الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد المعلومات المترية والهيكلية حول البروتين. جميع مجمعات الأربطة التي تعبر عن الخلايا البيولوجية الحية ، خلايا الخميرة معدلة وراثيا للتعبير عن البروتينات ذات الأهمية المرتبطة إما بمتبرع أو مسبار فلوري متقبل. يمكن إثارة مجسات المتبرعين مباشرة بواسطة الليزر.

في حين أن المتقبلين لا يمكن أن يكونوا متحمسين إلا من خلال نقل الطاقة من متبرع متحمس قريب ، فإن الخلايا تتعرض للضوء من ليزر الأشعة تحت الحمراء القريبة من النبض. يتم فصل الفلورسنت الملقح من المجسات إلى مكوناته الطيفية بواسطة شبكة إرسال ويتم إسقاطها على سطح مصفوفة CCD التي تضرب الإلكترون. لذلك ، أطياف الفلورسنت الكاملة من الفرد ، يتم الحصول على جميع الأربطة لكل موضع في العينة.

يعتمد المظهر الطيفي للتألق المكتشف على التفاعل المحدد للبروتينات ذات الأهمية. يتم تحليل البيانات لتحديد كل بكسل صورة لخلية المسح ، الانبعاثات المنفصلة من مجسات المانحة والمستقبل. يتم تحديد كفاءة نقل الطاقة عند كل بكسل صورة ، ثم يتم ثني وحدات البكسل وفقا لكفاءة الحنق والرسم البياني.

يسمح تفسير الرسم البياني بتحديد البروتين في الجسم الحي والحجم المعقد والتكوين. مرحبا ، اسمي مايكل ستونمان من مجموعة أبحاث ريكو في جامعة ويسكونسن ميلووكي. اسمي سينغ.

أنا من مختبر ريكوس في ويسكونسن ، ميلووكي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يتم الحصول على ملامح الانبعاث الكاملة من مئات جميع مجمعات الأربطة داخل الخلية من خلال مسح كامل واحد للخلية. عادة ما تتطلب معظم طرق الفحص المجهري الفلوري مسح الخلية ذات الأهمية عدة مرات من أجل تجميع معلومات طيفية كافية من أجل تحديد كفاءة الحنق في مختلف مناطق الاهتمام داخل الخلية.

ومع ذلك ، قد تؤدي التفاعلات الكيميائية الحيوية للانتشار إلى تغيير التركيب الجزيئي لهذه المناطق ذات الأهمية وبالتالي الحد من المعلومات التي تم الحصول عليها في مسح الصورة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة تفاعل البروتين والبروتين في الخلايا الحية ، مثل حجم ضرر القلة القلي؟ ما هي مرحلة دورة حياة البروتين التي تزرعها القلة ، وما هو دور أوليغومر هذا البروتين في الوظيفة الخلوية؟

يقوم المجهر الضوئي الذي تم حله طيفيا بتجميع المعلومات الطيفية حول مجمعات olima في خلية الصورة عن طريق مسح تركيز شعاع الإثارة عبر العينة ذات الأهمية في عدد من المواقع. يتم استخدام زوج من مرايا المسح المتعامد لترجمة تركيز شعاع الليزر عبر العينة في اتجاهين مختلفين. يتم التحكم في حركة مرايا المسح بالكمبيوتر ومزامنتها مع استخراج بيانات شدة التألق من كاميرا CCD من عمليات مسح الخط ، ويمكن إعادة بناء الخرائط المكانية المقابلة لطول موجي معين من الضوء.

من أجل إعادة بناء الخرائط المكانية لكثافة الفلورسنت بالأشعة السينية بدقة وحساب الطول الموجي الفعلي المقابل لكل من هذه الخرائط ، يجب معايرة بروتوكول مسح الخط باستخدام محلول الفلورسين. لبدء إجراء المعايرة, أرسل إلى طيف الإثارة بطول موجي 800 نانومتر, وهو ضعف الحد الأقصى للطول الموجي للإثارة لعلامة المانح GFP اثنين اثنين لإرسالها إلى طيف الإثارة, ترجمة المنشور الموجود داخل تجويف الليزر لتعديل تشتت سرعة المجموعة باستخدام برنامج الكمبيوتر الذي يتم ربط الكاميرا به. أرسل أمرا إلى شريحة CCD لخفض درجة حرارة شريحة CCD إلى أدنى درجة حرارة يمكن تحقيقها.

من أجل تقليل الضوضاء المظلمة. ماصة 10 ميكرولتر من محلول الفلورسين على غطاء منزلق مجهر مع زلة غطاء بحيث يتم تشتيت طبقة رقيقة من العينة بشكل موحد في المنطقة الواقعة بين زلة الغطاء وشريحة المجهر ، ضع قطرة صغيرة من زيت الغمر على سطح زلة الغطاء. الآن اربط المجهر ، وانزلق إلى مرحلة الترجمة XY و Z وقم بترجمة الشريحة والمرحلة في اتجاه المحور البصري عن طريق ضبط المشغل الخطي يدويا ، قم بترجمة الشريحة حتى يتلامس هدف المجهر مع قطرة زيت الغمر ، وقم بتبديل الكاميرا إلى وضع الفيديو للحصول على البيانات بحيث يتم عرض الضوء المعترف به الذي يضرب مصفوفة CCD على شاشة الكمبيوتر في الوقت الفعلي.

قم بإطفاء جميع أضواء الغرفة المحيطة لتقليل ضوضاء الخلفية المكتشفة في مصفوفة CCD. اضبط الميكرومتر ببطء الذي يتحكم في مرحلة الترجمة في اتجاه المحور البصري لإحضار العينة إلى البقعة البؤرية لشعاع الليزر. عندما تكون عينة الفلورسين في بؤرة التركيز ، سيظهر الانبعاث كخط حاد على مصفوفة CCD.

قم بتنزيل قراءة شدة البكسل من مصفوفة CCD إلى الكمبيوتر. قم بقياس شدة البكسل كدالة للموضع على مصفوفة CCD عن طريق فتح المصفوفة التي تم تنزيلها لقيم الشدة في الصورة J ورسم خط عبر منطقة الفلورسنت. استخدم الأمر image day.

تحليل ملف تعريف المؤامرة لإنشاء مخطط يوضح طيف الانبعاث لعينة الفلورسين. اضبط المعلمة المتزايدة للمرآة ، والتي تتحكم في حركة الليزر. التركيز في الاتجاه Y ، بحيث تؤدي المواضع y المجاورة داخل العينة إلى حركة ذروة أطياف الفلورسنت بمقدار بكسل واحد بالضبط على طول البعد الطيفي على مصفوفة CCD.

لمراقبة ذلك ، قم بتنزيل شدة أطياف الفلورسين لموضعين مختلفين من Y في العينة. ثم افتح صور الشدة بالصورة J وابحث عن موضع البكسل الأقصى لكل أطياف من أطياف الفلورسنت. باستخدام مؤشر الصورة J ، مع ترك مصراع CCD مفتوحا ، قم بمسح تركيز الليزر عبر العينة في الاتجاه X.

يجب أن يسقط الضوء المنبعث من كل فوكسل على طول خط المسح الضوئي على مصفوفة CCD في نهاية كل سطر ، ومسح البيانات من مصفوفة CCD التي تم الحصول عليها لمسح الخط هذا ثم مسح وحدات البكسل الخاصة بمصفوفة CCD. حرك موضع الليزر. ركز في اتجاه Y بالمبلغ المحدد مسبقا.

ثم امسح شعاع الليزر في الاتجاه X عبر العينة. مرة أخرى ، ترك مصراع CCD مفتوحا لتخزين البيانات. كرر إجراء مسح الخط هذا حتى تضيء منطقة مادية أكبر بحوالي 50٪ من أبعاد خلية بيولوجية واحدة بواسطة ضوء الليزر.

يجب استخدام العلاقة بين رقم الصف لصورة مسح خط معين والطول الموجي لإعادة بناء الصور للحصول على خرائط وجه متعددة من شدة الفلورسنت للزوجة السابقة بأطوال موجية مختلفة. للحصول على صورة إرسال الفلورسنت للزوجة السابقة لطول موجي معين ، ابحث عن رقم الصف على الصورة التي تم الحصول عليها من مسح السطر الأول الذي يتوافق مع هذا الطول الموجي. ثم يتوافق الصف المجاور لصورة مسح الخط اللاحق مع الصف التالي من صورة انبعاث الفلورسنت.

بالنسبة لهذا الطول الموجي المعين ، قم بتكديس جميع صفوف الصور التي تتوافق مع هذا الطول الموجي للحصول على الخرائط المكانية لشدة الفلورسنت XY للعينة بهذا الطول الموجي. كرر هذا الإجراء لجميع الأطوال الموجية الأخرى التي يمكن الحصول عليها لجمع البيانات على عيناتك. أولا ، قم بإزالة الألواح ذات مستعمرات الخميرة المحولة من الحاضنة.

يجب أن يكون هناك ثلاثة أنواع على الأقل من الخلايا المحولة. الخلايا التي تعبر عن البروتينات ذات الأهمية الموسومة بكلا النوعين من مجسات الفلورسنت. الخلايا التي تعبر فقط عن البروتينات الموسومة بمجسات الفلورسنت المانحة والخلايا التي تعبر فقط عن البروتينات الموسومة بمجسات الفلورسنت المستقبلة.

أضف 100 ميكرولتر من 100 مللي مولار كلوريد البوتاسيوم إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير. ثم باستخدام طرف ماصة دقيقة ، اكشط ثلاث إلى خمس مستعمرات خميرة من صفيحة الخلايا التي تعبر عن البروتينات الموسومة بكل من المتبرع وباستثناء مجسات الفلورسنت وتلقيح كلوريد البوتاسيوم 100 ملليمول. باستخدام هذه الخلايا ، قم بإزالة 10 ميكرولترات من تعليق الخلية وتوزيعها على مجهر جديد. تزحلق.

قم بتغطية القطرة بزلة غطاء وضع قطرة من الزيت على سطح زلة الغطاء. بعد ذلك ، أغلق الغالق يدويا في مسار شعاع الليزر لمنع ضوء الليزر من الوصول إلى هدف المجهر. اربط شريحة المجهر إلى مرحلة الترجمة XY و Z وقم بترجمة مرحلة الانزلاق في اتجاه المحور البصري حتى يتلامس هدف المجهر مع قطرة زيت الغمر.

الآن قم بتشغيل إضاءة ضوء المجال الواسع وانتقل إلى الكاميرا. وضع الفيديو لجمع البيانات. وستكون صورة المجال العريض للعينة غير واضحة بشدة بسبب وجود شبكة الإرسال في مسير الإرسال.

لذلك ، ضع مرشح تمرير النطاق بنصف عرض صغير كامل كحد أقصى في المسار البصري الذي يسبق شبكة الإرسال. قم بترجمة مرحلة الترجمة ببطء في اتجاه المحور البصري أثناء عرض صورة الخلايا على شاشة الكاميرا حتى يتم التركيز على الخلايا. قم بترجمة المرحلة إما في اتجاه X أو Y من أجل إحضار خلية واحدة إلى موقع تركيز شعاع الليزر.

قم بإيقاف تشغيل مصدر الإضاءة واسع المجال وإزالة مرشح مسار النطاق من مسار البث. قم بإلغاء حظر شعاع الليزر لفترة قصيرة أثناء عرض الإشارة المستلمة في مصفوفة CCD في نفس الوقت. إذا تم اكتشاف إشارة فلورية على مصفوفة CCD خلال الوقت الذي يسقط فيه شعاع الليزر على الخلية ، فقم بإجراء مسح كامل للحصول على بيانات الفلورسنت لهذه الخلية.

من الضروري استخدام نفس معلمات المسح ، وتحديدا عدد الخطوط وسبب الزيادة كما هو محدد في إجراء المعايرة المبين سابقا. كرر موقع الخلية وعملية الحصول على بيانات التألق لعدد كبير من الخلايا التي تعبر عن البروتين المرتبط بكل من علامات المتبرع وعلامات المتقبل. بعد تجميع ما يكفي من الصور الفلورية للخلايا التي تعبر عن البروتينات الموسومة بكلا المستقبلين ، كرر العملية برمتها لكلتا الخليتين ، والتي تعبر فقط عن البروتينات الموسومة بالمجسات الفلورية المانحة والخلايا التي تعبر عن البروتينات الموسومة بمجسات الفلورسنت المستقبلة.

أخيرا ، أعد بناء جميع عمليات الفحص للحصول على حلها الطيفيا. الخرائط المكانية لشدة الفلورسنت XY لكل مجموعة من البيانات باستخدام الإجراء الموضح سابقا الموضح في هذه الأشكال الثلاثة هي الخرائط المكانية الناتجة المحسوبة من قياسين مجهريين فوتونيين تم إجراؤهما على خلية خميرة تعبر عن مستقبلات عامل ألفا المعقمة إلى ألفا. تم الحصول على خرائط ثنائية الأبعاد لإشارات المانحة والمستقبلة من تحليل ملامح الانبعاث الطيفية التي تم الحصول عليها من كل موقع من مواقع الخلية.

يتم تعيين شدة التألق بألوان زائفة وفقا لقيمها ، ويظهر المقياس كداخلي. ثم تم حساب خريطة ثنائية الأبعاد لكفاءات الحنق الظاهرة باستخدام صور KDA و KAD باستخدام القيم المستخرجة من خريطة كفاءات الحنق الظاهرة للخلية التي أظهرت للتو تم إعداد مخطط الرسم البياني. يتم تمثيل قيم EAPP المقاسة للخلية بالدوائر.

يمثل الخط الصلب الأحمر أفضل ملاءمة للبيانات المقاسة باستخدام مجموع وظائف الكالسيوم الفردية التي تمثلها خطوط خضراء صلبة. يؤكد تحليل الرسم البياني الموصوف في نص البروتوكول أن مستقبلات عامل ألفا المعقمة ذات الاثنين من مركب الأربطة يفترض شكل رباعي على شكل RBA في الجسم الحي. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 12 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء إجراء هذه التجربة ، من المهم الحفاظ على قوة مصدر الإثارة منخفضة. من المهم تجنب الإثارة المتعددة للمتبرع بنبضة واحدة.