PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مواقع الارتباط العريضة للنسخ لبروتينات ربط الحمض النووي الريبي أو RVPs. يتم تحقيق ذلك أولا باستخدام نظائر النيوكليوزيد التفاعلية ضوئيا لوضع العلامات في الجسم الحي للنصوص الناشئة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ربط بروتينات ربط الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في ترسيب بروتين ربط الحمض النووي الريبي الذي تم فحصه واستعادة الارتباط المتقاطع بالحمض النووي الريبي. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تحويل الحمض النووي الريبي إلى مكتبة CD NA وتسلسل عميق. في النهاية يمكن الحصول على النتائج التي تظهر مواقع الربط العريضة للنسخ لمركبات RVPs وتمكن من تعريف عنصر التعرف على الحمض النووي الريبي وتفضيلات الربط الخاصة به.

مرحبا ، اسمي ماركوس هوفنر من مختبر Tom SEL في جامعة روكفلر في نيويورك. سنعرض اليوم طريقة تسمى الشفة المتساوية أو التناظرية الضلعية المضروبة المعززة والترسيب المناعي. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتحديد النسخ من خلال مواقع ربط المقياس لبروتينات ربط الحمض النووي الريبي وزخارفها وتفضيلاتها الملزمة.

حسنا ، فلنبدأ. في الجسم الحي يبدأ الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية في غطاء التدفق الرقائقي. في هذا البروتوكول ، سنستخدم IGF الموسومة ، خليتين من BP ، خلية واحدة كنموذج نموذجي باستخدام تقنية معقمة.

قم بتوسيع HEK 2 93 خلية معبرة بثبات عن العلم HA الموسومة IGF اثنين BP واحد تحت السيطرة على مثبط Tet في HEK 2 93 استخدام وسط زراعة الخلايا بين 100 و 400 مرة 10 إلى الخلايا السادسة وزراعتها إلى ما يقرب من 80٪ من الطلاقة المشتركة. في 14 ساعة قبل الربط المتبادل ، كان لدى الخلايا نظير الريبوسيد التفاعلي ضوئي لثيو يوريدين أو ل SU مباشرة إلى وسط زراعة الخلية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ستة غينيا أو ستة SG بعد إضافة التعبير عن تحفيز الريبوسيد التفاعلي الضوئي للعلم HA الموسومة IGF اثنين BP واحد عن طريق إضافة خلايا الدوكسيسيكلين ثم يتم احتضانها بين عشية وضحاها في حاضنة الخلية.

بعد ذلك ، صب وسط النمو. ثم اغسل الخلايا مرة واحدة ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بفوسفات مثلج لكل طبق. ثم قم بإزالة PBS تماما عن طريق الصب.

ضع الألواح المكشوفة على صينية بها ثلج وقم بإشعاعها بضوء الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر في رابط مترابط 2 ، 400 UV أو ما يعادله بعد الأشعة فوق البنفسجية ، اكشط الخلايا بشرطي مطاطي في مليلتر واحد من PBS لكل لوحة. انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وأجهزة الطرد المركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تجاهل الاسم الفائق واحتفظ بحبيبات الخلية.

في هذه المرحلة ، يمكن تجميد كريات الخلية في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة 80 تحت الصفر لمدة 12 شهرا على الأقل. لمتابعة الإجراء ، قم بتعليق الحبيبات في ثلاثة أحجام من مخزن مؤقت تحلل X NP 40 ، واحتضانه على الجليد لمدة 10 دقائق. قم بتنظيف محللة الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 13،000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المحللة بشكل أكبر عن طريق ترشيحها من خلال مرشح حقنة غشائي خمسة ميكرون. أخيرا ، أضف الحمض النووي الريبي T واحد إلى التركيز النهائي لوحدة واحدة لكل ميكرولتر واحتضانه في حمام مائي عند 22 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتبريد التفاعل على الجليد لمدة خمس دقائق.

بعد الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية في الجسم الحي. تحضير الخرزات المغناطيسية للترسيب المناعي. انقل 10 ميكرولترات من جزيئات بروتين حبات دينامية G لكل مل واحد من محللة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

ثم ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخرز على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة إلى دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية وأضف ملليلترا واحدا من محلول فوسفات السترات إلى الأنبوب أثناء وجوده على الفاصل المغناطيسي. بعد ذلك ، قم بتغطية الأنبوب ودوامة العينة لإعادة تعليق الخرز.

جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع أي حبات متبقية في غطاء الأنبوب. كرر هذا الغسيل مع مليلتر إضافي واحد من عازلة فوسفات السترات. بعد إعادة الغسيل ، قم بتعليق الخرزات ومخزن فوسفات السترات بحجم ضعف الحجم الأصلي لتعليق البنجر.

ثم أضف 0.25 ملليغرام من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للعلم M لكل مليلتر واحد من تعليق الضرب. احتضان التعليق على عجلة دوارة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، اغسل الخرزات مرتين في مليلتر واحد من عازلة فوسفات السترات كما هو موضح سابقا ، يعمل هذا الغسيل على إزالة أي جسم مضاد غير مرتبط بعد غسل Resus ، وتعليق الخرز ومخزن فوسفات السترات كما كان قبل أربعة. لبدء الترسيب المناعي ، أضف الخرز المغناطيسي المترافق للجسم المضاد المحضر حديثا إلى الحمض النووي الريبي T تحلل الخلية المعالجة.

انقلي الخليط إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر وقومي بتدويرها لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اجمع الخرز المغناطيسي ، وتخلص من حبات إعادة تعليق المادة الطافية في مليلتر واحد من مخزن غسيل IP وانقلها إلى أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر. اغسل الخرزات كما هو موضح من قبل مرتين في مليلتر واحد من مخزن غسيل IP.

بعد الغسيل النهائي ، قم بتعليق الخرزات في حجم الخرزة الأصلي للمخزن المؤقت للغسيل IP. ثم أضف RNAT واحد إلى التركيز النهائي البالغ 100 وحدة لكل ميكرولتر. احتضن معلق الخرزة في حمام مائي 22 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك قم بتبريد التعليق على الجليد لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، اغسل الخرزات ثلاث مرات في مليلتر واحد من محلول غسيل عالي الملح. ثم أعد تعليق الخرزات في حجم حبة أصلي واحد من المخزن المؤقت لإزالة الفسفرة.

أضف الفوسفاتيز القلوي المعوي في ربلة الساق إلى التركيز النهائي البالغ 0.5 وحدة لكل ميكرولتر واحتضان المعلق لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. اغسل الخرزات مرتين في مليلتر واحد من محلول غسيل الفوسفاتيز ثم مرتين أخريين في بولي نوكليوتيدات كيناز أو PNK المخزن المؤقت بدون DTT. أخيرا ، قم بإعادة تعليق الخرزات في حجم حبة أصلي واحد من المخزن المؤقت PNK.

لبدء وضع العلامات الراديوية على الحمض النووي الريبي المتشابك. أضف جاما 32 PATP و T four PNK إلى حجم حبة أصلي واحد لتعليق الخرزة المعد حديثا. احتضان التعليق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، أضف TP غير مشع إلى التعليق واحتضنه لمدة خمس دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل الخرزات المغناطيسية خمس مرات باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت PNK بدون DTT. أخيرا ، قم بتعليق الخرزات في 70 ميكرولترا من صفحة SDS.

المخزن المؤقت للتحميل باحتضان تعليق الملصق اللاسلكي لمدة خمس دقائق في كتلة حرارية عند 95 درجة مئوية لتغيير طبيعة وإطلاق بروتينات ربط الحمض النووي الريبي المترسبة المناعية مع الحمض النووي الريبي المتشابك. ثم قم بإزالة الخرزات المغناطيسية الموجودة على الفاصل وانقل السوبر ناتين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 مليلتر قم بتحميل 40 ميكرولترا من السواد لكل بئر من نوفوكس مكرر تريس من أربعة إلى 12٪ جل بولي أكريلاميد مسبقة الصب وقم بتشغيل الجل لمدة 55 دقيقة عند 200 فولت. بمجرد تشغيل الجل ، قم بتفكيك حجرة الجل وتفكيك الألواح ، مع ترك الجل مثبتا على لوحة واحدة لتسهيل محاذاة الجل مع مطبوعات ورق التصوير الفوسفو.

زرع ثلاث قطع هلام مشعة صغيرة بشكل غير متماثل في زوايا الجل. لف الجل بغشاء بلاستيكي مثل غلاف ساران لتجنب التلوث. قم بتعريض الجل لشاشة تصوير فوسفو فارغة لمدة ساعة واحدة وعلى جهاز تصوير الفوسفو.

بعد ذلك ، قم بمحاذاة الجل أعلى مطبوعات تصوير الفوسفو باستخدام قطع الجل المزروعة للتوجيه. اقطع العصابات التي تتوافق مع الحجم المتوقع لبروتين ربط الحمض النووي الريبي أو RBP. انقل العصابات إلى أنبوب DTU DIDI لغسيل الكلى وأضف 800 ميكرولتر من XSDS واحد يعمل بالكهرباء العازلة.

مركب R-N-A-R-B-P المتشابك عند 100 فولت لمدة ساعتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد الشطف الكهربائي. أضف البروتيناز K المخزن المؤقت والبروتيناز K واحتضان المحلول لمدة 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية.

استعادة الحمض النووي الريبي عن طريق استخراج كحول الفينول الحمضي كلوروفورم إيزوأميل, متبوعا باستخراج الكلوروفورم. ثم أضف ميكرولتر واحد من الجليكوجين وقم بترسيب الحمض النووي الريبي بإضافة ثلاثة أحجام من الإيثانول. أخيرا قم بإذابة الحبيبات الناتجة في 10.5 ميكرولتر من الماء.

بمجرد استرداد الحمض النووي الريبي ، قم بحمله من خلال بروتوكول إعداد مكتبة CDNA القياسي وقم بإجراء تحليل معلوماتي حيوي دقيق لقراءات التسلسل. تظهر النتائج التمثيلية لمقطع متكافئ تم إجراؤه باستخدام HK 2 93 خلية تعبر عن العلم H ha الموسومة IGF اثنين BP واحد مع نظائر النيوكليوزيد التفاعلية ضوئية أربعة SU وستة SG كفاءة الربط المتقاطع للريبوسيد التفاعلي الضوئي البديل ستة SG أقل بشكل عام من أربعة su. قد تؤدي كفاءة الربط المتقاطع المنخفضة إلى خلفية أعلى للتسلسلات المشتقة من شظايا الحمض النووي الريبي الخلوي الوفير ، وبالتالي يجب استخدام المزيد من الخلايا في البداية للتجربة.

تتم مقارنة نظائر اليوريدين ذات التفاعلية الضوئية المختلفة بالأشعة فوق البنفسجية التقليدية 2 54 نانومتر أو الربط المتقاطع كما هو موضح هنا. يتميز الربط المتقاطع لبروتين الحمض النووي الريبي للأشعة فوق البنفسجية 2 54 نانومتر بكفاءة محدودة في الربط المتبادل. تشير شدة النطاق المشع بالحجم المناسب إلى ما إذا كانت تجربة المقطع الاسمي قد نجحت وما إذا كان قد تم عزل الحمض النووي الريبي الكافي لتنفيذ بروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير.

تدل ترددات الطفرات المميزة في القراءات المتسلسلة بعد تحليل المعلوماتية الحيوية على التسلسلات المتشابكة بنجاح. هذه الطفرات هي انتقالات T اثنين C عند استخدام أربعة انتقالات SU و G اثنين A عند استخدام النجاح. السمة المميزة لشفة الحديقة هي إمكانية اشتقاق موقع الرابط المتقاطع عن طريق تسجيل طفرة مميزة موجودة في مكتبات CD NA المعدة من الحمض النووي الريبي المستردة.

هذا يسمح بالفصل السهل للإشارة المشتقة من الحمض النووي الريبي المرتبط على وجه التحديد ، من ضوضاء التسلسلات المشتقة من شظايا معزولة مشتركة من الحمض النووي الريبي الخلوي الوفيرة. لذلك أوضحنا لك اليوم كيفية عزل أجزاء الحمض النووي الريبي ، والتي يتم التعرف عليها على وجه التحديد بواسطة بروتينات ربط الحمض النووي الريبي. عند القيام بهذا الإجراء.

من المهم أن تعمل الحمض النووي الريبي مجانا. لذلك كان هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في التجارب.