بمساعدة الحاسوب على نطاق واسع التصور النوعي والكمي لقداس جزيرة البنكرياس والتوزيع الحجم والعمارة

الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع بيانات تمثيلية غير متحيزة داخل عينة محدودة وتحليل البنية ثلاثية الأبعاد المعقدة للأنسجة بدقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق التقاط شرائح افتراضية من أقسام البنكرياس المناعية الملطخة كيميائيا. ثم يتم قياس الشرائح الافتراضية باستخدام ماكرو الشريحة الافتراضية IHC في برنامج الصورة J ، ويتم تحليل البيانات باستخدام البرامج النصية المكتوبة ل Mathematica.

بعد ذلك ، يتم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للشرائح الافتراضية باستخدام الصورة J ، وتتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في التقاط كومة من صور الجزر الفردية باستخدام برنامج كتاب الشرائح وتعيين مكدسات الصور يدويا في ثلاثة أبعاد باستخدام محقق ستيريو. في نهاية المطاف ، يمكن الحصول على بنية العيينة الدقيقة مع إحداثيات ثلاثية الأبعاد لكل خلية عيينة من خلال طريقة مشتركة للتصوير ثلاثي الأبعاد ورسم الخرائط اليدوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال دراسات السمنة والسكري مثل كيفية تأثير الظروف الفسيولوجية ومسار الحالات الفسيولوجية على البنكرياس وتوزيع ثقب كتلة خلايا بيتا والهندسة المعمارية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص أو علاج السمنة ومرض السكري التهاب الحباط لأن الفهم الأفضل للتغيرات في كتلة خلايا بيتا سيسهل تطوير وتقييم التدخلات العلاجية. على الرغم من أن الطرق الموضحة في الدراسة الحالية توفر على وجه التحديد نظرة ثاقبة للتحليل الكيميائي المناعي الديناميكي للبنكرياس يمكن أيضا تطبيقه على مجموعة من الكائنات الحية والأنسجة الأخرى. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات التحليل بمساعدة الكمبيوتر.

بسبب تعقيد تحليل مجموعات البيانات الكبيرة هذه في بعدين وثلاثة أبعاد. ابدأ هذا الإجراء بوضع شريحة نظيفة تحتوي على جزء كامل من البنكرياس المناعي الملطخ كيميائيا في حامل المجهر الفلوري. افتح برنامج محقق الاستريو وتصور العينة بالنقر فوق الاستحواذ.

ثم الصورة الحية. حدد مستويات التعريض الضوئي لكل قناة باستخدام نافذة الرسم البياني للفيديو، والتي تعرض شدة التألق. في هذا المثال، تستعمل القناة الثانية للقناة الخلفية الراديوية للقناة الراديوية المرئية (GP) الرابعة لطلب تقديم العروض، والقناة الخامسة للعلوم الخامسة، والقناة السادسة للاستكلام العلمي السابع.

باستخدام نافذة إعدادات الكاميرا ، اضبط مستوى التعريض الضوئي بحيث تنخفض شدة التألق. في الطرف الأيمن من الرسم البياني للفيديو ، يمكن تركيز الصورة باستخدام عجلة التركيز المجهرية. قبل إنشاء شريحة افتراضية ، حدد العينة بالنقر على الشاشة في نقطة بعيدة عن العينة ، والتي ستحدد نقطة مرجعية.

ثم انقر حول الخطوط العريضة للعينة عند اكتمال الكنتور. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد إغلاق كفاف لتوصيل نقطتي البداية والنهاية بمجرد إغلاق المحيط ، والتقط شريحة افتراضية للعينة عن طريق تحديد الاستحواذ ، ثم احصل على شريحة افتراضية. عند فتح خيارات نافذة الشريحة الظاهرية، حدد اكتساب عالي السرعة، بالإضافة إلى تعطيل يدوي.

التركيز البؤري عن طريق إلغاء تحديد المربع الموجود بجوار الدليل. احفظ الملف. قم بمعايرة الميزة الأولية بالنقر بزر الماوس الأيمن وتحديد إضافة إلى قائمة مواقع التركيز.

تركيز عدة أقسام عشوائية يدويا في معاينة الشريحة الظاهرية عند التركيز على العديد من المواقع، ابدأ الشريحة الظاهرية بالنقر بزر الماوس الأيمن وتحديدها. ابدأ الشريحة الافتراضية باستخدام prefo بعد اكتمال الشريحة الافتراضية للعينة الأولى ، وقم بالتبديل إلى القناة التالية واضبط التعريض وفقا لذلك. يتم تكرار هذا الإجراء لكل قناة لإجراء القياس الكمي للثقوب التي تعالج الصور باستخدام صورة J macro تسمى I-H-C-V-S ، والتي تعد أولا الصور المحملة للتحليل ثم تحدد ميزات الثقوب مثل التركيب الخلوي.

وحدات الماكرو I-H-C-V-S بتقسيم المكدس إلى قنوات الألوان الخاصة بها. في الصورة J يحول كل صورة إلى قناع أبيض وأسود ثمانية بت. بعد الكثافة التلقائية ، عتبة وإضافة صور القناة المنفصلة معا حسابيا في قناع مركب.

تحليل الجسيمات المدمج في الصورة J على الصورة المركبة بعد ذلك بتحديد مناطق الاهتمام أو عائد الاستثمار مع استبعاد الجسيمات الأصغر من خلية بيتا واحدة. التقدير الكمي لعائد الاستثمار. ينتج عن استخدام الصورة J جدول بيانات لمعلمات الخلية.

احفظ النتائج المجمعة في جدول بيانات Excel. تخزين البيانات مثل دائرية محيط المنطقة وقطر fer ومركز العيينة لكل ثقب ، جنبا إلى جنب مع الأرقام المقابلة الموضحة في الصورة. يمكن إجراء التحليل الحسابي لهذه المعلمات كما هو موضح في البروتوكول المكتوب للكشف عن المعلومات بما في ذلك توزيع الثقب وتحليل التردد ، قم بإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للشرائح الافتراضية عن طريق تشغيل برنامج نصي يحول جميع صورتي JP في الدليل إلى ملفات TIF ، وهو التنسيق المستخدم في بناء وقياس المداخن ثلاثية الأبعاد من الشرائح الافتراضية.

هنا ، يتم استخدام برنامج نصي يسمى I MJ two two tiff. انسخ البرنامج النصي إلى الدليل الذي يحتوي على صورتين JP. قم بتشغيل البرنامج النصي باستخدام غلاف Linux عن طريق كتابة الشرطة المائلة النقطية أنا JP اثنين اثنين من TIFF في وحدة التحكم ثم الضغط على enter.

عندما يتم تحويل جميع الصور الملتقطة من JP two إلى ملفات TIFF ، تكون جاهزة للاستخدام للتحليل في الصورة J. باستخدام الصورة J ، افتح جميع الصور للعينة الأولى ، والتي في هذه الحالة من بنكرياس جنين بشري ودمجها كواحدة عن طريق تحديد الصورة واللون ، ثم دمج القنوات. كرر هذه العملية لكل عينة عندما يتم دمج جميع العينات كصور واحدة. قم بتنظيف الصور عن طريق تحديد المناطق غير المرغوب فيها باستخدام أداة تحديد المضلع.

قم بتعبئتها عن طريق تحديد تحرير، ثم تعبئة. قم بتحويل كل صورة إلى صورة ملونة RGB. أخيرا ، قم بإنشاء كومة من الصور والتي يمكن بعدها محاذاتها بشكل أكبر مع المكون الإضافي stack reg.

في النهاية ، يؤدي دمج القنوات والجمع بين الصور إلى إنشاء مونتاج ثلاثي الأبعاد لجميع الثقوب في البنكرياس بأكمله. لجمع مكدسات الصور ، ضع ثقوب البنكرياس بأكملها تحت المجهر. ضع الماء في حالة استخدام عدسة موضوعية للغمر في الماء.

افتح برنامج دفتر الشرائح ، وقم بالوصول إلى التحكم في الالتقاط والتركيز بالضغط على التحكم بالإضافة إلى shift بالإضافة إلى E في نافذة التحكم في التركيز البؤري. اضبط الهدف على 20 مرة أو 40 مرة حسب حجم العيينة. لاستخدام عدسة المجهر لتحديد موقع الثقوب ، اضبط الحاوية على مرتين واضبط مجموعة المرشح على المستخدم واحد.

في نافذة التحكم في التركيز البؤري ، يجب ضبط تحديد الانبعاثات على 100٪ يجب ضبط العيون في الكثافة المحايدة على نقرة واحدة GFP ey ، ثم فتح الأرضية لتصور العينة في كتاب الشرائح ، والعودة إلى نافذة التحكم في التركيز وتعيين مرشح التبديل للإصلاح. ثم انقر فوق G-F-P-D-S. استخدم عصا التحكم لتوسيط الثقب في الكاميرا نافذة واحدة قدر الإمكان.

ركز على عمق في مكان ما بالقرب من مركز الثقب حيث يمكن تمييز الخلايا بسهولة. في نافذة التحكم في التركيز البؤري، حدد الانزلاق. استخدم عنصر التحكم في النطاق للتمرير إلى العمق العلوي للثقب حيث يمكن تمييز الميزات بوضوح، وانقر فوق فك المجموعة.

قم بالتمرير إلى أسفل الثقب وانقر فوق تعيين. انقر فوق go. للعودة إلى النقطة المرجعية في نافذة الالتقاط ، انقر فوق خيارات متقدمة ، ثم فوق وضع البديل إلى القناة.

اضبط عامل الحاوية على مرتين ونوع الالتقاط على 3D على الجانب الأيمن من النافذة ، وانقر فوق استخدام المواضع العلوية والسفلية وارجع إلى مستوى الصوت المركزي بعد الالتقاط. اضبط حجم الخطوة على ثلاثة. اضبط مجموعة المرشحات لتعيش أسفل مربع مجموعة عوامل التصفية.

حدد DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U و SCI five DSU. لكل منها، انقر فوق العثور على الأفضل ضمن ضبط التعريض الضوئي. ثم انقر فوق اختبار للتأكد من أن التعريض الضوئي المحدد مناسب.

انقر فوق ابدأ لبدء الالتقاط. عند اكتمال الالتقاط ، اضبط المستويات حسب الضرورة وقم بتغيير اللون المعروض لطلب تقديم العروض إلى اللون الأبيض. احفظ الشريحة وانتقل إلى عرض تصدير سلسلة TIFF.

اكتب اسم الشريحة مع شرطة في النهاية واحفظها. يتم إنشاء العشرات من ملفات TIF الفردية ، لذلك قد يكون من المفيد الاحتفاظ بكل مكدس صور ثقوب في مجلد منفصل. لتعيين مكدسات الصور، افتح برنامج محقق الاستريو.

تصور الصورة عن طريق فتح مكدسات الصور في قائمة تغيير حجم الصورة. اضبط المسافة بين الصور على ثلاثة ميكرون لتصحيحها مرتين من الانحناء. في دفتر الشرائح، حدد تجاوز تغيير حجم X وY واستخدم تحجيم محدد لمصدر x وY.

أدخل 0.65 لكل من مركز X و Y وقم بتكبير الصورة بالنقر فوق زر التكبير ، ثم في منتصف ilis محل الاهتمام في سوق النوافذ الماكرو خلية واحدة على الأقل. باستخدام علامة البيتا المناسبة ، ستظهر خلايا بيتا باللون الأخضر. ستظهر خلايا ألفا باللون الأحمر وستظهر خلايا دلتا باللون الأبيض.

ضع علامة على الخلايا الموجودة في وسط نواتها ، والتي ستظهر باللون الأزرق إذا كانت العينة ملطخة ب DPI استخدم العلامة الثانية لتمييز خلايا بيتا. علامة خمسة لتمييز خلايا ألفا ، وعلامة ستة لتمييز خلايا دلتا. بمجرد وضع علامة على خلية واحدة على الأقل ، اعرض العرض المتعامد باستخدام الرمز الموجود في القائمة العلوية ، وتحقق من مرشح Z والمتناظر.

يجب ضبط النطاق على 15.00. بدءا من 0.0 Z.قم بالتمرير عبر الثقوب باستخدام عجلة الماوس وقم بتمييز كل خلية بعلامة مناسبة ، ضع علامة على كل خلية مرة واحدة فقط في وسط عمقها. عند الانتهاء من وضع علامة على كل مستوى من مستويات Z، يمكن إلغاء تحديد خانة الاختيار مرشح Z.

سيظهر هذا جميع العلامات من جميع مستويات Z. عندما يتم وضع علامة على كل خلية ، احفظ الملف كملف DOT. ثم انتقل إلى تتبع تصدير الملفات.

احفظ التتبع كملف TXT. أخيرا ، انقر فوق ملف بيانات جديد لمسح مساحة العمل قبل محاولة تعيين ثقوب جديدة. يسمح تحضير الشرائح الافتراضية من عينة البنكرياس الملطخة باللون الكيميائي المناعي بفحص خلايا الغدد الصماء ألفا وبيتا ودلتا في البنكرياس بأكمله معا حيث يمكن رؤية الجزر الصغيرة التلوين الكيميائي المناعي للأنسولين باللون الأخضر ، والجلوكاجون باللون الأحمر ، والسوماتوستاتين باللون الأبيض ، والداب باللون الأزرق.

ثم يتم تحويل الصور إلى قناع ثمانية بتات بعد العتبة التلقائية. تظهر هنا صورة الدمج المركبة. ومع ذلك ، فإن توزيع الثقب باستخدام الشريحة الافتراضية يتيح أيضا التحليل الفردي في قنوات منفصلة.

هنا ، تظهر مشاهد كل قناة لتكشف عن خلايا دلتا وخلايا بيتا وخلايا ألفا. تحليل الجسيمات مع إجراؤه على قناع مركب يظهر كل هيكل عيينة مرقمة ومظللة باللون الأزرق. يتم إخراج تحليل الجسيمات للأقنعة المركبة كجدول بيانات يحتوي على معلمات مثل دائرية محيط منطقة جزر الجزر وقطر مختلف لكل ثقب تم اكتشافه ، والتي تحتوي على معرفات تتوافق مع العلامات المرقمة على القناع المركب.

عن التحليل الواسع النطاق لهذه الصور إنتاج الرسوم البيانية لتوزيع الثقوب والحجم الإجمالي ، بالإضافة إلى مقارنات مفصلة لمناطق خلايا ألفا وبيتا ودلتا. يمكن أن يكشف رسم خرائط الثقب والتحليل الرياضي للتكوين الخلوي والهندسة المعمارية عن مستوى بؤري واحد من كومة ثلاثية الأبعاد من الصور المعاد بناؤها لثقوب بشرية تم تحميلها في محقق ستيريو. هنا ، توجد خلايا بيتا في خلايا ألفا الخضراء في خلايا دلتا الحمراء باللون الأبيض والنوى باللون الأزرق.

بعد التقاط ثقوب مميزة ، يتم تمييز خلايا ألفا وبيتا ودلتا في طائرات بحرية مختلفة هنا ، ويتم عرض صور الفلورسنت وبيانات الخرائط المقابلة لثلاثة مستويات بؤرية مختلفة بفاصل 10 ميكرون. بمجرد تمييز خلايا ألفا وبيتا ودلتا على مستويات مختلفة ، يمكن تصور العيينة ثلاثية الأبعاد. يظهر هنا إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للعيينة المقطعة إلى ربع بناء على الإحداثيات التي تم الحصول عليها عن طريق رسم خرائط العيينة.

علاوة على ذلك ، يمكن للتحليل الرياضي الآلي للثقوب المعينة عرض التركيب الخلوي والهندسة المعمارية. هنا ، يظهر التردد النسبي لمسافات خلايا الخلية بين خليتين في مجموعة خلية واحدة. يظهر أيضا التردد النسبي لمسافات خلايا الخلية بين مجموعتين مختلفتين من الخلايا.

تظهر أيضا الاحتمالات التراكمية لتوزيعات المسافة بين الخلية والخلية لخلايا ألفا إلى ألفا وبيتا إلى بيتا ومن دلتا إلى خلايا دلتا. يمكن إجراء اختبار cole OV smirnov أو KS على هذه الاحتمالات للحصول على مسافات KS المقابلة. بمجرد إتقان التصوير والتحليل على نطاق واسع لقسم كامل من الأنسجة ، يمكن إجراؤه في أربع ساعات.

يمكن إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لكتلة من الأنسجة في 30 دقيقة. أخيرا ، يمكن إكمال التصوير ثلاثي الأبعاد ورسم الخرائط اليدوية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تبدأ بتلوين كيميائي مناعي عالي الجودة للأقسام.

ستعتمد دقة التحليل اللاحق على البيانات الأولية. تأكد أيضا من أن أجهزة الكمبيوتر الخاصة بك تحتوي على ما لا يقل عن ثمانية غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي لمعالجة مثل هذا التحليل على نطاق واسع بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين ، ليس فقط في مجال السمنة والسكري ، ولكن على نطاق واسع في العديد من المجالات الأخرى التي تستخدم التحليل المرضي القياسي.

قد يكون مفيدا بشكل خاص عندما يكون توافر العينات محدودا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع البيانات التمثيلية غير المتحيزة ضمن حجم عينة محدود باستخدام التقنيات القياسية. قد لا يمثل اختيار منطقة معينة فقط الصورة بأكملها ، كما أوضحنا باستخدام دراسة توزيع ثقب البنكرياس.