تصنيع الأنسجة الصغيرة باستخدام وحدات من الخلايا التي تحتوي على الكولاجين جل

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج أنسجة دقيقة معيارية يمكن استخدامها في تجارب هندسة الأنسجة. يتم تحقيق ذلك عن طريق سحب محلول الكولاجين أولا إلى أنبوب البولي إيثيلين ، باستخدام حقنة ، ثم تبلور الكولاجين. الخطوة الثانية هي قطع أنبوب البولي إيثيلين إلى أطوال ملليمترين لتشكيل وحدات الأنسجة الدقيقة.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي فصل الوحدات عن الأنبوب ، وأخيرا ، يتم طلاء الوحدات بالخلايا البطانية. في النهاية ، يمكن استخدام الأنسجة الدقيقة الناتجة في المقايسات الخلوية في المختبر لدراسة تفاعل الخلايا عبر غرفة الموائع الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن زرع الأنسجة الدقيقة لتوليد الأنسجة لدراسة تفاعل وإعادة تشكيل الأنسجة الدقيقة في الجسم الحي.

مرحبا ، اسمي بريندان لونج من مختبر سيبان هنا في جامعة تورنتو. من العقبات الرئيسية في إنشاء بديل كبير للأنسجة ثلاثية الأبعاد عدم وجود إعادة تأهيل سريع للأوعية الدموية بعد الزرع. في هذا الفيديو ، سنوضح لك كيفية إنشاء أنسجة معيارية مغطاة بالخلايا البطانية للمساعدة في التغلب على هذا القيد.

اعتبار إثبات الإجراء تشامبرلين ، زميل ما بعد العملية من مختبر سيبتين. تعتمد كمية الكولاجين المراد تحييدها على طول أنبوب البولي إيثيلين. في هذا العرض التوضيحي، سنستخدم أنابيب بولي إيثيلين بطول مترين بقطر داخلي يبلغ 0.76 ملم وقطرها الخارجي 1.22 ملم.

لتحضير الأنبوب ، قم بربط إبرة واحدة بوزن 20 جم في أحد طرفي الأنبوب ، ثم ضع الأنبوب في كيس محول ذاتي الشفاء للتعقيم بالغاز. نظرا لأن ملليلتر واحد من الكولاجين يملأ حوالي مترين من أنابيب البولي إيثيلين ، فسنقوم بتحييد مليلتر واحد من الكولاجين. ضع الكولاجين في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر واحتفظ بالأنبوب على الثلج.

أضف 128 ميكرولترا من 10 × ألفا ، MEM لكل مليلتر من الكولاجين إلى الأنبوب واخلطها عن طريق سحب المحلول بشكل متكرر. مع الحرص على تقليل صنع الفقاعات ، يجب أن يتحول المحلول إلى اللون الأصفر حيث يتم خلط ألفا MEM في الكولاجين المحمض. بعد ذلك ، قم بتحييد الكولاجين بإضافة 0.8 مولار بيكربونات الصوديوم للحصول على تقدير عام للأس الهيدروجيني ، أضف بيكربونات الصوديوم حتى يتحول محلول الكولاجين الأصفر إلى اللون الوردي الفاتح.

عادة ما يستغرق الأمر من 30 إلى 60 ميكرولترا لكل مليلتر من الكولاجين لتحقيق درجة حموضة 7.4. لمنع الكولاجين المحايد من التبلور ، احتفظ به على الثلج حتى يصبح جاهزا للاستخدام. لبدء إجراء هلام الكولاجين ، خذ الكيس الذي يحتوي على أنبوب البولي إيثيلين المعقم إلى خزانة السلامة البيولوجية واقطع الطرف المغلق للكيس مع الاحتفاظ بالأنبوب في الكيس.

استخدم ملاقط معقمة لتوصيل حقنة سعة ثلاثة ملليلتر بإبرة قياس 20 تم إدخالها مسبقا في أحد طرفي الأنبوب. أدخل الطرف الآخر من الأنبوب في الكولاجين المحايد حتى يصبح الطرف في قاع الأنبوب المخروطي ، والذي يتم الاحتفاظ به على الجليد. هذه الخطوة التالية عليك القيام بها ببطء ، وإلا فإنك تدخل فقاعات الهواء في الكولاجين.

اسحب مكبس المحقنة ببطء لسحب الكولاجين إلى أنبوب البولي إيثيلين. عندما يتم سحب الكولاجين من خلال الأنبوب ، اسحب الإبرة قياس 20 للخارج وأعد طرفي الأنبوب إلى الكيس. بعد إغلاق الكيس ، تحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

سيتم استخدام جهاز قطع مجمعة مسبقا لقطع الأنبوب. لبدء هذا الإجراء ، ضع الأنبوب في صينية معقمة أمام جهاز القطع وقم بتحميل الأنبوب في جهاز القطع عند مخرج جهاز القطع ، وقم بإعداد أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 25 مل من وسائط الخلايا البطانية. لجمع وحدات القطع ، اضبط جهاز القطع لقطع طولين من الأنابيب ثم قم بقص الأنبوب.

احتضان وحدات القطع في الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. لإزالة وحدات الكولاجين من الأنبوب ، الدوامة ، الأنبوب المخروطي سعة 50 لترا الذي يحتوي على الوحدات بسرعة متوسطة. لمدة 10 ثوان ، اترك الوحدة تستقر في قاع الأنبوب ، الأمر الذي يستغرق حوالي خمس دقائق.

ستتشكل حبيبات فضفاضة من الوحدات في الجزء السفلي من الأنبوب بينما ستشكل الأنبوب طبقة أعلى الوسائط. بعد استقرار الوحدات ، استخدم ماصة مصلية واسعة سعة 10 مليلتر لنقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. دوامة ، الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر ، ثم السماح للوحدات بالاستقرار مرتين أخريين.

يتم أيضا نقل الوحدات المستقرة من الدوامة الثانية والثالثة إلى أنبوب 15 ملليلترا. بعد إزالة جميع الوحدات من الأنبوب وتجميعها ، ارفع حجم الوسائط في الأنبوب إلى خمسة ملليلترات. الوحدات جاهزة الآن للطلاء بالخلايا البطانية ، والتي سيتم عرضها بعد ذلك لإعداد الخلايا البطانية لطلاء الوحدات.

أولا ، قم بإزالة الوسائط من الخلايا واغسلها باستخدام PBS. بعد إزالة PBS ، أضف ثلاثة ملليلتر من التربسين EDTA واحتضنه لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتعليق الخلايا في سبعة ملليلتر من الوسائط ونقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، ستحتاج إلى خمسة في 10 إلى الخلايا البطانية السادسة لكل مليلتر من الوحدات المعبأة في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي. حبيبات الخلايا في 300 غرام لمدة خمس دقائق. أعد تعليق بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من وسائط الخلايا البطانية.

أضف الآن خمسة ملليلتر من الوسائط التي تحتوي على خلايا بطانية إلى الوحدات. يتم تحضين الوحدات مع الخلايا البطانية ، بشكل ثابت وديناميكي للحضانة الساكنة ، وخلط الوحدات مع الخلايا البطانية عن طريق الانعكاس ، ثم ضبط الأنبوب في وضع مستقيم عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، اقلب الأنبوب مرة أخرى واحتضن 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى.

لاحتضان الوحدات مع الخلايا البطانية ديناميكيا ، قم بهز الأنبوب سعة 15 مليلتر برفق عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بمجرد اكتمال الحضانة بالخلايا البطانية ، انقل الوحدات إلى صفيحة معالجة غير مزرعة الأنسجة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي ، ضع الوحدات في صفيحة جديدة غير معالجة بزراعة الأنسجة مع وسائط جديدة لإزالة الخلايا البطانية غير المتصلة. احتضان الوحدات المغلفة بالخلايا البطانية عند 37 درجة مئوية حتى تغطي الخلايا 100٪ من سطح الوحدات.

يستغرق هذا عادة حوالي سبعة أيام. ستبدو الوحدات أسطوانية عند إزالتها لأول مرة من الأنبوب. إذا كانت مغطاة بالخلايا البطانية ، فيمكن أن تنقبض حتى 50٪ من الحجم وتطور شكلا بيضاويا ، بالإضافة إلى أن تصبح أكثر كثافة وأكثر غموضا عند عرضها بواسطة المجهر الضوئي.

في هذه الصور ، يشار إلى قطر وطول الوحدات بواسطة d و l على التوالي. تظهر هذه الصورة التالية خليتين مضمنتين من Hep G موزعين بشكل موحد داخل الوحدات النمطية في وقت التصنيع. احتفظت الخلايا بقابلية عالية للحياة كما يتضح من اللون الأخضر للخلايا الحية.

ستكون الخلايا الميتة حمراء اللون عندما تتلاقى الخلايا البطانية. على سطح الوحدات ، هناك تكوين من الوصلات الضيقة ، والتي يمكن رؤيتها عن طريق التألق المناعي. أظهر تلطيخ تحليل نقل كتلة الكاديرين VE أن الوحدات قادرة على دعم كثافة الخلايا العالية دون تطوير نواة نخرية بسبب عدم كفاية نقل الأكسجين ، والذي غالبا ما يكون مشكلة في الأنسجة الكبيرة.

في هذا المثال ، يظهر تلطيخ ثلاثي القطع للوحدات الصغيرة النموذجية أن الوحدات احتفظت بتوزيع موحد وعالي للخلايا الحية بعد سبعة أيام من التصنيع. في المقابل ، تشكل عدد كبير من الخلايا الميتة داخل قلب الوحدات الكبيرة ولم يتبق سوى حافة رفيعة من الخلايا القابلة للحياة. كما تم إنتاج الوحدات بمزيج من الكولاجين والبوليمر أو تحتوي على كريات مجهرية مملوءة بالدواء.

هنا عندما تجلس خلايا h hm EC على وحدات الكولاجين بالين ، تحتفظ الوحدات بشكلها الأسطواني وهناك خصائص ارتباط محدودة للخلية مقارنة بوحدات الكولاجين فقط. تظهر هنا صورة مجهر ضوئي لوحدة كولاجين تحتوي على كريات مجهرية قابلة للتحلل الحيوي قائمة على PLGA. ثبت أن العديد من المقايسات في المختبر متوافقة مع الوحدات.

على سبيل المثال ، في مقايسة تكوين الأوعية الدموية ، يمكن اكتشاف التكوينات الشبيهة بالشعريات على وحدة تجلس مع الخلايا البطانية بسهولة وقياسها بعد خمسة أيام من الحضانة بالخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. في مثال آخر ، تظهر صور الفحص المجهري متحد البؤر لمقايسة ميتة حية على الوحدات خلايا حية ملطخة باللون الأخضر والخلايا الميتة ملطخة باللون الأحمر. أخيرا ، تم استخدام الوحدات أيضا في غرف الموائع الدقيقة وزرعها في الفئران والجرذان لدراسة التفاعل بين أنواع الخلايا المختلفة وكيفية إعادة تشكيل الأنسجة الدقيقة بواسطة استجابة المضيف.

بعد الإجراء ، يمكن زراعة الوحدات في طبق بتري أو أوعية أخرى مثل المفاعل الحيوي أو جهاز الموائع الدقيقة. يمكن أيضا تكييف هذه الطريقة لإنشاء أنسجة مختلفة باستخدام مجموعات مختلفة من نوع الخلية أو باستخدام أنابيب ذات قطر مختلف. شكرا للمشاهدة.