قياس كمية حمل بكتيريا الأنسجة في نموذج فأر للعدوى المعوية المزمنة

ابدأ بفأر تم إعداده ملوثا بسلالة بكتيرية مقاومة للمضادات الحيوية تحاكي العدوى المزمنة في الأمعاء.

كشف تجويف البطن للوصول إلى الأيقوص والطحال.

احصد الأنسجة المخروفية والأنسجة الطحالية، التي تمثل مواقع الاستعمار البكتيري في المعاء والجهاز.

ضع كل منديل في أنبوب منفصل يحتوي على حاجز وخرزة فولاذية.

قم بتجانس الأنسجة عن طريق تحريك الأنابيب بسرعة، مما يؤدي إلى اصطدام الخرزات الفولاذية بالنسيج، وتحطيمها، وإطلاق البكتيريا في التعليق.

قم بتخفيفات متسلسلة للمتجانسات في المخزن لتقليل تركيز البكتيريا.

يتم جمع القطع من كل تخفيف على أجار المغذي مع مضاد حيوي لاستعادة البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية بشكل انتقائي.

حضن الصفائح للسماح للبكتيريا الحية بالنمو لتصبح مستعمرات.

عد المستعمرات لتقدير عدد البكتيريا الحية لكل جرام من الأنسجة وقارن الأحمال البكتيرية في الأيثار والطحال.

أولا، ضع أنابيب دقيقة دائرية بسعة 2 مليلتر بقفل آمن وأسفل دائري، أضف 1 ملليلتر من PBS المعقمة وخرزة من الفولاذ المقاوم للصدأ معقم إلى كل أنبوب. قم بوزن الأنابيب مسبقا قبل جمع الأنسجة.

بعد القتل الرحيم للفئران، قم باستئصال الأنسجة الخلصية والأنسجة الطحالية، مع التأكد من جمع الأنسجة من الحيوانات الفردية في أنابيب منفصلة. وزن كل أنبوب لتحديد أوزان الأنسجة.

استخدم جهاز مطحنة الخلاط لتجانس الأنسجة عند 30 هرتز لمدة 15 دقيقة. ثم انقل 900 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر من كتلة 2 مليليتر ميغا بسعة 96 بئرا. تتكون 100 ميكرولتر من الأنسجة في البئر الأول، وتختلط جيدا.

قم بتخفيفات متسلسلة بإضافة 100 ميكرولتر إلى الآبار التالية، حتى يتم الحصول على تخفيف 10 إلى السالب السداس. ضع طبق 10 ميكرولتر من كل تخفيف على شكل ثلاث نسخ على أجار LB يحتوي على ستريبتوميسين. ثم عد متوسط وحدات تكوين المستعمرة وحدد وحدات تكوين المستعمرة لكل جرام من الأنسجة كما هو موضح في بروتوكول النص.