عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور المستقبلات المفردة على سطح الخلايا الحية وتحليل موقعها وحركتها وارتباطها الديناميكي في مجمعات فوق الجزيئية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعبير عن المستقبلات ذات العلامات المفاجئة عند مستويات منخفضة جدا على سطح الخلايا الحية وتصنيفها بالفلوروفورات العضوية الساطعة للسماح باكتشاف جزيء واحد. كخطوة ثانية ، يتم تصور الخلايا عن طريق المجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي ، والذي يسمح بالحصول على تسلسل صور سريع لجزيئات المستقبلات الفردية التي تتحرك على سطح الخلية.

بعد ذلك ، يتم تطبيق خوارزميات الكشف والتتبع الآلي على تسلسل الصورة من أجل الحصول على موضع وشدة كل جسيم مستقبلات بمرور الوقت. تم الحصول على النتائج التي تظهر تحليلا دقيقا لحجم مجمعات المستقبلات في هذا المثال ، مستقبلات بيتا الأدرينالية بناء على تركيب غاوسي مختلط لتوزيع شدة الجسيمات في بداية تسلسل الصورة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، مثل كيفية تنظيم مستقبلاتنا في مجالات od لسطح الخلايا الحية.

كيف تتفاعل مع بعضها البعض لتشكيل ثنائيات وقلة ، وكيف تحدث الأحداث الديناميكية على أساس إشارات المستقبلات بالفعل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طرق الكيمياء الحيوية والفحص المجهري القياسية هي أنها تحقق في سلوك المستقبلات المفردة في البيئة الطبيعية ، مما يسمح لنا بدراسة الجوانب المهمة التي عادة ما تكون مخفية في قياسات المجموعة. يجب تنظيف زلات الغطاء للعينات على نطاق واسع لتقليل تألق الخلفية أثناء التصوير ، استخدم ملاقط نظيفة لوضع قطر 24 ملم.

ينزلق الغطاء الزجاجي في حامل انزلاق الغطاء الذي يفصل زلات الغطاء الفردية. ضع الحامل مع زلات الغطاء في دورق وأضف الكلوروفورم حتى ينزلق الغطاء. قم بتغطية الدورق بورق الألمنيوم لتقليل التبخر والصوتنة في الحمام.

صوتية لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، أخرج حامل انزلاق الغطاء من الدورق واترك الغطاء يجف. بعد ذلك ، ضع الحامل مع انزلاق الغطاء في دورق آخر وأضف خمسة محلول هيدروكسيد الصوديوم المولي حتى ينزلق الغطاء.

كما كان من قبل ، قم بتغطية الدورق بورق الألمنيوم والصوتنة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم انقل حامل زلة الغطاء إلى دورق جديد واغسله ثلاث مرات بالماء المقطر. أخيرا ، ضع زلات الغطاء النظيفة في طبق ثقافة الخلايا الزجاجية المليء بالإيثانول بنسبة 100٪. تظهر هنا زلات الغطاء قبل التنظيف وبعده ، مصورة بواسطة انعكاس داخلي كلي مضان أو مجهر العشب.

تستخدم عينات معايرة Cal لتقدير شدة جزيئات الفلورسنت المفردة أثناء الفحص المجهري للعشب. لتحضير العينات ، قم بإذابة صبغة الفلورسنت في المذيب المناسب. قم بإعداد تخفيف تسلسلي من واحد إلى 10 لصبغة الفلورسنت تتراوح من بيكامولار إلى ضرس واحد.

في الماء المعقم بالفلتر. اغسل زلات الغطاء التي تم تنظيفها مسبقا عن طريق نقلها إلى طبق زراعة خلية مملوء بالماء المعقم بالفلتر. بعد ذلك ، ضع كل غطاء في بئر من لوحة ثقافة من ستة خلايا جيدة وانتظر حتى تجف بقعة 20 ميكرولترا من كل تخفيف صبغة فلورية على زلة غطاء نظيفة منفصلة.

دع الغطاء ينزلق يجف تحت غطاء معقم. احم زلاقات الغطاء من الضوء والغبار حتى الاستخدام قبل الشفافية. قم بإعداد لوحة ثقافة بستة خلايا آبار اغسل زلات الغطاء النظيفة باستخدام PBS معقم وضع غطاء واحد في كل بئر من لوحة زراعة خلايا الآبار الستة.

استزراع خلايا CHO المراد نقلها لهذه الدراسة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 في خليط واحد من المغذيات المتوسطة المعدلة من ECCOs F 12 مع 10٪ من مصل الأبقار الجنيني البنسلين والستربتومايسين بعد التربسين وعد الخلايا باتباع الطرق القياسية البذور بكثافة ثلاثة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر. في صفيحة زراعة خلايا البئر السادسة التي تحتوي على زلات الغطاء ، دع الخلايا تنمو في حاضنة لمدة 24 ساعة من أجل تحقيق ما يقرب من 80٪ من الطلاقة المشتركة ، وهي كثافة الخلية المثلى. للتعداد.

أصعب جانب في هذا البروتوكول هو تحقيق مستوى تعبير منخفض للغاية لمستقبلات الغشاء على سطح الخلية لضمان النجاح. حالة التعدي. على سبيل المثال ، يجب تحسين مقدار الوسائط الزائدة NA والوقت بعد التعداء في يوم التعدين.

سيؤدي إعداد كواشف الإرسال لكل منها إلى تخفيف ميكروغرامين من الحمض النووي المنقوش المطلوب في 500 ميكرولتر من الوسط الأمثل في أنبوب آخر. لكل بئر ، قم بتخفيف ستة ميكرولتر من استئصال الدهون 2000 في 500 ميكرولتر من وسط Optum. احتضان كلا الأنبوبين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد خمس دقائق ، امزج كلا المحاللين في أنبوب واحد واخلطهم للحصول على خليط تعداد. احتضان خليط التعداء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. في غضون ذلك ، قم بإعداد خلايا CHO.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS التحذير المسبق بعد الغسيل الثاني ، استبدل PBS بمليلتر واحد لكل بئر من وسط D-M-E-M-F 12 الخالي من الفينول الأحمر المكمل بنسبة 10٪ FBS ، ولكن بدون مضادات حيوية. أضف ملليلترا واحدا من خليط التعداء ، بالتنقيط إلى كل بئر وهز اللوحة برفق ذهابا وإيابا لضمان الخلط الكامل. احتضن عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة ساعتين إلى أربع ساعات قبل المتابعة على الفور إلى وضع العلامات على البروتين.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتخفيف ميكرولتر واحد من مشتق البنزو غينيا المترافق الفلورو الأربعة أو محلول مخزون الفلورو أربعة BG في مليلتر واحد من وسط D-M-E-M-F 12 مكمل بنسبة 10٪ FBS للحصول على تركيز نهائي من ميكرومولار واحد. استرجع الخلايا المنقولة من الحاضنة واغسلها مرتين باستخدام PBS الدافئ. استبدل PBS بمليلتر واحد من محلول ميكرومولار فلورو أربعة BG واحتضانه عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات بوسيط D-M-E-M-F 12 مكمل بنسبة 10٪ FBS في كل مرة ، تليها حضانة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. تستخدم ملاقط لنقل زلات الغطاء ذات الخلايا المصنفة إلى غرفة التصوير. يغسل مرتين باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير.

أضف 300 ميكرولتر من مخزن التصوير الجديد وانتقل على الفور إلى الحصول على صور التصوير. باستخدام مجهر العشب المجهز بالغمر بالزيت ، وهدف الفتحة العددية العالية ، والليزر المناسب ، وجهاز مقترن بالشحنة المضاعفة للإلكترون ، والكاميرا ، والحاضنة ، والتحكم في درجة الحرارة. قم بتعيين معلمات المجهر المطلوبة ، وهي خط الليزر ، وزاوية العشب ، ومعدل الإطار الزمني ، وعدد الصور لكل فيلم.

ضع قطرة من زيت الغمر على هدف 100 × من المجهر. ضع حجرة التصوير مع الخلايا المسماة على حامل عينة المجهر وقم بتركيز الخلايا. استخدام إضاءة المجال الساطع.

قم بالتبديل إلى إضاءة العشب. حافظ على طاقة الليزر منخفضة قدر الإمكان للسماح بالبحث عن الخلية المطلوبة ، ولكن في نفس الوقت تقليل تبييض الصور. حدد الخلية المطلوبة وجاهمة.

اضبط التركيز. قم بزيادة قوة الليزر إلى مستوى يسمح بتصور أربعة النباتات الفردية. احصل على تسلسل صورة واحفظ تسلسل الصورة الأولية كملف tiff للمعايرة.

قم بتجميع كل عينة معايرة في غرفة التصوير وضعها على المجهر. اختر عينة تحتوي على حيود منفصل جيدا. بقع محدودة تبيض في خطوة واحدة.

يتم الحصول على تسلسل صور العشب لاحقا بنفس الطريقة الموضحة للخلايا المصنفة. لإعداد تسلسل صورة، استخدم برنامج معالجة الصور مثل Image J لاقتصاص الصور. احفظ الإطارات الفردية كصور TIFF منفصلة في مجلد جديد يشير إلى رقم الإطار في كل صورة.

يتم الكشف عن الجسيمات وتتبعها باستخدام برنامج غير تجاري مثل U Track في بيئة MATLAB. من موجه الأوامر MATLAB ، اكتب محدد الفيلم ، واجهة المستخدم الرسومية. لفتح واجهة تحديد الفيلم، اتبع الإرشادات لإنشاء قاعدة بيانات أفلام جديدة بدءا من الصور المنفصلة المحفوظة مسبقا.

توفير حجم البكسل بالنانومتر الفاصل الزمني بالثواني، وعمق بت الكاميرا ذات الفتحة العددية والطول الموجي للانبعاث للفلوروفور المطلوب لاكتشاف الجسيمات وتتبعها. احفظ قاعدة بيانات الفيلم من واجهة تحديد الفيلم. قم بإجراء التحليل مع اختيار الجسيمات المفردة كنوع من الكائنات.

قم بتشغيل خوارزمية الكشف ، ثم قم بتشغيل خوارزمية التتبع. استخدم روتين عارض الأفلام الموجود في حزمة URAC لتصور المسارات والتحقق من جودة الكشف والتتبع. افتح ملف MAT النقطي لمعرفة موضع وسعة الجسيمات المتعقبة في كل إطار.

يمكن أيضا حساب حجم الجسيمات من البيانات التي تم الحصول عليها. يظهر هنا الإطار الأول لتسلسل صورة العشب النموذجي لخلية منقولة بمستقبلين أدريناليين ثنائيين من مستقبلات بيتا ذات العلامات المفاجئة والمسمى بمشتق البنزيل البنزيل المترافق بأربعة فلورو. تمثل البقع مستقبلات مفردة أو مجمعات مستقبلات.

يتم تطبيق خوارزمية الكشف على نفس تسلسل الصورة ويشار إلى كل جسيم تم اكتشافه بواسطة تطبيق دائرة زرقاء لخوارزمية التتبع. إلى نفسه صورة تسلسل ينتج في مسارات من الجسيمات فردية يشار في أزرق. تمثل الشرائح الخضراء أحداث الدمج وتمثل الشرائح الحمراء أحداث التقسيم.

تلتقط هذه الطريقة أيضا الأحداث الديناميكية. في هذا المثال ، يخضع جسيمان لتفاعل عابر ، ويتحركان معا لعدة إطارات وينقسمان مرة أخرى. تستخدم مسارات الجسيمات الفردية لحساب معاملات انتشارها.

تظهر هذه النتيجة التمثيلية أن مستقبلات بيتا اثنين الأدرينالية لديها قدرة عالية على الحركة. في حين أن مستقبلات GABA B لها حركة محدودة ، يمكن تقدير حجم مجمعات المستقبلات بدقة من خلال ملاءمة توزيعات شدة الجسيمات مع نموذج غاوسي مختلط. يمكن أن يكشف هذا التحليل أيضا عن التعايش بين المونومرات والثنائيات.

تظهر هنا أمثلة على تبيض جسيمات المستقبل الأحادي في خطوة واحدة وتبييض جسيمات مستقبلات قطرية في خطوتين. يمكن توسيع هذه الإجراءات وتكييفها للعمل مع بروتينات سطح الخلية الأخرى وطرق التسوية ونماذج الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج نوم غطاء نظيف ، وكيفية الحصول على مستويات تعبير منخفضة ووضع العلامات الفعالة باستخدام الفلورو العضوي الساطع ، بالإضافة إلى كيفية الحصول على صور العشب وتحليلها ، والتي تمثل جميع الخطوات الرئيسية لنجاح جزيء واحد.