يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وما قبل السريرية الفئران نموذج من الانبثاث الكبدي

30.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51677

⸱

سبتمبر 27, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Surgery, University of Colorado Anschutz Medical Campus

في هذه المقالة

ملخص

A، نموذج الفئران قبل السريرية الانبثاث الكبدي تنفيذ عبر تقنية الحقن hemispleen.

الملخص

وقد وضعت العديد من نماذج الفئران لدراسة السرطانات البشرية وتعزيز فهم علاج السرطان والتنمية. هنا، يتم وصف وقبل السريرية، نموذج الفئران ورم البنكرياس الانبثاث الكبد عن طريق الحقن hemispleen من الخلايا السرطانية في البنكرياس الفئران مسانج. هذا النموذج يقلد الكثير من الحالات السريرية في المرضى الذين يعانون من المرض المنتشر في الكبد. الفئران تتطور باستمرار الانبثاث في كبد السماح للتحقيق في عملية النقيلي، اختبار العلاج التجريبي، والبحوث ورم المناعة.

المقدمة

غدية الأقنية البنكرياسية (PDA) هو رابع سبب لوفيات السرطان ذات الصلة في الولايات المتحدة 1. بقاء خمس سنوات لمرضى PDA النقيلي هو 2-12٪ 1. على الرغم من أن العلاج الكيميائي المساعد والمواد الجديدة المساعدة لسرطان البنكرياس هو أكثر فعالية اليوم من أي وقت مضى، لا يزال هناك حاجة ماسة لعلاجات جديدة.

تطوير علاجات جديدة تستلزم النماذج الحيوانية قبل السريرية موثوقة. على الرغم من أن نماذج ورم تحت الجلد هي واضحة للاستخدام، وتشمل عيوب عدم قدرة هذه الأورام إلى metastasize وتحاكي تطور الورم وmicroenvironments ينظر في السرطانات البشرية. النماذج المعدلة وراثيا، مثل الماوس المعدلة وراثيا تحتوي على البروتين p53 KRAS والضربة القاضية في الطفرات أنكجنيك (نموذج KPC) 2 ونموذج مؤسسة البترول الكويتية مع النسب التتبع YFP (نموذج PKCY) 3 تسمح لدراسة الأورام التي تحدث بشكل طبيعي في immunocompeteالفئران الإقليم الشمالي. بالإضافة إلى ذلك، المكروية الورم هي دون تغيير وتشبه عن كثب ما تشهده تطور الورم البشري. للأسف، توقيت تطوير ورم متغير ضمن هذه النماذج، الأمر الذي يجعل من الصعب دراسة العلاجات التجريبية. بالإضافة إلى ذلك، backcrossing من هذه الفئران يتطلب قدرا كبيرا من الوقت والالتزام المالي، وهي ليست دائما ممكنة. أخيرا، تستلزم نماذج الماوس طعم أجنبي PDA زرع المناعة الفئران، والتي غيرت أو microenvironments الورم غائبة. ونتيجة لذلك، فإن فعالية العلاجات التجريبية أثبتت في هذه النماذج قبل السريرية غالبا ما تكون غير قابلة للتكرار في التجارب السريرية البشرية 4.

هذا نموذج الفأر hemisplenectomy يستخدم الخلايا السرطانية Panc02، والتي هي، ميثيل كولانترين يسببها البنكرياس خط الخلية السرطانية مكون للأورام عالية المستمدة من C57BL / 6 الفئران 5، 6. بالإضافة إلى ذلك، خطوط الخلايا PDA الفئران الأخرى المستمدة من هيئة التصنيع العسكري مؤسسة البترول الكويتيةه يمكن استخدامها في هذا النموذج. Schulick وآخرون قد وضعت سابقا تقنية hemisplenectomy وخلق نموذج الفأر مسانج الانبثاث سرطان القولون 7. هذا النموذج hemisplenectomy (الشكل 1) تقدم ثابت ومتساو التلقيح الورم في الفئران مناعيا الإقراض نفسها إلى التحقيق في العوامل العلاجية رواية 7-10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تتفق جميع التجارب على الحيوانات إلى المبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة جونز هوبكنز، وتمت المحافظة على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجمعية للتقويم والاعتماد للرعاية المختبرات (AAALAC). يتم إجراء العملية الجراحية تحت ظروف معقمة في غرفة العمليات التي يخضع ما لا يقل عن خمسة عشر تبادل الهواء في الساعة. يتم تعقيم جميع الأدوات قبل التعقيم قبل الإجراء ومرة ​​أخرى مع الايثانول 70٪ بين كل الماوس أثناء العملية. يصرح باستخدامها كل الفئران التي لا يتوقع أن يعيشوا العملية الجراحية تحت CO 2 لمدة 3 دقائق تليها خلع عنق الرحم في حين لا يزال تحت التخدير.

1. خلية التحضير

  1. الخلايا resuspend Panc02 مثقف في الفوسفات مخزنة المالحة في 2 X10 7 خلية / مل، والحفاظ على الجليد.

2. ماوس التحضير

  1. إدارة Ketaminه (100 ملغ / كلغ) مختلطة مع زيلازين (10 ملغ / كلغ) داخل الصفاق إلى 8-12 أسبوع من العمر C57BL / 6 الفئران الإناث مقسمة على جرعات.
  2. تحقق لمعرفة أن قرصة أخمص قدميه الانسحاب المنعكس هو إلغاء لضمان أن الفأر هو تخدير كامل.
  3. إدارة جرعات إضافية من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) مختلطة مع زيلازين (10 ملغ / كلغ) حسب الحاجة للتخدير الكامل الفئران.
  4. تطبيق Puralube الطبيب البيطري مرهم للعيون من الفئران لمنع جفاف في حين أن الفئران تحت التخدير.
  5. حلق المنطقة الجراحية من الفئران لتفادي تلوث الجرح.
  6. الإعدادية المنطقة تحت الضلع الأيسر من شق مع الايثانول 70٪ ثم اليود.
  7. وضع ثنى الجراحية حول البطن للحفاظ على العقم.

3. البطن

  1. إجراء شق تحت الضلع الأيسر في خط مع الأذن اليسرى عن طريق الجلد وعن طريق الغشاء البريتوني باستخدام مشرط.
  2. التعبير عن الطحال من خلال شق طريق تطبيق ص الرقمي المتزامنressure على طول جوانب الجمجمة والذيلية من شق.
  3. تحديد موقع الأوعية الدموية الطحال في نهاية السفلي من الطحال.
  4. تقسيم الطحال عن طريق وضع اثنين الأفق متوسطة الحجم مقاطع ligating في وسط الطحال والحرص على تجنب إتلاف الأوعية الدموية الطحال في القطبين الطحال.
  5. وضع القطب العلوي من الطحال العودة الى الصفاق لتجنب التلوث.

4. ورم حقن

  1. وضع 150 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة الى 26 G س 5/8 "حقنة.
  2. وضع 100 ميكرولتر من Panc02 (2 X10 6) خلايا في نفس حقنة الحفاظ على حقنة في وضع رأسي في جميع الأوقات خلال الحقن.
  3. تراجع الإبرة في محلول الإيثانول 70٪. وتراجع إبرة في الايثانول 70٪ لضمان العقم.
  4. حقن الخلايا ببطء في hemispleen تتعرض يجري التأكد يتم الاحتفاظ حقنة تستقيم في جميع الأوقات. شطبة من syrinينبغي مراعاتها جنرال الكتريك في جميع الأوقات من خلال كبسولة الطحال لتجنب حقن الخلايا تحت الطحال. يجب وحظ تبييض الأوعية الطحال والدم على الحقن.
  5. رفع الطحال وتطبيق احدة متوسطة الأفق كليب تحت الطحال إلى انسداد الأوعية الدموية الطحال.
  6. تطبيق مقطع واحد الأفق صغير إلى الجانب الأكثر البعيدة من البنكرياس والطحال السفن.
  7. Ligate البنكرياس والطحال السفن من hemispleen عن طريق خفض فوق مقاطع الأفق.
  8. ضع الماوس على 'جانبها، ولري شق بالماء المقطر.

5. إغلاق البطن والشفاء من التخدير

  1. إغلاق الصفاق مع غرزة 4-0 على التوالي.
  2. تطبيق 2-3 مقاطع الجلد لإغلاق شق الجلد.
  3. إدارة 0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين أو 5-10 ملغ / كغ كاربروفين تحت الجلد لتخفيف الألم بعد الجراحة.
  4. ضع الماوس على وسادة التدفئة للتفصيلأوفري حتى المحمول والماوس يوضح أنماط التنفس العادية. يتم إرجاع الحيوانات فقط على الشركة من الحيوانات الأخرى بعد تعافيه تماما من العملية الجراحية.

6. التشريح وفحص حصاد الكبد

  1. ما بين 30 إلى 60 يوما بعد الجراحة، وسوف تبدأ الفئران لتظهر الأعراض السريرية لورم خبيث، وسوف تتطلب القتل الرحيم. وتشمل علامات المرض المنتشر تتطلب القتل الرحيم إنسانية البطن الموسع وتطوير الاستسقاء. الموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق CO 2.
  2. بعد استنشاق، نفذ خلع عنق الرحم.
  3. بعد أن تم تحديد الحيوان أن تكون غير مستجيبة، من خلال إجراء شق الصفاق لفضح البطن باستخدام مقص.
  4. باستخدام ملقط ومقص، وقطع بلطف الكبد من البطن.
  5. وضع الكبد في أكتوبر المجمع، وفلاش تجميد باستخدام النيتروجين السائل. تخزين الكبد في -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، يعيشص يمكن أن تكون ثابتة في 16٪ من الفورمالين محايدة مخزنة في RT لمدة 24 ساعة وجزءا لا يتجزأ من البارافين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

خلايا الورم Panc02 حقنها في hemispleen (الشكل 1) الانبثاث الكبد النموذج في 100٪ من الفئران، بينما لا يلاحظ الرئة والانبثاث البريتوني إذا تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح. وقد تم تنفيذ هذه التقنية على أكثر من مائة الفئران باستخدام الخلايا في Panc02 متعددة، تجارب مستقلة، وبتكاثر، كل الفئران غير المعالجة يموت مع الانبثاث الكبد بين 30 و 60 يوما بعد إجراء hemisplenectomy (الشكل 2). للحصول على دلالة إحصائية بين المجموعات غير المعالجة والمعالجة، وهناك حاجة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا نموذج الفئران قبل السريرية لورم خبيث في البنكرياس السرطان إلى الكبد عن طريق تقنية الحقن hemispleen هو النموذج الأول وصف يعكس العديد من الحالات السريرية والمناعية للمرضى الذين يعانون من المرض المنتشر في الكبد. هذا النموذج يقدم العديد من المزايا على نماذج الفئران الأخرى. أولا، على عكس النماذج المعدلة وراثيا من سرطان البنكرياس الذي 30٪ فقط من الفئران تطوير الانبثاث إلى الكبد وتوقيت تشكيل الانبثاث هو متغير تماما، وهذا النموذج يوفر ميزة الحصول باستمرار ورم خبيث في الكبد إلى 100٪ من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم الصراعات ذات الصلة التي تهم الكشف عنها.

شكر وتقدير

KF وKO وشارك في أول الكتاب إلى جانب KS

وأيد هذا العمل في جزء من زمالة AHPBA (KS)، NIH K23 CA148964-01 (LZ)، وكلية جونز هوبكنز للطب جائزة السريرية عالم (LZ)، ومؤسسة Viragh ومركز السرطان تخطي Viragh البنكرياس في جامعة جونز هوبكنز (EMJ و LZ)، المؤسسة الوطنية البنكرياس (LZ)، وLefkofsky الأسرة مؤسسة (LZ)، وSPORE NCI في الجهاز الهضمي السرطان P50 CA062924 (EMJ، LZ)، ومؤسسة Lustgarten (LZ)، ومنح مركز سول غولدمان سرطان البنكرياس (KS ، BHE، LZ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسائط ومكوناتاعتمادا على خط الخلية
الفوسفات المخزن الملحيGibco من Life Technologies10010-023
أنابيب الطرد المركزي 15 مل Corning430052
مقص التشغيل المنحنيRoboz Surgical StoreRS-6835
Dissecting Graefe FallpsRoboz Surgical StoreRS-5130
(عادي)خياطة
3-0 أو 4-0من قسم الجراحة ، جونز هوبكنز
Weck Horizon مقاطع ربط متوسطة Teleflex002200
Weck Horizon مشابك ربط صغيرةTeleflex001200
حقنة ، 1 سم مكعب ، حقنة سل ، طرف انزلاق 3/8 بوصة309625Becton Dickinson
، 1 سم مكعب ، حقنة TB ، طرف انزلاق 5/8 بوصةBecton Dickinson309597
9 مم Autoclip ApplierMikron427630
9 مم أوتوككليببيكتون ديكنسون427631
وسادة تسخينشعاع الشمسCAT93
70٪ إيثانوليباع من قبل العديد من البائعين
الكيتامين هيدروكلوريد   ؛هوسبيرا22395DD
زيلازين هيدروكلوريدسيجماX1251
ستختلف زراعة الخلايا Micro حامل إبرة World Precision Instruments، Inc مقدمة ويك هورايزون مفتوح ربط كليب التطبيق ، صغير ، بزاوية Teleflex 137085 Weck Horizon Open Ligating Clip Applier ، متوسط ، بزاوية Teleflex 237115 حقنة

المراجع

  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
  2. Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
  3. Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
  4. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
  5. Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
  6. Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
  7. Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
  8. Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
  9. Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
  10. Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
  11. Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
  12. Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
  13. Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نموذج ورم البنكرياستقنية نصف الطحالنموذج سرطان فأريتشريح الكبدالتصوير غير الباضعاختبار العوامل العلاجيةأبحاث مناعة الأورامخلايا ورمية متماثلة جينياًمراقبة البقاء على قيد الحياة
وما قبل السريرية الفئران نموذج من الانبثاث الكبدي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.