متصور النسخة الدوبامين في محطات قبل المشبكي فردية مع FFNs

الناقل العصبي الكاذب الفلوري. يعد FFN 511 من الأمينات أحادية الطرف الفلورية التي يمكن أن تعمل كركيزة لناقل الأمينات أحادية الطرف الفيزيائي المشبكي عند تطبيقه على شرائح الدماغ. يتم امتصاص FN 511 بواسطة الحويصلات المشبكية الدوبامينية عبر ناقل الأمينات أحادية الطرف، ويمكن استخدامه لتصور إطلاق الناقل مباشرة من النهايات قبل المشبكية للعصبونات أحادية الطرف، مثل تلك الموجودة في الطبقة S؛ ويظهر إطلاق الناقل من النهايات في الشريحة على شكل انخفاض في الإشارات الفلورية النقطية.

في هذا الفيديو، يتم تحضير شرائح إكليلية من المخ بسمك 250 ميكرومتر باستخدام جهاز vibrato، حيث يتم صبغها بـ FFN 511 وتصويرها باستخدام مجهر ليزر متعدد الفوتونات. يتم عرض تجارب الكشف التي تكشف عن عدم تجانس يعتمد على التردد في إطلاق iCal. مرحباً، أنا HU من مختبر David s في قسم أمراض الأعصاب بجامعة كولومبيا.

مرحباً، أنا مينيرفا أيضاً من مختبر سولجر. سنعرض لكم اليوم إجراءً لوسم نهايات الدوبامين في شرائح الدماغ باستخدام نواقل عصبية كاذبة فلورية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة إطلاق الدوبامين.

دعونا نبدأ. قبل تحضير شرائح السالين الحادة، يجب أكسجة السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي A CSF وتبريده بالثلج لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل استخراج الدماغ، مع الحفاظ على A CSF بارداً ومؤكسجاً. أثناء التشريح، يتم استخراج الدماغ كاملاً من الفأر وتثبيته على صينية الاهتزاز (vibram tray)، ثم وضعها على جهاز الاهتزاز (vibram) باستخدام غراء "crazy glue". يجب إتمام عملية استخراج الدماغ وتثبيته في غضون دقيقتين.

املأ الصينية بشرائح إكليلية مستقيمة من الدماغ أو مقاطع دماغية بسماكة 250 micrometer بين +1.54 و +0.62، مغمورة في سائل A CSF مبرد ومؤكسج. سيتم الحصول على ثلاث شرائح كاملة، والتي يمكن تقسيمها إلى ست أنصاف شرائح باستخدام إبرة. قم بحضن شرائح الدماغ في سائل A CSF مؤكسج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل أثناء عملية الحضن.

في سائل دماغي شوكي (A CSF) مُؤكسج، قم بتحضير محلول تحميل FFN 511 بتركيز 10 micromolar عن طريق إضافة محلول FFN 511 المركز بتركيز 10 millimolar إلى A CSF. بعد ذلك، قم بتحضير محلول A-D-V-A-S-E-P seven بتركيز مائة micromolar في A CSF. قم بأكسجة كلا المحلولين لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل تحميلهما في الشرائح بشكل فردي. قم بتحضين كل شريحة دماغية مع محلول تحميل FFN 511 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة di المرتبط بالأنسجة خارج الخلوية عن طريق تحضين الشريحة المحملة في 100 micromolar advers من سائل CSF الموكسج بتركيز سبعة A لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أصبحت الشرائح الآن جاهزة للتصوير. سيتم تصوير صبغ FFN 511 في الشرائح باستخدام مجهر prairie Ultima للمسح الليزري متعدد الفوتونات. ضع الشريحة المحملة بـ FFN 511 في غرفة التسجيل وقم بترويتها بسائل A CSF الموكسج بمعدل تدفق يتراوح من 1 إلى 2 milliliters per minute. ثم ضع قيثارة بلاتينية ذات أوتار نايلون فوق الشريحة لتقليل الحركة إلى أدنى حد.

أثناء التجربة، ولتقليل الحركة بشكل أكبر، اترك الشرائح لتستقر لمدة 10 دقائق على الأقل في الغرفة قبل التصوير. قم بمعاينة وتحديد موقع AUM المخطط الظهري باستخدام التألق في المجال المضيء تحت عدسة غمر مائي 10x، ثم ضع وثبّت أقطاب التنجستن الملتوية ثنائية القطب في هذه المنطقة لإجراء تجربة التحفيز. تقع منطقة التصوير الخاملة ضمن 300 micrometers.

ضع هذه المنطقة في مركز صورة المجال البصري FFN 511 المحددة بـ Sal terminals بين طرفي القطب الكهربائي ثنائي القطب المحفز، وذلك تحت عدسة شيئية فائقة البنفسجية غامرة في الماء بقوة 63x. يتم إثارة FFN 511 عند 760 nanometers باستخدام ليزر mi tai من spectral physics. يُمكن رؤية الفلورة المثلى لـ SAL terminals من خلال مرشح تمرير نطاقي؛ التقط الصور بتنسيق 12 bit مع تحديد مناطق اهتمام تبلغ 75 by 75 micrometer وبدقة 512 by 512 pixel. تظهر هنا صورة نموذجية لنهايات الدوبامين Sal المحددة بـ FFN 511.

يمكن إزالة وسم FFN 511 إما بواسطة تركيزات عالية من كبريتات أمفيتامين كلوريد البوتاسيوم أو عن طريق التحفيز الكهربائي في تجربة إزالة وسم كلوريد البوتاسيوم؛ فعند تطبيق محلول CSF عالي البوتاسيوم على شريحة الدماغ، يزول وسم FFN 511 في غضون أربع دقائق. قم بتسجيل صور XYZT لتتبع إزالة وسم FFN 511 بمرور الوقت في حالة إزالة وسم FFN 511 عن طريق التحفيز الكهربائي. احصل على سلسلة صور زمنية ضابطة للـ Zack قبل التحفيز لمدة خمس دقائق على الأقل لضمان الحد الأدنى من حركة الشريحة وعدم حدوث تبييض ضوئي بواسطة الليزر بعد الحصول على الصور الضابطة.

استمر في تصوير XYZT مع بدء التحفيز بترددات تبلغ 1 أو 4 أو 20 هرتز، حيث يتم تطبيق المحفزات على المخطط موضعياً بواسطة عازل محفز isof lex يتم تفعيله بواسطة مولد نبضات master eight باستخدام أقطاب ثنائية القطب. يظهر هذا الفيديو تدهور FFN 511 أثناء الإخراج الخلوي في شريحة دماغ SAL. عند اكتمال تحميل FFN 511 في SAL، يُلاحظ وجود وسم وفير في المخطط، ووسم متفرق في القشرة، وعدم وجود وسم في الجسم الثفني.

يمكن إزالة الوسم الانتقائي لنهايات الدوبامين باستخدام كلوريد البوتاسيوم بتركيز عالٍ، كما يتضح في هذه الصور التمثيلية قبل إضافة كلوريد البوتاسيوم وبعد دقيقتين من تطبيق كلوريد البوتاسيوم بتركيز 70 millimolar. كما يمكن إزالة وسم FFN 511 في السائل الدماغي النخاعي (CSF) بواسطة الأمفيتامين. وتظهر هذه الصورة وسم FFN 511 في الجسم المخطط قبل استخدام الأمفيتامين.

بينما تُظهر هذه الصورة الجسم المخطط بعد 20 دقيقة من الإزاحة باستخدام 20 µM من الأمفيتامين، توضح هذه الصور إزاحة وسم FFN 511 عن طريق التحفيز الكهربائي الموضعي، حيث تُظهر وسم FFN 511 في الجسم المخطط قبل التحفيز، وعند 217 ثانية و 514 ثانية بعد بدء التحفيز بتردد 4 Hz. ويُظهر هذا الرسم البياني لشدة الفلورة المعيرة بمرور الوقت أن إزاحة FFN 511 تعتمد على الكالسيوم والتردد؛ حيث تمثل المثلثات المفرغة مجموعات الضبط التي لم تتلقَّ أي تحفيز. وكانت الإزاحة باستخدام كلوريد الكادميوم، والتي تمثلها الدوائر المفرغة، مطابقة لمجموعات الضبط غير المحفزة.

تم تمثيل منحنيات الاضمحلال لكل تردد تحفيز بواسطة الدوائر الملونة، وجرى مطابقتها باستخدام دالة اضمحلال أسي واحدة، وحُسبت قيم عمر النصف كقيمة tau مقسومة على 0.693. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية تحميل الناقل العصبي الفلوري FFN five 11 في نهايات الدوبامين في شريحة حادة، وكيفية تحريره باستخدام البوتاسيوم العالي واستحثاث التحفيز. هذه هي الطريقة الأولى التي تم تطويرها لفحص تحرير الناقل العصبي بصرياً على مستوى النهايات التشابكية الفردية.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على سلامة الشرائح جيداً، ومراعاة وقت التحميل، وتبييض الخلفية، والشوائب الناتجة عن الحركة؛ حيث تظهر الشرائح تحميلًا وتصويرًا جيدًا لـ FFN five 11 حتى أربع ساعات بعد تحضير الشريحة. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.