مناعي الكشف عن النظائر ثيميدين الثاني (CldU وإيدو) في الأنسجة الابتدائية

أهلاً بكم في بروتوكول صبغ Calor D-U-I-D-U. سيبدأ الفيديو اليوم بالخطوة الثالثة: إعادة الترطيب، والنفاذية، واستعادة المستضد. ابدأ بوضع الشرائح في الحامل.

بمجرد تحميل الشرائح، ضعها في حمام زايلين لمدة خمس دقائق. يتبع ذلك حمام زايلين ثانٍ لمدة خمس دقائق أيضاً.

استمر في إعادة ترطيب الشرائح بنقلها إلى محلول الإيثانول، بدءاً من محلول 100% وانتهاءً بمحلول 50%. ثم أكمل عملية إعادة ترطيب الشرائح بوضعها لمدة خمس دقائق في 1X PBS لنفاذية الأغشية الخلوية. اغمر الشرائح في محلول Triton X بتركيز 0.2% لمدة خمس دقائق. جهّز الشرائح لاستعادة المستضد النسيجي باستخدام الميكروويف عن طريق وضعها في وعاء زجاجي يحتوي على حجم كافٍ من محلول منظم سترات الصوديوم بتركيز 0.01 molar، بحيث يغطي المحلول الشرائح بارتفاع خمسة سنتيمترات فوق سطحها.

لتعويض الفقد الناتج عن التبخر، قم بتسخين الشرائح في الميكروويف حتى يغلي المحلول. يستغرق ذلك حوالي 3 إلى 10 دقائق عند استخدام الطاقة الكاملة. تأكد من أن المحلول على الشرائح يغلي.

قم بخفض طاقة الميكروويف لتصبح بين 10 و80% واستمر في غلي الشرائح ببطء لمدة 20 دقيقة إضافية. بعد الغليان، ضع الكأس الذي يحتوي على الشرائح على سطح طاولة المختبر للسماح لها بأن تبرد ببطء لمدة ساعتين تقريبًا حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن الشرائح قد وصلت إلى درجة حرارة الغرفة.

اغمر الشرائح في حمض الهيدروكلوريك الطبيعي بتركيز 1.5 لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أخرج الشرائح من حمض الهيدروكلوريك وضعها لمدة خمس دقائق في غسلة واحدة من XPBS. يتبع ذلك غسلة ثانية من XPBS.

أخرج الشرائح من محلول الوصول 1X PBS باستخدام قلم شمع سدّ سائل. ارسم دائرة حول كل مقطع نسيجي وأعد الشريحة إلى محلول PBS. قم بإعداد غرفة تحضين رطبة بوضع منشفة ورقية مبللة في قاع حاوية محكمة الإغلاق.

قم بتحضير محلول حجب يتكون من مصل حجب بتركيز 10% مخفف في 1X PBS. من المهم تغطية كل مقطع نسيجي بالكامل بالمحلول بالنسبة للمقاطع النسيجية التي تبلغ أبعادها النموذجية حوالي 1 × 1.5 سنتيمتر. ويعد حجم 50 µL من محلول الحجب كافياً.

قم بتحضير الجسم المضاد الأولي لـ IDU عن طريق تخفيف المصل المضاد لـ BRDU من الفأر في مصل حماري بتركيز 5%. أضف بتركيز يتراوح من 1 إلى 250. انقل المحلول الأولي بواسطة الماصة إلى كل مقطع من الشرائح.

ضع الشرائح في ثلاجة عند درجة حرارة 4 °C. وللحضن طوال الليل، قم بتحضير محلول غسيل عالي الصرامة، حيث يعد TBST خياراً فعالاً.

توجيه الشرائح بحيث تكون متقابلة ظهرًا لظهر. ضع الشرائح في حوالي 35 إلى 40 milliliters من محلول TBST. ضع الأنابيب في حاضنة هزازة للمزارع البكتيرية عند 37 °C.

اتركها تُرَج لمدة 20 دقيقة بسرعة 225 RPM. الآن، قم بتحميل الشرائح في الحامل. ضع الشرائح في محلول XPBS واحد لغسلها بمحلول PBS لمدة خمس دقائق.

سيتم ذلك من خلال عملية غسيل ثانية باستخدام XPBS لمدة خمس دقائق. قم بتحضير محلول الأجسام المضادة الأولية لـ CLDU عن طريق تخفيف rat anti BRDU في مصل حماري بتركيز 5%. أضف تركيزاً يتراوح من 1 إلى 250، ثم ضع الشرائح على مناديل ورقية وقم بالتحديد باستخدام قلم شمعي.

استخدم ماصة لتغطية كل مقطع نسيجي بمحلول CLDU الأولي. استخدم حوالي 50 µL من المحلول للتأكد من تغطية كل مقطع نسيجي بالكامل. ضع الشرائح في مبرد بدرجة حرارة 4 °C للحضن طوال الليل.

ضع الشرائح في حامل ثم ضعها في غسول 1x PBS لمدة خمس دقائق. ضع الشرائح في غسول 1x PBS ثانٍ لمدة خمس دقائق. قم بتحضير الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة CY2 donkey anti RAD و PS5 donkey anti muse في مصل حمير بتركيز 5%. سيتم استخدام DPI أيضاً للتلوين النووي، قم بتغطية مقاطع الأنسجة بالكامل بالأجسام المضادة الثانوية.

يجب أن تكون 50 µL من المحاليل كافية لتغطية النسيج بالكامل. ضع غرفة إعادة الترطيب في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة من التحضين. ضع الشرائح في حامل ثم ضعها في غسلة واحدة بـ XPBS لمدة خمس دقائق.

ضع الشرائح في غسلة ثانية بمحلول XPBS لمدة خمس دقائق. تخلص من محلول PBS الزائد باستخدام مناديل ورقية. بعد ذلك، استخدم وسط التثبيت Prolong Gold anti-fade وضع قطرة صغيرة منه على كل مقطع نسيجي.

خذ شريحة غطاء وضعها برفق فوق مقاطع الشريحة الخاصة بك. استخدم مناديل ورقية للضغط من أجل إخراج أي فقاعات هواء زائدة قد تكون محتبسة بين مقاطع الشريحة وشريحة الغطاء. أخيراً، استخدم رأس ماصة لإخراج أي فقاعات هواء زائدة قد تتبقى. قم بتصوير النسيج المستهدف باستخدام مجهر فلوري مجهز بمصدر ضوء عالي الطاقة وقنوات فلورية متعددة لقياس النتائج كمياً.

ابدأ بعدّ الخلايا الموجبة لـ Dabi. ثم عدّ الخلايا الموجبة لـ CLDU باستخدام صورة القناتين SI. وعدّ الخلايا الموجبة لـ IDU باستخدام صورة القنوات الخمس SCI.

أخيراً، قم بعدّ الخلايا الموسومة إيجابياً بشكل مزدوج من خلال التنقل بين ملف صورة القناة SCI two وملف صورة القناة SCI five.