أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير طريقة آلية لتحليل وتحديد التغيرات في مورفولوجيا خلية الشكل غير المحددة المأخوذة من صور مضان متحد البؤر ثلاثي الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء تجربة التحفيز الكيميائي أولا لتشمل الخلايا المعالجة بالخلايا الناهضة ، والمعالجة بالمضاد ، تليها ناهض وخلايا بدون علاج. ثم يتم تحضير الخلايا لتحليل التألق المناعي.

الخطوة الثانية هي الحصول على صور مضان ثلاثية الأبعاد متعددة الأطياف. بعد ذلك ، يتم إجراء التحليل المورفومتري ثلاثي الأبعاد باستخدام ameris neuroscience و ameris XT و MATLAB للكمبيوتر. ثم يتم تحليل التغييرات المظهرية للخلية المفردة التي يتم تصورها من خلال التحليل المورفومتري ثلاثي الأبعاد وقياسها كميا كخطوة نهائية.

في النهاية ، يتم استخدام منصة البرنامج هذه لتحديد التغيرات في شكل الخلية بعد تنشيط المستقبلات ، مما يوفر أداة إضافية لاكتشاف الأدوية. بشكل عام ، يتمتع الباحث بخبرة قياسية في النظام البيولوجي ، وقد لا يكون لديه إلمام بتطبيقات الكمبيوتر. في هذا البروتوكول في الوحدة النمطية I 60 ، سد الفجوة بين التصور ولغة الكمبيوتر قبل بدء هذا الإجراء.

خلايا الكلى الجنينية البشرية مع الهيماجلوتينين الموسومة بالكورتيكوتروبين الذي يطلق مستقبلات العامل الثاني أو CRF R اثنين كما هو مشار إليه في البروتوكول المكتوب. CFR الثاني هو مستقبل مقترن ببروتين G أو GPCR. في اليوم التالي لغطاء اللهب الشفاف ينزلق ويضعه في صفيحة من ستة آبار.

أضف 10 ملليلتر من PBS إلى قارورة من خمسة ملليغرام من البولي ليسين المجفف بالتجميد واخلطه. ثم قم بتخفيف خمسة ملليلتر من البولي ليسين المذاب في 500 مل من PBS وأضف ملليلترين من الخليط على كل شريحة من زلات الغطاء. اترك اللوحة مع زلات الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة بعد 20 دقيقة ، اغسل زلات الغطاء بإضافة ملليلترين من PBS ثم إزالتها ، كرر هذه العملية مرتين.

الطبعة التالية من ملليلترين من DMEM مع وسائط FBS 10٪ تضيف قطرتين إلى خمس قطرات من الخلايا على زلات الغطاء. يجب أن تكون الخلايا بالتركيز اللازم لتحقيق 60٪ من الطلاقة. في اليوم التالي.

احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي. تأكد من أن الخلايا ملتقية بنسبة 60٪ للعلاج الناهض. تحفيز الخلايا المعينة عن طريق استبدال الوسائط بملليلترين من الوسائط المكملة بعامل إطلاق الكورتيكوتروبين الترابط الداخلي CRF R بتركيز ميكروموريال واحد.

احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى تتم معالجة الخلايا مسبقا بالخصم. استبدل الوسائط بملليلترين من الوسائط المكملة بمضاد انتقائي CFR مضاد للإنقاذ 30 بتركيز ميكرومولار واحد. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد العلاج المضاد. تحفيز الخلايا باستخدام ناهض CRF واحتضانها 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للخلايا غير المعالجة. استبدل الوسائط بملليلترين من الوسائط الطازجة بعد العلاج.

استبدل الوسائط الموجودة في كل بئر بملليلترين من الوسائط الطازجة وأضف مضادا ل HHA مخفف من واحد إلى ألف ، بعد حضانة لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استنشق الوسائط وأضف ملليلترين من المثبت لكل منهما. احتضن اللوحة جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة بعد شفط المثبت.

اغسل الخلايا ثلاث مرات بمحلول ملحي منتفخ. قابيل. أضف 100 ميكرولتر من محلول الدم فوق كل غطاء ، وانزلق واحتضن درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم استنشق محلول البقع الموجود من الآبار وأضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية الطازجة إلى كل زلة غطاء بعد حضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، وغسلها أربع مرات باستخدام TBSC عن طريق إضافة المحلول برفق وإزالته من الجدار الجانبي للبئر بينما لا يزال في محلول الغسيل النهائي.

التقط كل زلة غطاء بإبرة وملقط منحني. ضع خلايا انزلاق الغطاء متجهة لأسفل على شريحة مع قطرة من وسط تركيب الدرع المتجه مع تثبيت أنيق مع طلاء الأظافر واتركها تجف لمدة 15 إلى 20 دقيقة. يستخدم Alexa ، 4 88 نانومتر ، الجسم المضاد المترافق لتصور CFR الثاني ويستخدم DAPI لتصور المرحلة الانقسامية للنوى لبدء تركيب خلايا الإصلاح على مجهر فلوري للحد من الذاتية التجريبية ، والحفاظ على الظروف التجريبية غير معروفة إلا بعد الحصول على الصور وتحليلها للحصول على الصور.

استخدام زيت أحمر حصيرة الخطة ، هدف DIC مع تكبير 63 × وفتحة عددية 1.4 بالاشتراك مع مجهر زي LSM خمسة 10 ميتا متحد البؤر متصل بنظام ليزر فوتونين متكامل متماسك أثناء عملية الحصول على البيانات ، قم بتقسيم الخلايا عن طريق تقسيم متعدد القنوات و c لتضمين البيانات من الغشاء النووي إلى أطراف المستقبلات الخارجية خارج الخلية. قم بمعالجة بيانات التألق باستخدام amris ، مما يسمح بتصور وتجزئة مجموعة بيانات الفحص المجهري ثلاثي الأبعاد. باتباع الخوارزمية التي صممها Amaris أولا ، استخدم عرض السطح لتمثيل الغشاء النووي NU.

سيحدد Amaris ما إذا كان هناك أكثر من نواة واحدة في المنطقة محل الاهتمام ، أو عائد الاستثمار. بعد ذلك ، استخدم خوارزمية إنشاء البقع لتحديد موقع CFR نقطتي تمديد. يعوض عن ضوضاء الخلفية والشدة غير المنتظمة للشبكة المعقدة للخلايا غير المتبلورة لتعظيم إدراج كل وحدة من وحدات الكشف عن التألق ل CFR اثنين ، اضبط قطر البقع على 0.2 ميكرومتر ، وهي أصغر وحدة داخل الصورة.

هذا يسمح باستقراء المعلومات المميزة في شكل كثافة مقاسة. باستخدام مرشح Gaussian ، قم بدمج التصفية الموضعية في عملية الإنشاء الآلي للبقعة. لتجنب كاتيون البيانات ، قم بتحويل مجموعة البيانات من نقطة ثابتة ثمانية بت إلى تعويم 32 بت.

حدد السطح الذي تم إنشاؤه وحدد الموقع المكاني الدقيق لكل بقعة خارج السطح النووي عن طريق إجراء تحويل المسافة باستخدام الغشاء النووي كنقطة مرجعية. تبادل بيانات شدة فوكسل لبيانات الإحداثيات النقطية باستخدام وحدة ameris XT المتوافقة مع MATLAB. حدد النقاط وحدد الإحصائيات المشفرة في النوع الإحصائي.

اختر مركز الكثافة الذي تم الإبلاغ عنه في القناة الجديدة التي تم إنشاؤها. قم بتحميل اللون المطلوب للعرض وقم بتعيين نطاق خريطة الألوان للتحليل. يمكن تصور البيانات الرقمية في علامة التبويب الإحصائية وتصديرها إلى Excel باستخدام منشور GraphPad.

تحديد البيانات الناتجة وتقديمها في شكل رسومي للتحليل الإحصائي. إجراء مقارنات بين المجموعات باستخدام الاختبار اللاحق Inova و Bonferroni ثنائي الاتجاه لتقديم البيانات كمتوسط زائد أو ناقص انحراف معياري. لإثبات قوة هذا النهج ، فإن التغيرات الخلوية الناتجة عن تفاعل المستقبلات المقترنة ببروتين G ومستقبلات عامل إطلاق الكورتيكوتروبين الثاني مع CRF الترابط الداخلي.

في HT K 2 المنقولة ، تم قياس 93 خلية كميا ، ويتم تصور الصور المدمجة باستخدام Alexa 4 88 المترافق ، والمضاد للماوس ، والأجسام المضادة الثانوية ، و DPI لتصور النوى. تكشف النتائج أن مستقبلين CRF R يقعان في غشاء البلازما ويظهران من مناطق محدودة من غشاء الخلايا. باستخدام التحليل ثنائي الأبعاد التقليدي ، من الممكن اكتشاف هذه المجموعة الفرعية من مستقبلات CRF R خارج الخلية فقط إذا تم تحليل نقاط التصاق المستقبلات على الأغطية الزجاجية.

وبالتالي ، يتم فقد أي معلومات أخرى مشتقة من بيانات ZS متعددة الأطياف المكدسة. لم تختر النتيجة أي فرق بين عدم العلاج وناهض. في حين أن نقاط التصاق المستقبلات تختلف اختلافا كبيرا عند معالجة الخلايا ب CRF ، فإن المستقبلات خارج الخلية تقل بشكل كبير كما يتضح من انخفاض مسافة البقع من غشاء البلازما.

يتم إعادة توزيعها أيضا من مواقع محدودة بشكل أساسي إلى عدد من المواقع السرية. يتم منع تأثير CRF على توزيع غشاء المستقبلات عن طريق المعالجة المسبقة باستخدام CR اثنين من المضادين المحددين. 30 30.

في ظل هذه الظروف ، لا يتغير امتدادان CRFR مع علاج CRF. يتم استخدام التوزيع البعيد للبقع المرسومة في فترات مرمزة بالألوان بطيف خمسة ميكرومتر لتصور مسافة الفوكسل من الغشاء النووي. لم يظهر أي علاج ومعالجة مسبقة للمضاد قبل المعالجة الناهضة فرقا كبيرا في تقلص GPCR.

يقلل علاج الخلايا باستخدام CRF الناهض تدريجيا من عدد CFR اثنين المحتويين على فوكسل عند مقارنته بعدم العلاج أو بالمقارنة مع الخلايا. عولج مع الخصم كما بعد تطوره. لعبت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال تقنية التصوير الكمي لاستكشاف وتوصيف العديد من التغييرات المظهرية للخلية المفردة ، مما يجعل هذا الاختبار القائم على الخلية أداة إضافية للتنميط أحادي الخلية لعملية اكتشاف الأدوية.