ذلك إنشاء منطقة عمل ، وارتداء معدات الحماية المناسبة ، والتحقق من التلوث الإشعاعي. بمجرد اتخاذ تدابير السلامة ، يتم تحضير الوسط الذي يحتوي على نظائر النظائر. تتم إزالة الوسط من الثقافة واستبداله بوسيط يحتوي على نظائرها الكيميائية النظيرية ثم يتم احتضانه. بعد الحضانة ، يتم تحلل الخلايا. يتم جمع المحللة وتنقيتها.
بعد التنقية ، يتم حل البروتينات باستخدام SDS-PAGE ثم نقلها إلى غشاء PVDF. يتم إجراء التصوير الشعاعي الذاتي عن طريق تعريض الغشاء لفيلم الأشعة السينية وقياسه باستخدام جهاز تصوير الفوسفور. يستخدم النشاف الغربي لقياس مستويات البروتين النسبية في غشاء PVDF. في هذا المثال ، تم قياس مستويات الفسفرة في الكينازات المتكررة الغنية بالليوسين المركبة في خلايا 293T. يوضح مخطط الأشعة الذاتية كمية الفوسفور التي تم دمجها في البروتين. يوضح النشاف الغربي مستويات بروتينات LRRK. يستخدم برنامج تحليل الصور للحصول على بيانات كمية لمستويات فسفرة البروتينات.
في هذا الإجراء التالي ، يتم عرض الملصقات التفاعلية الضوئية. أولا ، يتم تحضير الخلايا وزراعتها. يضاف التناظري التفاعلي الضوئي إلى الخلايا في مرحلة منتصف السجل ويحتضن. في هذا الإجراء يتم استخدام p-benzoylphenylalanine. يتم جمع العينات على فترات ووضعها على الجليد. ثم يتم عرض العينات للحصول على لقطات من المسارات الكيميائية الحيوية بمرور الوقت. ثم يتم تنقية البروتينات ذات الأهمية وحلها باستخدام SDS-PAGE.
تم استخدام استراتيجية وضع العلامات التفاعلية الضوئية لتحديد المركبات التي تتفاعل مع البروتين محل الاهتمام. يظهر الكشف المناعي باستخدام النشاف الغربي نطاقات بروتينية تشير إلى وجود بروتينات ذات وزن جزيئي أعلى في العينات المشععة. هذه ناتجة عن الربط المتقاطع بسبب تفاعل البروتين والبروتين الذي يحدث أثناء الأشعة فوق البنفسجية.
الآن بعد أن راجعنا إجراءات وضع العلامات الأيضية ، دعنا نلقي نظرة على بعض طرق استخدام العملية.
يمكن توسيع مفاهيم وضع العلامات الأيضية على الكائنات متعددة الخلايا. تزرع النباتات في بيئة محكمة الغلق وغنية بالنظائر المستقرة لإنتاج مواد نباتية مصنفة. يضاف ثاني أكسيد الكربون المحتوي على الكربون 13 إلى العلبة ، بينما يتم استخدام الأسمدة الغنية بالنيتروجين 15. يمكن أن تساعد المواد النباتية المحصودة الناتجة في الإجابة على أسئلة حول تدوير الكربون والنيتروجين من النظام البيئي.
يتيح وضع العلامات فصل الحمض النووي الريبي المركب حديثا عن الحمض النووي الريبي الأقدم. من خلال تغيير التركيز الأولي للتناظرية ، يمكن تحديد حركية تخليق الحمض النووي الريبي الجديد. تظهر النتائج أن تركيز 4-ثيوريدين يؤثر على مقدار الحمض النووي الريبي الجديد الذي يتم نسخه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس معدلات دمج الملصق في الحمض النووي الريبي مباشرة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
باستخدام كيمياء النقر ثنائية التعامد ، يمكن تسمية الجليكان في جنين أسماك الحمار الوحشي. يتم حقن البيض بمركب وضع العلامات الذي ينتج عنه ملصقات الألكين على الجليكانات. ثم يتم ربط الجليكان الموجود في اليرقات بمركب صبغة في مرحلة التطور المطلوبة. ثم يتم تصوير الجليكان في الأجنة. يمكن تحديد الجليكان المنتجة في نقاط زمنية مختلفة عن طريق وضع العلامات باستخدام ألوان مختلفة في مراحل مختلفة من نمو الجنين.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول وضع العلامات الأيضية. وصف هذا الفيديو المفاهيم الكامنة وراء وضع العلامات الأيضية واستراتيجياتها ، وتناول إجراءين عامين ، وغطى بعض استخدامات التقنيات.
شكرا للمشاهدة!
تستخدم الملصقات الأيضية للتحقيق في التحولات والتعديلات الكيميائية الحيوية التي تحدث في الخلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظائر كيميائية تحاكي بنية الجزيئات الحيوية الطبيعية. تستخدم الخلايا نظائرها في عملياتها الكيميائية الحيوية الذاتية ، وتنتج مركبات مصنفة. يسمح الملصق بدمج علامات الكشف والتقارب ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتوضيح مسارات التمثيل الغذائي باستخدام تقنيات تحليلية كيميائية حيوية أخرى ، مثل SDS-PAGE و NMR.
يقدم هذا الفيديو مفاهيم وضع العلامات الأيضية ويظهر إجراءين عامين. الأول يستخدم وضع العلامات النظيرية لتوصيف فسفرة البروتين. يغطي الثاني وضع العلامات التفاعلية الضوئية لتوصيف تفاعل البروتين والبروتين داخل كما يتم تقديم ثلاثة تطبيقات لوضع العلامات الأيضية: وضع العلامات على المواد النباتية ، ووضع العلامات على الحمض النووي الريبي لقياس الحركية ووضع العلامات على الجليكان في الأجنة النامية.
يستخدم وضع العلامات الأيضية للتحقيق في آلية الخلية. يتم تحقيق ذلك باستخدام نظائر كيميائية لاستكشاف التحولات والتعديلات الكيميائية الحيوية التي تحدث. سيعرض هذا الفيديو مبادئ وضع العلامات الأيضية ، وإجراءات وضع العلامات النظيرية النموذجية والتفاعلية الضوئية ، وبعض التطبيقات.
يمكن إجراء وضع العلامات الأيضية باستخدام عدد من الاستراتيجيات. سنصف هنا الملصقات النظيرية والتفاعلية الضوئية والمتعامدة الحيوية.
يتم إجراء وضع العلامات النظيرية باستخدام نظائر هيكلية متطابقة كيميائيا مع نظيراتها الطبيعية ، ولكن تحتوي على نظائر غير شائعة مدمجة في هيكلها. في هذا التناظرية L-lysine ، يتم استبدال ذرات الكربون والنيتروجين بالكربون 13 والنيتروجين 15. الخلايا المزروعة في وجود نظائر نظائرية ستدمجها في هياكلها الكيميائية الحيوية. يتم جمع المستقلبات من الخلايا وتنقيتها لتحليلها. يتم تحليل العينات ذات النظائر المستقرة باستخدام تقنيات مثل قياس الطيف الكتلي أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. يتم تحليل العينات ذات الملصقات المشعة باستخدام عد التلألؤ السائل وأفلام الأشعة السينية ، والتي سيتم إظهارها في بروتوكول وضع العلامات النظيرية.
الملصقات التفاعلية الضوئية هي مجموعات وظيفية مدمجة في البروتينات ، والتي تكون مستقرة حتى تتعرض للأشعة فوق البنفسجية. تشكل المجموعة الوظيفية جذريا تفاعليا يرتبط بأقرب بروتين. مثال شائع ، L-photo-leucine ، يحتوي على حلقة ديازيرين ، وهي عبارة عن رابط متشابك تفاعلي ضوئي. على عكس وضع العلامات النظيرية ، هناك بعض الاختلاف الكيميائي بين نظائرها الكيميائية التفاعلية للضوء ونظيراتها الطبيعية. قد تدمج الخلايا بشكل تفضيلي مركبات طبيعية على نظائرها. لذلك ، من المهم إجراء وضع العلامات التفاعلية للصور في وسط خال من المركب الذي يتم تقليده. بمجرد تعرضها للأشعة فوق البنفسجية ، تصبح المجموعات التفاعلية الضوئية في البروتين المسمى غير مستقرة وشديدة التفاعل ، مما يؤدي إلى ارتباطها بالبروتينات المتفاعلة ، مما يؤدي إلى تكوين مركب بروتيني تعمل المجمعات المتشابكة كلقطات يمكن تحليلها بعد ذلك باستخدام SDS-PAGE وطرق قياس الطيف الكتلي. يوفر هذا نظرة ثاقبة حول التفاعلات التي تحدث في مسار التمثيل الغذائي من خلال تحديد أنواع التفاعل وكيفية تفاعلها من خلال تحديد مواقع الربط.
تستخدم استراتيجيات وضع العلامات المتعامدة الحيوية نظائر ذات مجموعات وظيفية صغيرة ليس لها تفاعل يذكر أو معدوم مع الجزيئات الحيوية الطبيعية. على سبيل المثال ، الأزيدات عبارة عن مجموعات وظيفية صغيرة ، يقال إن تفاعلها متعامد مع التفاعلات الكيميائية الحيوية. في ربط Staudinger ، تهاجم مجموعة الفوسفين مجموعة azido. ينتج عن هذا حالة انتقالية تتفاعل داخل الجزيئية مع إستر قريب ، مما ينتج عنه ترابط مرتبط بالأمين. يمكن ربط المجموعات الوظيفية المتعامدة الحيوية المدمجة في الجزيئات الحيوية بعلامات الكشف مثل المجموعات الوظيفية الفلورية وعلامات التقارب مثل المستضدات.
الآن بعد أن تمت مناقشة بعض المفاهيم والاستراتيجيات الخاصة بوضع العلامات الأيضية ، دعونا نلقي نظرة على العملية في المختبر.
تتمثل الخطوة الأولى في تجربة وضع العلامات الأيضية في جمع البروتين محل الاهتمام. للقيام بذلك ، تزرع الخلايا على طبق ، ويتم استخدام طريقة التعبير لتعزيز تخليق البروتين المطلوب. في هذا المثال ، يتم التعبير عن الكينازات المتكررة الغنية بالليوسين ، أو LRRK. يستخدم فوسفات ثنائي الصوديوم ، الذي يحتوي على الفوسفور المشع -32 ، كنظير. يجب اتخاذ التدابير المناسبة للحماية من الإشعاع المؤين. ويشمل ذلك إنشاء منطقة عمل ، وارتداء معدات الحماية المناسبة ، والتحقق من التلوث الإشعاعي. بمجرد اتخاذ تدابير السلامة ، يتم تحضير الوسط الذي يحتوي على نظائر النظائر. تتم إزالة الوسط من الثقافة واستبداله بوسيط يحتوي على نظائرها الكيميائية النظيرية ثم يتم احتضانه. بعد الحضانة ، يتم تحلل الخلايا. يتم جمع المحللة وتنقيتها.
بعد التنقية ، يتم حل البروتينات باستخدام SDS-PAGE ثم نقلها إلى غشاء PVDF. يتم إجراء التصوير الشعاعي الذاتي عن طريق تعريض الغشاء لفيلم الأشعة السينية وقياسه باستخدام جهاز تصوير الفوسفور. يستخدم النشاف الغربي لقياس مستويات البروتين النسبية في غشاء PVDF. في هذا المثال ، تم قياس مستويات الفسفرة في الكينازات المتكررة الغنية بالليوسين المركبة في خلايا 293T. يوضح مخطط الأشعة الذاتية كمية الفوسفور التي تم دمجها في البروتين. يوضح النشاف الغربي مستويات بروتينات LRRK. يستخدم برنامج تحليل الصور للحصول على بيانات كمية لمستويات فسفرة البروتينات.
في هذا الإجراء التالي ، يتم عرض الملصقات التفاعلية الضوئية. أولا ، يتم تحضير الخلايا وزراعتها. يضاف التناظري التفاعلي الضوئي إلى الخلايا في مرحلة منتصف السجل ويحتضن. في هذا الإجراء يتم استخدام p-benzoylphenylalanine. يتم جمع العينات على فترات ووضعها على الجليد. ثم يتم عرض العينات للحصول على لقطات من المسارات الكيميائية الحيوية بمرور الوقت. ثم يتم تنقية البروتينات ذات الأهمية وحلها باستخدام SDS-PAGE.
تم استخدام استراتيجية وضع العلامات التفاعلية الضوئية لتحديد المركبات التي تتفاعل مع البروتين محل الاهتمام. يظهر الكشف المناعي باستخدام النشاف الغربي نطاقات بروتينية تشير إلى وجود بروتينات ذات وزن جزيئي أعلى في العينات المشععة. هذه ناتجة عن الربط المتقاطع بسبب تفاعل البروتين والبروتين الذي يحدث أثناء الأشعة فوق البنفسجية.
الآن بعد أن راجعنا إجراءات وضع العلامات الأيضية ، دعنا نلقي نظرة على بعض طرق استخدام العملية.
يمكن توسيع مفاهيم وضع العلامات الأيضية على الكائنات متعددة الخلايا. تزرع النباتات في بيئة محكمة الغلق وغنية بالنظائر المستقرة لإنتاج مواد نباتية مصنفة. يضاف ثاني أكسيد الكربون المحتوي على الكربون 13 إلى العلبة ، بينما يتم استخدام الأسمدة الغنية بالنيتروجين 15. يمكن أن تساعد المواد النباتية المحصودة الناتجة في الإجابة على أسئلة حول تدوير الكربون والنيتروجين من النظام البيئي.
يتيح وضع العلامات فصل الحمض النووي الريبي المركب حديثا عن الحمض النووي الريبي الأقدم. من خلال تغيير التركيز الأولي للتناظرية ، يمكن تحديد حركية تخليق الحمض النووي الريبي الجديد. تظهر النتائج أن تركيز 4-ثيوريدين يؤثر على مقدار الحمض النووي الريبي الجديد الذي يتم نسخه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس معدلات دمج الملصق في الحمض النووي الريبي مباشرة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
باستخدام كيمياء النقر ثنائية التعامد ، يمكن تسمية الجليكان في جنين أسماك الحمار الوحشي. يتم حقن البيض بمركب وضع العلامات الذي ينتج عنه ملصقات الألكين على الجليكانات. ثم يتم ربط الجليكان الموجود في اليرقات بمركب صبغة في مرحلة التطور المطلوبة. ثم يتم تصوير الجليكان في الأجنة. يمكن تحديد الجليكان المنتجة في نقاط زمنية مختلفة عن طريق وضع العلامات باستخدام ألوان مختلفة في مراحل مختلفة من نمو الجنين.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول وضع العلامات الأيضية. وصف هذا الفيديو المفاهيم الكامنة وراء وضع العلامات الأيضية واستراتيجياتها ، وتناول إجراءين عامين ، وغطى بعض استخدامات التقنيات.
شكرا للمشاهدة!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:31
Principles of Metabolic Labeling
3:39
Isotopic Labeling Procedure
5:30
Photoreactive Labeling Procedure
6:31
Applications
8:06
Summary
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved