مقالة منهجية

تكلس الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء والتصوير من الأورطي تكلس والتهاب

20K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54017

⸱

مايو 31, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تكلس الأوعية الدموية هو مؤشر مهم ومساهم في أمراض القلب والأوعية الدموية البشرية. يصف هذا البروتوكول طرق تحفيز تكلس خلايا العضلات الملساء الوعائية الأولية المزروعة وتحديد التكلس وعبء البلاعم في الشريان الأورطي الحيواني باستخدام التصوير الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القريبة.

الملخص

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في العالم. تتطور لويحات تصلب الشرايين ، التي تتكون من البلاعم المحملة بالدهون والتكلس ، في الشرايين التاجية والصمام الأبهري والشريان الأورطي والشرايين القناة الطرفية وهي السمة المميزة لأمراض القلب والأوعية الدموية. في البشر ، يسمح التصوير بالتصوير المقطعي المحوسب بالقياس الكمي لتكلس الأوعية الدموية. يعد وجود تكلس الأوعية الدموية مؤشرا قويا على أحداث القلب والأوعية الدموية المستقبلية. يعتمد تطوير علاجات جديدة في أمراض القلب والأوعية الدموية بشكل حاسم على تحسين فهمنا للآليات الجزيئية الأساسية لتصلب الشرايين. يعتمد تطوير معرفتنا بآليات تصلب الشرايين على النماذج القائمة على الفئران والخلايا. هنا ، يتم تفصيل طريقة لتصوير تكلس الأبهر وتسلل البلاعم باستخدام مجسات تصوير الفلورسنت القريبة من الأشعة تحت الحمراء المتميزة طيفيا. يسمح التصوير الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القريبة بالقياس الكمي خارج الجسم الحي للتكلس وتراكم البلاعم في الشريان الأورطي بأكمله ويمكن استخدامه لتعزيز فهمنا للعلاقة الميكانيكية بين الالتهاب والتكلس في تصلب الشرايين. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف طريقة لعزل واستزراع خلايا العضلات الملساء الوعائية الأبهرية الحيوانية وبروتوكول لتحفيز التكلس في خلايا العضلات الملساء المستنبتة من الشريان الأورطي الفأري أو من الشرايين التاجية البشرية. يمكن استخدام هذه الطريقة المختبرية لنمذجة تكلس الأوعية الدموية لتحديد وتوصيف مسارات الإشارات التي يحتمل أن تكون مهمة لتطور أمراض الأوعية الدموية ، على أمل اكتشاف أهداف جديدة للعلاج.

المقدمة

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفيات والأمراض في العالم، بما في ذلك الولايات المتحدة حيث تمثل ما يزيد عن 780،000 حالة وفاة سنويا. 1 التاجي تكلس الشرايين وتكلس الأبهر هي السمات المميزة لمرض تصلب الشرايين ويعمل تنبؤ قوية اعتبارا من أحداث القلب والأوعية الدموية. 2- تم الإبلاغ عن 4 نوعان رئيسيان من تكلس الأوعية الدموية لدى البالغين: تكلس باطنة، يرتبط مع تصلب الشرايين، وسطي (المعروف أيضا باسم منكيبيرغ) تكلس، ويرتبط مع مرض الكلى المزمن ومرض السكري يحدث 5 باطنة تكلس في الإعداد لتراكم الدهون والبلاعم. تسلل إلى جدار الوعاء الدموي يحدث 5،6 الإنسي تكلس جدار مستقل عن تكلس باطنة، يموضع للألياف الإيلاستين أو خلايا العضلات الملساء، وغير مقترن ترسب الدهون أو تسلل بلعم. 5،7،8 دراسات عن الآليات الجزيئية لوقد اعتمدت تكلس الأوعية الدموية على أنظمة نموذج قائم على الخلايا والحيوانات. وتشمل نماذج القوارض لمرض atherocalcific الفئران التي تعاني من نقص في أي ئي E (APOE) 9،10 أو منخفض الكثافة مستقبلات البروتين الدهني (LDLR) 11 تغذت على وجبات عالية الدهون، في حين تشمل نماذج للتكلس وسطي الفئران مع مصفوفة غلا البروتين (مجان) نقص 12 أو الفئران التي تعاني بولينا إما عن طريق استئصال الكلية شبه الكامل (نموذج استئصال الكلية 5/6) أو عن طريق التعرض لاتباع نظام غذائي عالي الأدينين 13

هنا، يركز نموذج من تكلس الأوعية الدموية وسطي المرتبطة نقص مجان جرا. مجان هو بروتين الخلية الذي يمنع تكلس الشرايين. وقد تم تحديد 12 الطفرات في الجين مجان في متلازمة Keutel، وهو مرض يصيب الانسان نادر يتصف تكلس الغضاريف منتشر بالإضافة إلى brachytelephalangy، فقدان السمع، وتضيق الرئوي الطرفية 14-18 على الرغم من عدم كثيرا ما لاحظت، 19وقد وصفت تكلس متحدة المركز الشرايين متعددة في متلازمة Keutel. وترتبط 20 الأشكال الشائعة في الجين مجان البشري مع خطر متزايد للتكلس الشريان التاجي، 21-23 بينما مستويات تداول أعلى من uncarboxylated، مجان غير نشط بيولوجيا تتوقع وفيات القلب والأوعية الدموية. 24 وخلافا للبشر مع متلازمة Keutel والفئران التي تعاني من نقص مجان تطوير النمط الظاهري الأوعية الدموية الشديدة التي تتكون من تلقاء أنفسهم تكلس الشرايين على نطاق واسع ابتداء من اسبوعين من العمر ويموت 6-8 أسابيع بعد الولادة بسبب تمزق الشريان الأورطي. 12

على عكس APOE - / - وLDLR - / - الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون، التي تنمي تكلس الأوعية الدموية باطنة مع المرتبطة التهاب الناجم عن بلعم، مجان - / - الفئران تطوير تكلس الأوعية الدموية وسطي في غياب تسلل بلعم 11،25 وعلى الرغم من وتشير هذه النتائج المحفزات الأساسية مختلفة لintimالقاعدة وتكلس وسطي، وهناك تداخل في آليات الإشارات التي تتوسط كلا أشكال تم تحديدها تكلس 26 مسارات الإشارات المتعددة التي تساهم في تكلس الأوعية الدموية بما في ذلك وسطاء التهابات مثل عامل نخر الورم α و IL-1 والعوامل المؤيدة للالمكونة للعظم مثل الشق، WNT، والبروتين المخلق للعظم (BMP) الإشارة. 27،28 تزيد هذه مسارات إشارات التعبير عن عوامل النسخ المتعلقة قزم عامل النسخ 2 (Runx2) وosterix، والتي بدورها تزيد من التعبير عن البروتينات ذات الصلة العظام ( . على سبيل المثال، أوستيوكالسين، sclerostin، والفوسفاتيز القلوية) في الأوعية الدموية التي تتوسط تكلس 28-30 نحن وغيرنا قد أظهرت أن تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في APOE - / - وLDLR - / - تغذية الفئران حمية عالية الدهون وعفوية تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في مجان - / - الفئران وكلها تعتمد على البروتين المخلق للعظم (BMP) سيgnaling، وأنه هو هذا المسار تركز على هنا. 11،25،31 أفضل الممارسات الإدارية هي العوامل المكونة للعظم قوية المطلوبة لتكوين العظام، ومن المعروف أن تظهر زيادة التعبير في تصلب الشرايين البشرية. وقد تورط 32-34 في الدراسات المختبرية BMP الإشارات في تنظيم التعبير عن العوامل المكونة للعظم مثل Runx2. 35-37 overexpression من يجند BMP، BMP-2، ويسرع تطوير تكلس الأوعية الدموية في الفئران APOE التي تعاني من نقص تغذية نظام غذائي عالي الدهون. 38 وعلاوة على ذلك، فإن استخدام BMP محدد يشير مثبطات مثل هذه كما LDN-193189 (LDN) 39،40 و / أو ALK3-FC يمنع وضع تكلس الأوعية الدموية في كل من LDLR - / - الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون والفئران التي تعاني من نقص مجان 11،25.

الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء (VSMCs) دورا حاسما في تطوير تكلس الأوعية الدموية. 30،41،42 وتكلس الأوعية الدموية وسطي أن يتطور في مجان التي تعاني من نقص الفئران هو characterized من قبل transdifferentiation من VSMCs إلى النمط الظاهري عظمي المنشأ. ويؤدي فقدان مجان في التعبير انخفض من علامات VSMC بما في ذلك myocardin وألفا الأكتين العضلات الملساء، مع ما يصاحب ذلك ارتفاع في علامات المكونة للعظم مثل Runx2 وosteopontin. وتتزامن هذه التغيرات مع تطور تكلس الأوعية الدموية. 25،43،44

وعادة ما يتم تقييمها تكلس الشريان الأورطي والتهاب في الفئران باستخدام تقنيات النسيجية مثل نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية للتكلس المبكر والنشاط عظمي المنشأ، فون كوسا والصبغ الأحمر تلطيخ الأحمر في أواخر تكلس، والبروتوكولات المناعى التي تستهدف علامات البروتين بلعم (على سبيل المثال، CD68، F4 / 80، ماك-1، ماك-2، ماك-3). 9،45 ومع ذلك، هذه التقنيات التصوير القياسية تتطلب معالجة الأنسجة الأبهري في المقاطع العرضية، والتي هي مضيعة للوقت وغير كامل بسبب التحيز لأخذ العينات، وتقتصر في حياتهم القدرة على تحديد الالتهاب وcalcificatايون في الشريان الأورطي كله. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصور وتحديد كله الأبهر والمتوسطة تكلس الشرايين وتراكم بلعم باستخدام الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد) التصوير الجزيئي خارج الحي. كما قدم هو طريقة للحصاد وزراعة VSMCs الأبهر الأولية من الفئران وتحريض تكلس الفئران وVSMCs البشرية في المختبر من أجل تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية تكلس. توفر هذه التقنيات المحقق مع كل من في الحي وفي أساليب المختبر لدراسة مرض atherocalcific.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت جميع الدراسات على الفئران بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على السكن وجميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران وصفها في هذه الدراسة من قبل مؤسسات الرعاية الحيوانية واللجان استخدم من مستشفى ماساتشوستس العام (اللجنة الفرعية للبحوث رعاية الحيوان). تم تنفيذ كافة الإجراءات مع الحرص على تقليل المعاناة.

1. إعداد الكواشف

  1. بالقرب من الأشعة تحت الحمراء الإسفار التصوير من الجامعة Aortas
    ملاحظة: A-المستمدة البايفوسفونيت، بالقرب من الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت التصوير التحقيق يمكن أن تستخدم للاحتفال النشاط عظمي المنشأ في الأوعية الدموية عن طريق ملزمة لهيدروكسيباتيت 46،47 الفلورسنت التحقيق التصوير تنشيط كاثبسين يمكن أن تكون بمثابة علامة للحصول على بروتين بلعم والنشاط حال النسيج المرن في الأوعية الدموية. 9 للسماح الاستخدام المتزامن لكلا تحقيقات الفلورسنت، فمن المهملاستخدام المجسات التي تختلف طيفيا. الكالسيوم تدوين قوائم الجرد الوطنية وسوف تستخدم للإشارة إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة التحقيق الفلورسنت التصوير وكاثبسين الجرد الوطني تكلس محددة للدلالة على كاثبسين النشاط المحدد الأشعة تحت الحمراء القريبة التحقيق الفلورسنت التصوير.
    1. إعداد الحلول من الكالسيوم الجرد الوطني وكاثبسين الجرد الوطني. وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة، إضافة 1.2 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى القارورة التي تحتوي على 24 نانومول من الكالسيوم الجرد الوطني أو كاتيبسين الجرد الوطني ويهز بلطف.
      ملاحظة: وفقا لالصانع، أعيد مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، تبقى الحلول الجرد الوطني الكالسيوم وقوائم الجرد الوطنية كاثبسين مستقرة لمدة 14 يوما عند تخزينها في الظلام في 2-8 درجة مئوية.
  2. العزلة وتكلس الفئران الأورطي VSMCs
    1. الأورطي الهضم الحل:
      1. يعد حل الطازجة (~ 3-5 مل لكل الشريان الأورطي المقطوع) مع محلول ملح هانك المتوازن (HBSS) التي تحتوي على 175 وحدة / مل نوع 2 كولاجيناز و 1.25 U / الإيلاستاز مل. تعقيم الحل ثإيث نظام الترشيح 0.22 ميكرون يحركها الفراغ والحفاظ على حل على الجليد حتى الاستخدام.
    2. وسائل الإعلام الخلية:
      1. تكملة 500 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل الجنين البقري، و 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
    3. تكلس وسائل الإعلام:
      1. تكلس وسائل الإعلام و(NaPhos، وتستخدم في خطوط الخلايا الماوس):
        1. تكملة 100-500 مل من DMEM (حجم حسب الحاجة) مع 10٪ مصل الجنين البقري، 2 ملي فوسفات الصوديوم، و 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.

          أو
      2. تكلس وسائل الإعلام ب (βGP / تصاعدي / DEX، تستخدم إما الماوس أو خطوط الخلايا البشرية):
        1. تكملة 100-500 مل من DMEM (حجم حسب الحاجة) مع 10٪ مصل بقري جنيني، ثنائي الصوديوم 10 ملي β-الغليسروفسفات، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك L-10نانومتر ديكساميثازون، و 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.

2. الذيل الوريد حقن

  1. قبل الحقن الذيل، تدفئة الفئران تحت مصباح التدفئة خفيفة لمدة 5 دقائق.
  2. كبح الماوس في حامل أنبوب القوارض. تطهير الذيل مع مسحة الكحول.
  3. استخدام إبرة 30 G للحقن الوريد الذيل. وتقع الأوردة الذيل أفقيا.
    1. ضع كمية لطيف الضغط إلى الأمام على حقنة كما تقدمت الإبرة في الذيل. يتم الوصول إلى الوريد مرة واحدة المقاومة لحقن لم تعد موجودة.
    2. حقن حجم 100 ميكرولتر من الكالسيوم الجرد الوطني و / أو 100 ميكرولتر من كاثبسين الجرد الوطني بمعدل ثابت. في نهاية الحقن، بعد توقف 5 ثانية، سحب الإبرة.
  4. حصاد aortas (انظر القسم 3) 3-24 ساعة بعد الحقن.

3. ماوس تشريح

  1. الموت ببطء الفأر مع 200 ملغم / كغم من حقن بنتوباربيتال داخل الصفاق.
  2. وضع مستلق الحيوانات على متن تشريح والاستقرار عن طريق تسجيل كل مخلب إلى المجلس. باستخدام مجهر تشريح ومقص صغير، وجعل شق خط الوسط تمتد من أسفل البطن إلى القفص الصدري العلوي.
  3. قشر العودة الجلد بالملقط وإزالة الغشاء البريتوني، وكشف عن أعضاء البطن. إزالة الأجهزة الجهاز الهضمي، مع الحرص على عدم القطع الشريان الأورطي.
  4. جعل شق الجانبي في الحجاب الحاجز الأمامي ومواصلة شق في البطن. باستخدام مقص تشريح، والإفراج عن القفص الصدري من خلال قطع الجانبين من أضلاعه وإزالة تمسكا الأنسجة اللينة إلى الجزء العلوي من عظمة القص. إزالة القفص الصدري، وكشف عن الرئتين.
  5. ترك القلب في المكان في البداية (للمساعدة في تحديد وتشريح الشريان الأبهر الداني) وإزالة بعناية الرئتين. إزالة الغدة الصعترية، القصبة الهوائية، والمريء مع الرعاية، ensuriنانوغرام أن الشريان الأورطي لا تزال سليمة.
  6. باستخدام ملقط مباشرة الجميلة ومقص تشريح الصغيرة، وإزالة الأنسجة الناعمة المحيطة الشريان الأورطي من التشعب الحرقفي إلى قوس الأبهر، مع إيلاء اهتمام دقيق عند إزالة شبه الأبهر الدهون (الشكل 1A). إزالة الأنسجة الدهنية وغير المادية المتبقية المحيطة فروع واسعة من قوس الأبهر (أي عضدي رأسي، السباتي المشترك وتحت الترقوة الشرايين، الشكل 1B).
    ملاحظة: من المهم لإزالة الدهون من الشريان الأورطي وذلك لأن الدهون يمكن أن تزيد من إشارة الخلفية أثناء أداء التصوير مضان.
  7. إزالة القلب من تجويف الصدر، فصل بعناية من الشريان الأبهر الداني، وتجاهل. القطع الأبهر القاصي في التشعب الحرقفي. باستخدام إبرة الأنسولين، حقن محلول ملحي في الشريان الأورطي من قوس الأبهر لغسل خلايا الدم المتبقية. فصل الشريان الأورطي جنبا إلى جنب مع السفن قوس الأبهر، إزالته تمامامن الجسم.
  8. وضع الشريان الأورطي في محلول ملحي طبيعي على الجليد حتى جاهزة للتصوير.

4. الأورطي التصوير

  1. aortas صورة فيفو السابقين مباشرة بعد الحصاد من خلال الأشعة تحت الحمراء القريبة التصوير مضان الانعكاس. 25
    1. تعيين تصوير مضان في موجات متعددة القنوات المناسبة لقياس شدة إشارة مضان من aortas من الكالسيوم الجرد الوطني وكاثبسين الجرد الوطني حقن الفئران، كما هو موضح سابقا. 25 وفقا لالصانع، نير الكالسيوم يمكن أن ولع ~ 650-678 نانومتر ضوء مع انبعاث القصوى في ~ 680-700 نانومتر النطاق. كاثبسين الجرد الوطني يمكن أن ولع ~ 745-750 نانومتر الخفيفة مع الانبعاثات القصوى في ~ 770 نانومتر.

5. عزل الابتدائية الفئران الأورطي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

  1. تنفيذ الخطوات 3،1-3،7 كما هو موضح أعلاه.
  2. وضع aortas في HBSS الباردة حتى تشريح كاملة. قطع بعناية بعيدا أي العينيةaining الدهون محيط بالأبهر والأنسجة اللينة، ولم يتبق سوى الشريان الأورطي.
  3. تحت غطاء نسيج الثقافة العقيمة، ونقل aortas إلى الهضم الحل الأورطي في 35 ملم أطباق زراعة الأنسجة × 10 مم. مكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هزاز متقطع لطيف. بعد الهضم، وaortas تبدي مظهر تمدد أو المتوترة.
  4. مع المجهر تشريح وملقط معقم، وإزالة طبقة الغلالة البرانية الخارجية من الشريان الأبهر مع الحفاظ على طبقة وسطي سليمة. أسلوب واحد لإزالة البرانية هي قشر بعيدا عن الطبقة الخارجية من الشريان الأورطي في نهاية واحدة وإزالته من طبقة وسطي الأساسية مثل جورب يمكن مقشر الظهر وإزالتها.
  5. وبمجرد إزالة طبقة الغلالة البرانية، ضع الشريان الأورطي المتبقية في طبق نسيج الثقافة الجديد مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية وتخزينها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 2-4 ساعة.
  6. تحت غطاء العقيمة واستخدام معقم 3 مم مقص تشريح الصغيرة، وقطع الشريان الأورطي إلى 1-2 ملم واسعةخواتم.
  7. ضع هذه الحلقات في طبق نسيج الثقافة الجديد مع الأورطي الهضم الحل واحتضان عند 37 درجة مئوية مع متقطعة لطيف هزاز لمدة 120 دقيقة. ماصة الحل صعودا وهبوطا عدة مرات خلال هذه الحضانة ل resuspend الخلايا.
  8. إضافة 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية الحار الحل الهضم ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  9. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
  10. نضح في وسائل الإعلام والخلايا resuspend في حجم المطلوب من وسائل الإعلام ثقافة الخلية (على سبيل المثال، 5 مل).
  11. لوحة كامل المبلغ من الخلايا المعزولة عن بعضها الشريان الأورطي في 25 سم 2 خلية قارورة الثقافة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. نشر الخلايا باستخدام تقنيات القياسية، كما هو موضح سابقا. 25،48 خلال 7-10 أيام الأولى من الحضانة، وتغيير وسائل الاعلام كل 72-96 ساعة. مع اقتراب الخلايا التقاء، وتجديد وسائل الإعلام أكثر في كثير من الأحيان (كل 48 ساعة).
    ملاحظة: قد يستغرق عدة أسابيع لتنمو منه كافيةntity من الخلايا.
  12. مرة واحدة متموجة، وخلايا مرور مع التربسين التي تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
    1. إضافة 0،5-1،0 مل من التربسين إلى كل قارورة الثقافة واحتضان لمدة 3-5 دقائق. اضغط برفق على جانب قارورة كل 30-60 ثانية حسب الحاجة لفصل الخلايا من السطح.
    2. مرة واحدة فصل الخلايا من الجزء السفلي من القارورة، إضافة 10 مل من وسائل الاعلام الخلايا إلى الخلايا في التربسين. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وسائل الإعلام والتربسين من بيليه الخلية. resuspend الخلايا في المبلغ المطلوب من وسائل الإعلام خلية جديدة (على سبيل المثال، 5-10 مل)، ونقل إلى قارورة جديدة (مع بعض الخلايا نقلها إلى شريحة غرفة).
  13. في مرور الأول من الخلايا، تأكيد سلسة نسب الخلايا العضلية مع تقنيات مناعية القياسية، كما هو موضح سابقا، 49 استخدام أجسام مضادة موجهة ضد α السلس الأكتين العضلات.

6. حمل تكلس العضلات الملساء مثقفخلايا

  1. لوحة الخلايا التي تم الحصول عليها من 5.12 في شكل 6 جيدا. ملاحظة: بدءا من 1 × 10 5 خلية / جيدا في إجمالي حجم 2.0 مل من وسائل الاعلام خلية في ويوصى أيضا.
  2. تسمح للخلايا أن تنمو في تكلس وسائل الإعلام A أو B لمدة 7 أيام على الأقل في شكل لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  3. تغيير وسائل الإعلام خلية كل 48 ساعة.

7. تقييم VSMC تكلس باستخدام فون كوسا يلطخ الطريقة

ملاحظة: وتستند هذه الطريقة فون كوسا لقياس تكلس المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة أو الخلايا المستزرعة على إحلال أيونات الكالسيوم ملزمة الفوسفات مع أيونات الفضة 50 في وجود مركبات الخفيفة والعضوية، ويتم تخفيض أيونات الفضة وتصور كما المعدنية فضي. تتم إزالة أي الفضة غير المتفاعل عن طريق العلاج مع ثيوكبريتات الصوديوم (50) وبروتوكول لفون كوسا تلطيخ على النحو التالي:

  1. وسائل الإعلام نضح من مكعب خليةلوحات lture.
  2. إصلاح الخلايا عن طريق وضعها في 1 مل من 10٪ من الفورمالين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  3. إزالة الفورمالين وغسل الخلايا الثابتة مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
  4. احتضان الخلايا في 1 مل من 5٪ من محلول نترات الفضة تحت لمبة 60-100 W لمدة 1-2 ساعة.
  5. نضح في محلول نترات الفضة ويغسل بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
  6. إزالة الفضة غير المتفاعل من خلال وضع الخلايا في 1 مل من 5٪ وحمض الصوديوم (ث / ت) حل في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
  7. شطف الخلايا مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر يغسل 3X. وصمة عار فون كوسا مستعدة للتصوير مع معيار المجهر الضوئي المقلوب.
  8. خطوة اختيارية: مباين مع 1ml من أحمر سريع النووي لمدة 5 دقائق. اتبع هذا مع ثلاثة يغسل بالماء المقطر (5 دقائق لكل منهما).

أو

8. تقييم VSMC تكلس مع التصوير الفلورسنت القريبة من الأشعة تحت الحمراء

ملاحظة: على غرار قدرتهلتحديد تكلس داخل aortas الماوس، الكالسيوم الجرد الوطني يربط بسهولة المعدنية المكلس أودعتها الخلايا المستزرعة. باستخدام هذه التقنية، المجهر الفلورسنت والقراء لوحة مع مرشحات الطول الموجي الطويل يمكن أن الصور وتحديد في المختبر تكلس، على التوالي. انبعاث الطول الموجي الطويل من الكالسيوم الجرد الوطني يسمح للاستخدام في وقت واحد من أدنى الطول الموجي fluorophores الباعثة للكشف عن غيرها من الميزات. بروتوكول للكالسيوم الجرد الوطني تلطيخ على النحو التالي:

  1. كما هو موضح في القسم 1.1.1، إضافة 1.2 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى القارورة التي تحتوي على 24 نانومول من الكالسيوم الجرد الوطني.
  2. تمييع الكالسيوم الأسهم قوائم الجرد الوطنية 1: 100 في تكلس أو مراقبة وسائل الإعلام المناسبة.
  3. وسائل الإعلام خلية نضح من لوحات ثقافة واستبدالها مع الكالسيوم قوائم الجرد الوطنية التي تحتوي على وسائل الإعلام والثقافة.
  4. احتضان لوحات الثقافة مع وسائل الإعلام الجرد الوطني الكالسيوم ليلا 37 درجة مئوية.
  5. نضح في وسائل الإعلام من الآبار، ويغسل الآبار مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: عند هذه النقطة،يمكن إضافة وسائل الإعلام ثقافة الأصلي إلى الآبار، والخلايا يمكن تصوير العيش. خلاف ذلك، انتقل إلى الخطوات التالية.
  6. إصلاح الخلايا عن طريق وضعها في 1 مل من 10٪ من الفورمالين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  7. إزالة الفورمالين وغسل الخلايا الثابتة مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر يغسل 3X.
  8. خطوة اختيارية: قم بإجراء تلطيخ المناعي أو counterstains البعض للبروتينات ذات الاهتمام 8،9
  9. صورة أو كشف وصمة عار الجرد الوطني الكالسيوم باستخدام موجات مضان المناسب الإثارة (مثل قوائم الجرد الوطنية الكالسيوم يمكن ولع 650-678 ضوء نانومتر) والمرشحات الانبعاثات (~ 680-700 نانومتر).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد تم قياس والبرية من نوع الفئران باستخدام التصوير مضان الجرد الوطني الكالسيوم - تكلس الشريان الأورطي في مجان - /. تم الكشف عن أي إشارة الجرد الوطني الكالسيوم في aortas من البرية من نوع الفئران، مما يدل على عدم وجود تكلس (الشكل 2). تم الكشف عن إشارة الجرد الوطني الكالسيوم قوية في aortas من مجان التي تعاني من نقص الفئران، وهو ما يتسق مع تكلس الأوعية الدموية المتقدمة. أقسام الأنسجة من aortas من النوع البري ومجا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تكلس الشرايين هو عامل خطر مهم للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية في البشر ويمكن أن تسهم بصورة مباشرة في التسبب في أحداث القلب والأوعية الدموية. وقد اقترح 1،5،52 باطنة ترسب الكالسيوم في مباراة دولية ليفية رقيقة من مرض تصلب الشرايين لزيادة التوتر النشاط الحيوي المحلي والمساهمة في تمزق الترسبات. 53،54 الآثار تكلس الإنسي النتائج السريرية من خلال زيادة صلابة الشرايين، والتي يمكن أن تحدث تضخم القلب وتؤثر على وظيفة القلب. 55 لذلك، فهم الآليات الجزيئية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تقدم مستشفى ماساتشوستس العام بطلب للحصول على براءات اختراع تتعلق بمثبطات الجزيئات الصغيرة لمستقبلات BMP من النوع الأول وتطبيق ALK3-Fc لعلاج تصلب الشرايين وتكلس الأوعية الدموية ، وقد يحق ل MD و PBY و KDB و RM الحصول على إتاوات.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة Sarnoff لأبحاث القلب والأوعية الدموية (MFB و TET) ، ومعهد هوارد هيوز الطبي (TM) ، وجائزة زمالة Ladue Memorial من كلية الطب بجامعة هارفارد (DKR) ، وبرنامج START لكلية الطب في RWTH Aachen (MD) ، ومؤسسة الأبحاث الألمانية (DE 1685 / 1-1 ، MD) ، والمعهد الوطني للعيون (R01EY022746 ، ESB) ، ومؤسسة Leducq (برنامج متعدد التخصصات لتوضيح دور إشارات البروتين المورفوجيني للعظام في التسبب في أمراض الأوعية الدموية الرئوية والجهازية ، PBY ، KDB ، و DBB) ، والمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلد (R01AR057374 ، PBY) ، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK082971 ، KDB و DBB) ، وجائزة زميل جمعية القلب الأمريكية لأعضاء هيئة التدريس #11FTF7290032 (RM) ، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R01HL114805 و R01HL109506 ، EA. K08HL111210 ، RM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل أنبوب مخروطيFalcon352096
30 G إبرةBD305106
ألفا العضلات الملساء الأكتين الجسم المضادSigmaSAB2500963
الغرفة الشريحةNunc Lab-Tek154461
كولاجيناز ، النوع 2 & nbsp ؛ورثينجتونLS004176
ديكساميثازونسيجماD4902
تقنياتالنسر المتوسطة المعدلة من Dulbecco11965-084
Dulbecco's Phosphate Buffered Salt ، بدون كالسيومGibco14190-144
ElastaseSigmaE1250
مصل الأبقار الجنينيGibco16000-044
ملقط ، نقطة دقيقةRobozRS-4972
ملقط ، منحنى كامل مسننRobozRS-5138
Formalin (10٪)علوم المجهر الإلكتروني15740
محلول الملح المتوازن هانكجيبكو14025-092
خلايا العضلات الملساء للشريان التاجي البشريPromoCellC-12511
حقنة الأنسولين بإبرةTerumoSS30M2913
L-ascorbicSigmaA-7506
مقص زنبركي تشريح دقيق (13 مم)RobozRS-5676
مقص زنبركي دقيق التشريح (3 مم)RobozRS-5610
NIR ، كاتبسين (ProSense-750EX)Perkin ElmerNEV10001EX
NIR، العظم (OsteoSense-680EX)PerkinElmerNEV10020EX
Normal SalineHospira0409-4888-10
نظام تصوير Odyssey الأحمر السريعالنووي Sigma-AldrichN3020
Li-CorOdyssey 3.0
Penicillin / StreptomycinCorning30-001-CI
نترات الفضة (5٪)ريكا شركة كيماويات6828-16
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي هيدراتسيجما ألدريتشS-9390
ثيوسلفات الصوديومسيجماS-1648
ß-جليسيروفوسفات ثنائي الصوديوم ملح هيدراتسيجماG9422
قارورة زراعة الأنسجة ، 25 سم 2< / sup>Falcon353108
زراعة الأنسجة صفيحة (35 مم × 10 مم)الأنسجة 353001الصقر
، ستة آبارفالكون353046
تريبسينكورنينج25-053-CI
حامل القوارض الأنبوبيكينت ساينتفيكRSTR551
نظام الترشيح المدفوع بالفراغMilliporeSCGP00525
acid لوحة زراعة

المراجع

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
  3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
  4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
  5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
  6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
  7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
  8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
  9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
  11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
  12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
  13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
  14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
  15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
  16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
  17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
  18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
  19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
  20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
  21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
  22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
  23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
  24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
  25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098(2015).
  26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
  27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
  28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
  29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
  30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
  31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
  32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
  33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
  34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
  36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
  37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
  38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
  39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
  40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
  42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
  43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
  44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
  45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
  46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
  47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
  48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889(2013).
  49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
  50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
  51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
  52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
  53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
  54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
  55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
  56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
  57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
  58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
  59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
  60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
  61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
  63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
  65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
  66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
  67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
  68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
  69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
  70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
  71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ImageJ

مقالات ذات صلة