متصور النسخة الدوبامين في محطات قبل المشبكي فردية مع FFNs

الناقل العصبي الكاذب الفلوري. يُعد FFN 511 مونوأمين فلوري يمكن أن يعمل كركيزة لناقل المونوأمين الفيزيائي المشبكي عند تطبيقه على شرائح الدماغ. يتم امتصاص FN 511 بواسطة الحويصلات المشبكية الدوبامينية عبر ناقل المونوأمين، ويمكن استخدامه لتصور تحرر الناقل العصبي مباشرة من النهايات قبل المشبكية لعصبونات المونوأمين، مثل تلك الموجودة في الطبقة S. يظهر تحرر الناقل من النهايات في الشريحة على شكل انخفاض في الإشارات الفلورية النقطية.

في هذا الفيديو، يتم تحضير شرائح إكليلية من المخ بسُمك 250 micrometer باستخدام جهاز vibrato، وتُصبغ بـ FFN 511 ويتم تصويرها باستخدام مجهر ليزر متعدد الفوتونات. كما تُعرض تجارب تحفيز تكشف عن تباين في إطلاق iCal يعتمد على التردد. مرحباً، أنا HU من مختبر David s في قسم طب الأعصاب بجامعة Columbia.

مرحباً، أنا مينيرفا من مختبر سولجر أيضاً. سنعرض لكم اليوم إجراءً لوسم نهايات الدوبامين في شرائح الدماغ باستخدام ناقلات عصبية كاذبة فلورية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة إفراز الدوبامين.

لنبدأ الآن. قبل تحضير شرائح السلايس الحادة، يجب أكسجة السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي A CSF وتبريده بالثلج لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل استخراج الدماغ، مع الحفاظ على بقاء A CSF بارداً جداً ومؤكسجاً أثناء عملية التشريح. استخرج الدماغ كاملاً من الفأر وثبته على صينية الاهتزاز (vibram tray)، ثم ضعها على جهاز الاهتزاز باستخدام غراء "كرازي جلو" (crazy glue). يجب إتمام عملية استخراج الدماغ وتثبيته في غضون دقيقتين.

املأ الحوض بشرائح من الدماغ مقطوعة بشكل إكليلي مستقيم في سائل A CSF مبرد ومؤكسج وبسماكة 250 micrometer بين +1.54 إلى +0.623. سيتم الحصول على 3 شرائح، والتي يمكن تقسيمها إلى 6 أنصاف شرائح باستخدام إبرة. قم بحضن شرائح الدماغ في سائل A CSF مؤكسج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل بينما يتم حضن شرائح الدماغ.

في سائل CSF-A المؤكسج، قم بتحضير محلول تحميل FFN 511 بتركيز 10 µM عن طريق إضافة محلول FFN 511 المخزن بتركيز 10 mM إلى سائل CSF-A. بعد ذلك، قم بتحضير محلول من A-D-V-A-S-E-P seven بتركيز 100 µM في سائل CSF-A، وقم بأكسجة كلا المحلولين لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل تحميلهما في الشرائح بشكل فردي. قم بحضن كل شريحة دماغية مع محلول تحميل FFN 511 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة الـ di المرتبط بالأنسجة خارج الخلوية عن طريق تحضين الشريحة المُحمّلة في 100 micromolar advers، 7 A CSF مُؤكسج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن أصبحت الشرائح جاهزة للتصوير. سيتم تصوير صبغ FFN 511 في الشرائح باستخدام مجهر مسح ليزري متعدد الفوتونات من نوع prairie Ultima. ضع الشريحة المُحمّلة بـ FFN 511 في غرفة التسجيل وقم بإجراء تروية فائقة بـ A CSF مُؤكسج بمعدل تدفق يتراوح من 1 إلى 2 milliliters per minute. ثم ضع قيثارة بلاتينية ذات أوتار نايلون فوق الشريحة لتقليل الحركة إلى أدنى حد.

أثناء التجربة، وللحد من الحركة بشكل أكبر، اترك الشرائح لتستقر لمدة 10 دقائق على الأقل في الحجرة قبل التصوير. قم بمعاينة وتحديد موقع dorsal stri AUM باستخدام اللمعان في المجال المضيء (brightfield luminescence) تحت عدسة غمر مائية بقوة 10 x، ثم ضع أقطاب التنجستن الملتوية ثنائية القطب في هذه المنطقة لإجراء تجربة التحفيز. تقع منطقة التصوير الخاملة ضمن نطاق 300 micrometers.

ضع هذه المنطقة في مركز صورة المجال البصري FFN 511 المحددة بـ Sal terminals بين طرفي القطب التحفيزي ثنائي القطب تحت عدسة غمر مائي فوق بنفسجية 63 x. يتم استثارة FFN 511 عند 760 nanometers باستخدام ليزر mi tai من spectral physics. يظهر الفلورة المثلى لـ SAL terminals من خلال مرشح تمرير نطاقي؛ التقط الصور بتنسيق 12 bit مع مناطق اهتمام تبلغ 75 by 75 micrometer وبدقة 512 by 512 pixel. تظهر هنا صورة نموذجية لنهايات الدوبامين في Sal مصنفة بـ FFN 511.

يمكن إزالة وسم FFN 511 إما عن طريق تركيزات عالية من كبريتات الأمفيتامين وكلوريد البوتاسيوم أو عن طريق التحفيز الكهربائي في تجربة إزالة وسم كلوريد البوتاسيوم؛ فعند تطبيق محلول A CSF بتركيز عالٍ من البوتاسيوم على شريحة الدماغ، يزول وسم FFN 511 في غضون أربع دقائق. قم بتسجيل صور XYZT لتتبع إزالة وسم FFN 511 بمرور الوقت في حالة إزالة وسم FFN 511 عن طريق التحفيز الكهربائي. احصل على سلسلة صور زمنية ضابطة لـ Zack قبل التحفيز لمدة خمس دقائق على الأقل لضمان الحد الأدنى من حركة الشريحة وعدم حدوث تبييض ضوئي بواسطة الليزر بعد الحصول على الصور الضابطة.

استمر في التصوير XYZT مع بدء التحفيز بترددات 1 أو 4 أو 20 هرتز، حيث يتم تطبيق المحفزات على الجسم المخطط محلياً بواسطة عازل تحفيز isof lex يتم تفعيله بواسطة مولد نبضات master eight باستخدام أقطاب ثنائية القطب. يوضح هذا الفيديو تشتت FFN 511 أثناء عملية الإخراج الخلوي في شريحة دماغ SAL. عند اكتمال تحميل FFN 511 في SAL، يُلاحظ وجود وسم وفير في الجسم المخطط، ووسم متفرّق في القشرة المخية، وعدم وجود وسم في الجسم الثفني.

يمكن إزالة الوسم الانتقائي لنهايات الدوبامين باستخدام كلوريد البوتاسيوم بتركيز عالٍ، كما هو موضح في هذه الصور التمثيلية قبل إضافة كلوريد البوتاسيوم وبعد دقيقتين من تطبيق 70 millimolar من كلوريد البوتاسيوم. كما يمكن تحقيق إزالة وسم FFN 511 في السائل الدماغي النخاعي بواسطة الأمفيتامين. وتظهر هذه الصورة وسم FFN 511 في الجسم المخطط قبل استخدام الأمفيتامين.

بينما تُظهر هذه الصورة الجسم المخطط بعد 20 دقيقة من عملية إزالة الارتباط باستخدام 20 micromolar من الأمفيتامين، فإن إزالة ارتباط وسم FFN 511 عن طريق التحفيز الكهربائي المحلي موضح في هذه الصور التي تعرض وسم FFN 511 في الجسم المخطط قبل التحفيز، وعند 217 ثانية و514 ثانية بعد بدء التحفيز بتردد 4 hertz. ويُظهر هذا الرسم البياني لشدة الفلورة المعيارية بمرور الوقت أن إزالة ارتباط FFN 511 تعتمد على الكالسيوم والتردد، حيث تم تمثيل مجموعات الضبط التي لم تتلقَ أي تحفيز بمثلثات غير ممتلئة. وكانت إزالة الارتباط باستخدام كلوريد الكادميوم، الممثلة بدوائر غير ممتلئة، مطابقة لمجموعات الضبط غير المحفزة.

تمت ملاءمة منحنيات التضاؤل لكل تردد تحفيز، والممثلة بالدوائر الملونة، باستخدام دالة اضمحلال أسي واحدة، وحُسبت قيم عمر النصف كـ tau مقسومة على 0.693. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تحميل ناقل عصبي فلوري حساس للقوة FFN five 11 في النهايات الدوبامينية في شريحة حادة، وكيفية تحريره بواسطة البوتاسيوم العالي واستحثاث التحفيز. هذه هي الطريقة الأولى التي تم تطويرها لفحص تحرر النواقل العصبية بصرياً على مستوى النهايات المشبكية الفردية.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على سلامة الشرائح جيداً والانتباه إلى وقت التحميل، وخلفية التبييض، والشوائب الناتجة عن الحركة؛ حيث تظهر الشرائح التي تتمتع بـ FFN five 11 تحميل جيد وتصوير ممتاز حتى أربع ساعات بعد تحضير الشرائح. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.