تصنيع الأنسجة الصغيرة باستخدام وحدات من الخلايا التي تحتوي على الكولاجين جل

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج أنسجة دقيقة نمطية يمكن استخدامها في تجارب هندسة الأنسجة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق سحب محلول الكولاجين إلى أنبوب بولي إيثيلين باستخدام سرنجة، ثم تحويل الكولاجين إلى هلام. وتتمثل الخطوة الثانية في قطع أنبوب البولي إيثيلين إلى قطع بطول مليمترين لتشكيل وحدات الأنسجة الدقيقة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في فصل الوحدات عن الأنابيب، وأخيراً، يتم طلاء الوحدات بالخلايا البطانية. وفي النهاية، يمكن استخدام الأنسجة الدقيقة الناتجة في المقايسات الخلوية في المختبر لدراسة التفاعل بين الخلايا عبر غرفة مائعية دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن زرع الأنسجة الدقيقة لإنتاج أنسجة لدراسة التفاعل وإعادة تشكيل الأنسجة الدقيقة في الجسم الحي.

مرحباً، اسمي بريندان لونج من مختبر سيبان هنا في جامعة تورنتو. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية في إنشاء بدائل أنسجة ثلاثية الأبعاد كبيرة في نقص التوعية الدموية السريعة بعد الزرع. سنوضح لكم في هذا الفيديو كيفية إنشاء أنسجة نمطية مغلفة بخلايا بطانية للمساعدة في التغلب على هذا القصور.

سيقوم بتوضيح الإجراء تشامبرلين، وهو زميل ما بعد الدكتوراه من مختبر Septin. ستعتمد كمية الكولاجين المراد تحييدها على طول أنبوب البولي إيثيلين. وفي هذا العرض التوضيحي، سنستخدم أنبوب بولي إيثيلين بطول مترين، بقطر داخلي يبلغ 0.76 millimeter وقطر خارجي يبلغ 1.22 millimeter.

لتجهيز الأنابيب، قم بإدخال إبرة واحدة بمقاس 20 G في أحد طرفي الأنبوب، ثم ضع الأنبوب في كيس تعقيم ذاتي المعالجة للتعقيم بالغاز. وبما أن 1 mL من الكولاجين يملأ حوالي مترين من أنابيب البولي إيثيلين، فسنقوم بمعادلة 1 mL من الكولاجين. ضع الكولاجين في أنبوب مخروطي سعة 15 mL واحفظ الأنبوب على الثلج.

أضف 128 µL من 10 x alpha, MEM لكل ملليلتر من الكولاجين إلى الأنبوب، ثم اخلط المحلول عن طريق السحب والإخراج المتكرر باستخدام الماصة. يجب أن يتحول لون المحلول إلى الأصفر مع اختلاط alpha MEM بالكولاجين المحمض، مع الحرص على تقليل تكون الفقاعات. بعد ذلك، قم بمعادلة الكولاجين بإضافة بيكربونات الصوديوم بتركيز 0.8 molar. وللحصول على تقدير عام لقيمة pH، أضف بيكربونات الصوديوم حتى يتحول لون محلول الكولاجين الأصفر إلى اللون الوردي الفاتح.

عادةً ما يتطلب الأمر من 30 إلى 60 microliters لكل milliliter من الكولاجين للوصول إلى pH 7.4. ولمنع الكولاجين المعاد تعادله من التجلط، يُحفظ على الثلج حتى يحين وقت استخدامه. لبدء إجراء تجليط الكولاجين، يتم نقل الكيس الذي يحتوي على أنابيب البولي إيثيلين المعقمة إلى كابينة السلامة البيولوجية، ثم يُقطع الطرف المختوم من الكيس مع إبقاء الأنابيب بداخله.

استخدم ملقطاً معقماً لتوصيل محقنة سعة 3 mL بإبرة قياس 20 gauge التي تم إدخالها مسبقاً في أحد طرفي الأنبوب. أدخل الطرف الآخر من الأنبوب في الكولاجين المتعادل حتى تصل النهاية إلى قاع الأنبوب المخروطي، والذي يجب الحفاظ عليه فوق الثلج. يجب تنفيذ هذه الخطوة التالية ببطء، وإلا ستتسبب في إدخال فقاعات هوائية إلى الكولاجين.

اسحب مكبس المحقنة ببطء لسحب الكولاجين إلى أنبوب البولي إيثيلين. وبمجرد سحب الكولاجين عبر الأنبوب، اسحب الإبرة ذات القياس 20 gauge وأعد طرفي الأنبوب إلى الكيس. بعد إغلاق الكيس بإحكام باستخدام الشريط اللاصق، يتم التحضين عند 37 °C لمدة 60 دقيقة.

سيتم استخدام جهاز قطع مسبق التجميع لقطع الأنابيب. لبدء هذا الإجراء، ضع الأنابيب في صينية معقمة أمام جهاز القطع، ثم قم بتحميل الأنابيب في جهاز القطع عند المخرج، وجهز أنبوباً مخروطياً سعة 50 milliliter يحتوي على 25 milliliters من وسط زراعة الخلايا البطانية. ولجمع الوحدات المقطوعة، اضبط جهاز القطع لقطع الأنابيب بأطوال تبلغ 2 millimeter ثم قم بقطع الأنابيب.

قم بتحضين الوحدات المقطوعة في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 60 دقيقة. ولإزالة وحدات الكولاجين من الأنابيب، استخدم جهاز الـ vortex للأنبوب المخروطي سعة 50 liter الذي يحتوي على الوحدات بسرعة متوسطة لمدة 10 ثوانٍ، ثم اترك الوحدات تترسب في قاع الأنبوب، وهي عملية تستغرق حوالي خمس دقائق.

ستتشكل كرة رخوة من الوحدات في قاع الأنبوب، بينما ستشكل الأنابيب طبقة فوق الوسط. بعد استقرار الوحدات، استخدم ماصة سيرولوجية ذات فوهة واسعة سعة 10 milliliter لنقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. قم برج الأنبوب المخروطي سعة 15 milliliter باستخدام جهاز الـ Vortex، ثم اترك الوحدات تستقر لمرتين إضافيتين.

تُنقل أيضاً الوحدات المترسبة من الدوامة الثانية والثالثة إلى أنبوب سعة 15 مللتر. وبعد إزالة جميع الوحدات من الأنابيب وتجميعها، يتم إكمال حجم الوسط في الأنبوب ليصل إلى خمسة مللتر. أصبحت الوحدات الآن جاهزة للتغطية بالخلايا البطانية، وهو ما سيتم عرضه تالياً لتحضير الخلايا البطانية لتغطية الوحدات.

أولاً، قم بإزالة الوسط الغذائي من الخلايا واغسلها باستخدام PBS. وبعد إزالة PBS، أضف ثلاثة milliliters من trypsin EDTA واحضنها لمدة خمس دقائق عند 37 درجة Celsius. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في سبعة milliliters من الوسط الغذائي وانقلها إلى أنبوب سعة 15 milliliter.

قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كريات الدم (hemo cytometer)، حيث ستحتاج إلى 5×10⁶ من الخلايا البطانية لكل مليلتر من النماذج المكدسة في قاع الأنبوب المخروطي. قم بترسيب الخلايا عند 300 G لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليق راسب الخلايا في 5 mL من الوسط الزرعي للخلايا البطانية.

أضف الآن خمسة ملليلترات من الوسط الذي يحتوي على خلايا بطانية إلى الوحدات. يتم تحضين الوحدات مع الخلايا البطانية، سكونياً وديناميكياً؛ وبالنسبة للتحضين السكوني، يتم خلط الوحدات مع الخلايا البطانية عن طريق القلب، ثم توضع الأنبوبة في وضع عمودي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد مرور 15 دقيقة، اقلب الأنبوبة مرة أخرى وحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى.

لتحضين الوحدات مع الخلايا البطانية بشكل ديناميكي، قم بهز الأنبوب سعة 15 milliliter بلطف عند درجة حرارة 37 °C لمدة 60 دقيقة. وبمجرد اكتمال التحضين مع الخلايا البطانية، انقل الوحدات إلى طبق غير معالج لزراعة الأنسجة وحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 37 °C. وفي اليوم التالي، ضع الوحدات في طبق جديد غير معالج لزراعة الأنسجة مع وسط غذائي جديد لإزالة الخلايا البطانية غير الملتصقة. يتم تحضين الوحدات المغطاة بالخلايا البطانية عند درجة حرارة 37 °C حتى تغطي الخلايا 100% من سطح الوحدات.

عادةً ما تستغرق هذه العملية حوالي سبعة أيام. ستبدو الوحدات أسطوانية الشكل عند إخراجها من الأنبوب لأول مرة. وإذا كانت مغطاة بالخلايا البطانية، فقد تتقلص بنسبة تصل إلى 50% في الحجم وتتخذ شكلاً بيضاوياً، كما تصبح أكثر كثافة وعتمة عند فحصها باستخدام المجهر الضوئي.

في هذه الصور، يُشار إلى قطر وطول الوحدات بالرمزين d و l على التوالي. وتُظهر الصورة التالية خلايا Hep G two المدمجة والموزعة بشكل منتظم داخل الوحدات وقت التصنيع. وقد احتفظت الخلايا بحيوية عالية كما يتضح من اللون الأخضر للخلايا الحية.

تظهر الخلايا الميتة باللون الأحمر عندما تكون الخلايا البطانية متلاحمة. ويوجد على سطح الوحدات تكوين للروابط المحكمة، والتي يمكن رؤيتها عن طريق التألق المناعي. وقد أظهر تحليل انتقال كتلة صبغ VE cadherin أن الوحدات قادرة على دعم كثافات خلوية عالية دون تطوير لب نخرى ناتج عن عدم كفاية نقل الأكسجين، وهو أمر غالباً ما يمثل مشكلة في الأنسجة الأكبر حجماً.

في هذا المثال، يُظهر صبغ Tri chro لكتل من الوحدات الصغيرة النموذجية أن هذه الوحدات احتفظت بتوزيع منتظم ومرتفع للخلايا الحية بعد سبعة أيام من التصنيع. وفي المقابل، تشكل عدد كبير من الخلايا الميتة داخل نواة الوحدات الكبيرة، مما ترك فقط حافة رقيقة من الخلايا القابلة للحياة. كما تم إنتاج وحدات باستخدام خليط من الكولاجين وبوليمر دقيق أو وحدات تحتوي على حبيبات دقيقة مطلقة للدواء.

عندما يتم وضع خلايا h hm EC على وحدات كولاجين مدمجة، فإن الوحدات تحافظ على شكلها الأسطواني وتكون خصائص التصاق الخلايا محدودة مقارنة بالوحدات المكونة من الكولاجين فقط. تظهر هنا صورة مجهرية ضوئية لوحدة كولاجين تحتوي على كرات مجهرية قابلة للتحلل الحيوي قائمة على PLGA. وقد ثبت أن العديد من المقايسات المختبرية متوافقة مع هذه الوحدات.

على سبيل المثال، في مقايسة تكوين الأوعية الدموية، يمكن بسهولة الكشف عن التكوينات الشبيهة بالشعيرات الدموية وقياسها كمياً في وحدة مجهزة بخلايا بطانية بعد خمسة أيام من الحضن مع خلايا جذعية مشتقة من الأنسجة الدهنية. وفي مثال آخر، تُظهر صور المجهر البؤري لمقايسة الحيوية والموت في الوحدات خلايا حية مصبوغة باللون الأخضر وخلايا ميتة مصبوغة باللون الأحمر. وأخيراً، استُخدمت الوحدات أيضاً في غرف الموائع الدقيقة وزُرعت في الفئران والجرذان لدراسة التفاعل بين أنواع الخلايا المختلفة وكيفية إعادة تشكيل الأنسجة الدقيقة بواسطة استجابة المضيف.

بعد اتباع الإجراء، يمكن زراعة الوحدات في طبق بتري أو أوعية أخرى مثل المفاعل الحيوي أو جهاز مائع مجهري. كما يمكن تكييف هذه الطريقة لإنشاء أنسجة مختلفة باستخدام تركيبات متنوعة من أنواع الخلايا أو باستخدام أنابيب ذات أقطار مختلفة. شكراً للمشاهدة.