أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير طريقة مؤتمتة لتحليل وتقدير التغييرات في مورفولوجيا خلية ذات شكل غير محدد مأخوذة من صور مجهرية بؤرية فلورية ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء تجربة تحفيز كيميائي تشمل خلايا عولجت بمحفز، وخلايا عولجت بمضاد يليه محفز، وخلايا لم تخضع لأي علاج. بعد ذلك، يتم تحضير الخلايا لتحليل التألق المناعي.

تتمثل الخطوة الثانية في الحصول على صور فلورية ثلاثية الأبعاد متعددة الأطياف. بعد ذلك، يتم إجراء تحليل مورفومتري ثلاثي الأبعاد باستخدام برمجيات ameris neuroscience وameris XT وMATLAB الحاسوبية. وفي الخطوة النهائية، يتم تحليل وقياس التغيرات المظهرية للخلية الواحدة التي تم تصورها من خلال التحليل المورفومتري ثلاثي الأبعاد.

وفي النهاية، تُستخدم هذه المنصة البرمجية لقياس التغيرات في شكل الخلية بعد تنشيط المستقبلات، مما يوفر أداة إضافية لاكتشاف الأدوية. وبشكل عام، يمتلك الباحثون خبرة قياسية في الأنظمة البيولوجية، ولكنهم قد لا يكونون على دراية بالتطبيقات الحاسوبية. وفي هذا البروتوكول في وحدة I 60، يتم سد الفجوة بين التصور المرئي ولغة الحاسوب قبل البدء في هذا الإجراء.

قم بنقل مستقبل العامل المطلق لموجهة القشرة من النوع الثاني الموسوم بالهيماجلوتينين، أو CRF R two، إلى خلايا الكلية الجنينية البشرية كما هو مشار إليه في البروتوكول المكتوب. يُعد CFR two مستقبلًا مقترنًا بالبروتين G أو GPCR. في اليوم التالي لعملية النقل، قم بتعقيم شرائح التغطية باللهب ووضعها في طبق بستة آبار.

أضف 10 milliliters من PBS إلى قارورة تحتوي على خمسة milligrams من البولي ليسين (polylysine) المجفف بالتجميد وامزجهما. بعد ذلك، خفف خمسة milliliters من البولي ليسين المذاب في 500 milliliters من PBS، ثم أضف two milliliters من هذا المزيج على كل شريحة غطاء. اترك الطبق الذي يحتوي على شرائح الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد مرور 20 دقيقة، اغسل شرائح الغطاء بإضافة two milliliters من PBS ثم إزالتها، وكرر هذه العملية مرتين.

بعد إضافة 2 mL من وسط DMEM المحتوي على 10% FBS، أضف من قطرتين إلى خمس قطرات من الخلايا فوق شرائح التغطية. يجب أن تكون الخلايا بالتركيز اللازم لتحقيق درجة تلاقي (confluency) تصل إلى 60%. في اليوم التالي.

حضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C. في اليوم التالي، تحقق من وصول الخلايا إلى درجة تلاقي بنسبة 60% تمهيداً للمعالجة بالمنشط. حفز الخلايا المحددة باستبدال الوسط بـ 2 mL من وسط مضاف إليه الربيطة الداخلية لمستقبل CRF R2، وهي عامل إطلاق كورتيكوتروبين، بتركيز 1 µM.

قم بتحضين الخلايا في حضانة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة لمعالجة الخلايا مسبقاً بالمضاد. استبدل الوسط بـ 2 mL من وسط مُدعم بالمضاد الاختياري CFR two antagonist anti salvaging 30 بتركيز 1 µM. قم بتحضين الخلايا في حضانة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة.

بعد المعالجة بالمضاد. يتم تحفيز الخلايا باستخدام CRF المنشط وتحضينها عند 37 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة بالنسبة للخلايا غير المعالجة. استبدل الوسط بـ 2 mL من وسط جديد بعد المعالجة.

استبدل الوسط الغذائي في كل بئر بـ 2 mL من وسط غذائي جديد وأضف anti HHA مخففاً بنسبة 1:1000، وذلك بعد حضانة لمدة 60 دقيقة عند 37 °C. اسحب الوسط الغذائي وأضف 2 mL من المثبت إلى كل بئر. حضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة بعد سحب المثبت.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول Tris buffered saline. أضف 100 µL من محلول blotto فوق كل شريحة غطاء، وتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، اسحب محلول blotto الموجود من الآبار وأضف 100 µL من مزيج الأجسام المضادة الثانوية الطازج على كل شريحة غطاء، مع التحضين لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. اغسل أربع مرات باستخدام TBSC عن طريق إضافة وإزالة المحلول بلطف من الجدار الجانبي للبئر بينما لا تزال في محلول الغسل النهائي.

ارفع كل شريحة غطاء باستخدام إبرة وملقط منحني. ضع شريحة الغطاء بحيث تكون الخلايا متجهة للأسفل على شريحة مجهرية تحتوي على قطرة من وسط التثبيت vector shield مع DAPI، ثم قم بتثبيتها بطلاء الأظافر واتركها لتجف لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة. يُستخدم Conjugate mouse antibody Alexa 488 nanometer لتصوير CFR2، بينما يُستخدم DAPI لتصوير النوى في المرحلة الانقسامية. لبدء العملية، قم بتثبيت الخلايا المثبتة على مجهر فلوري. وللحد من الذاتية التجريبية، اجعل الظروف التجريبية غير معروفة حتى يتم الحصول على الصور وتحليلها، وذلك من أجل التقاط الصور.

استُخدمت عدسة شيئية من نوع plan acro mat oil بتقريب 63x وفتحة عددية 1.4 بالتزامن مع مجهر Zeiss LSM 510 Meta confocal المتصل بنظام ليزر فوتوني ثنائي مدمج من شركة Coherent. وخلال عملية الحصول على البيانات، يتم تقسيم الخلايا إلى حجرات باستخدام القنوات المتعددة والتقسيم المكاني (C-partitioning) ليشمل البيانات الممتدة من الغشاء النووي وصولاً إلى نهايات المستقبلات الخارجية خارج الخلية. تُعالج بيانات الفلورة باستخدام برنامج Amaris، الذي يتيح تصور وتقسيم مجموعات بيانات المجهر ثلاثية الأبعاد. وباتباع الخوارزمية المصممة بواسطة Amaris، يتم أولاً استخدام تقنية رندرة السطح (surface rendering) لتمثيل الغشاء النووي NU.

سيقوم برنامج Amaris بتحديد ما إذا كان هناك أكثر من نواة واحدة في المنطقة المحددة، أو ROI. بعد ذلك، استخدم خوارزمية إنشاء البقع (spots creation algorithm) لتحديد موقع بقعتي توسعة CFR two. ولتعويض ضوضاء الخلفية والشدة غير المنتظمة للشبكة المعقدة من الخلايا غير المتبلورة لزيادة تضمين كل وحدة كشف فلورية لـ CFR two، اضبط قطر البقع على 0.2 micrometers، وهي أصغر وحدة داخل الصورة.

يتيح ذلك استقراء معلومات متميزة في شكل شدة مقاسة. وباستخدام مرشح غاوسي (Gaussian filter)، قم بدمج تصفية البقع في عملية إنشاء البقع الآلية. ولتجنب تشويه البيانات، قم بتحويل مجموعة البيانات من نقطة ثابتة بـ 8 بت إلى فاصلة عائمة بـ 32 بت.

حدد السطح الذي تم إنشاؤه وحدد الموقع المكاني الدقيق لكل بقعة خارج السطح النووي عن طريق إجراء تحويل للمسافة باستخدام الغشاء النووي كنقطة مرجعية. قم بتحويل بيانات كثافة الفوكسل إلى بيانات إحداثيات البقاع باستخدام وحدة ameris XT المرتبطة ببرنامج MATLAB. اختر البقاع وحدد الترميز الإحصائي في النوع الإحصائي.

اختر مركز الكثافة المسجل في القناة الجديدة التي تم إنشاؤها. حمّل اللون المطلوب للعرض واضبط نطاق خريطة الألوان للتحليل. يمكن تصور البيانات الرقمية في علامة التبويب الإحصائية وتصديرها إلى برنامج excel باستخدام GraphPad prism.

قم بقياس البيانات الناتجة وعرضها في شكل رسوم بيانية للتحليل الإحصائي. أجرِ المقارنات بين المجموعات باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (two-way ANOVA) واختبار بونفيروني (Bonferroni) للمقارنات البعدية، مع عرض البيانات كمتوسط زائد أو ناقص الانحراف المعياري. ولإثبات فعالية هذا النهج، يتم رصد التغيرات الخلوية الناتجة عن التفاعل بين المستقبلات المقترنة ببروتين G ومستقبل العامل المطلق للكورتيكوتروبين الثاني مع ربيطته الداخلية CRF.

في خلايا HT K 2 93 المنقولة جينيًا، تم قياس الصور المدمجة المرئية باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر مقترن بـ Alexa 4 88، وصبغة DPI لتصوير النوى. وتكشف النتائج أن مستقبلات CRF R two تقع في الغشاء البلازمي وتبرز من مناطق محدودة من غشاء الخلايا. وباستخدام التحليل التقليدي ثنائي الأبعاد (2D)، يمكن الكشف عن هذه المجموعة الفرعية من مستقبلات CRF R two خارج الخلية فقط في حال تحليل نقاط التصاق المستقبلات على الأغطية الزجاجية.

وبناءً على ذلك، تُفقد أي معلومات أخرى مشتقة من بيانات ZS المكدسة متعددة الأطياف (MULTISPECTRAL). وقد أظهرت النتيجة عدم وجود فرق بين المجموعة التي لم تتلقَّ علاجاً والمجموعة التي عولجت بالمنشط. وبينما تختلف نقاط التصاق المستقبلات بشكل كبير عند معالجة الخلايا بـ CRF، فإن المستقبلات خارج الخلوية تنخفض بشكل ملحوظ، كما يتضح من تناقص المسافة بين البقع والغشاء البلازمي.

كما يتم إعادة توزيعها من مواقع محددة بشكل أساسي إلى عدد من المواقع المنفصلة. ويتم منع تأثير CRF على توزيع المستقبلات في الغشاء عن طريق المعالجة المسبقة بمضادات CRF النوعية 30 30.

تحت هذه الظروف، لا تتغير امتدادات CRFR الاثنين مع معالجة CRF. يُستخدم التوزيع البعيد للبقع المرسومة في فواصل لونية طيفية تبلغ خمسة ميكرومتر لتصور مسافة الفوكسلات عن الغشاء النووي. لم يظهر عدم العلاج والمعالجة المسبقة بمضاد قبل المعالجة بالمحفز أي فرق معنوي في انقباض GPCR.

يؤدي علاج الخلايا باستخدام المناهض CRF إلى تقليل عدد الفوكسلات التي تحتوي على CFR 2 بشكل تدريجي عند مقارنتها بعدم العلاج أو بمقارنتها بالخلايا التي عولجت مسبقاً بالمناهض As بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تقنيات التصوير الكمي لاستكشاف وتوصيف العديد من التغيرات المظهرية للخلايا المفردة، مما يجعل هذا المقايسة القائمة على الخلايا أداة إضافية لتوصيف الخلايا المفردة في عملية اكتشاف الأدوية.